一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法和应用

1.本发明涉及载药纳米微粒技术领域，具体涉及一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法和应用。


背景技术：

2.酪蛋白是一种在等电点可自组装为纳米粒的特殊蛋白质，其特殊的结构，可以被看做是由疏水氨基酸及亲水氨基酸共同组成的两亲性嵌段型共聚物。基于此特性酪蛋白可以在溶液中较易自组装形成胶束，形成性能优异、形态均一的纳米粒。同时，酪蛋白易被生物酶水解，并参与生物体的新陈代谢，有利于负载药物的释放。
3.姜黄素(curcumin)是一种提取自姜科植物姜黄的根茎的一类多酚类化合物，颜色为橙黄色并且呈现出结晶状。据研究表明，姜黄素的药理性广泛、毒性小、不良作用小且抗癌抗肿瘤、抗炎、抗氧化效果较为明显。但是姜黄素也有一定的局限性，如在水中溶解性低、稳定性差以及口服利用率较差，致使姜黄素在药物研究的发展中受限较大。
4.纳米载药微粒通过化学键合或者物理吸附的方式结合药物，使之分散于纳米微粒的内部或者表面。可食用蛋白作为药物载体构成的给药系统成为如今的药物开发的新思路与新方向，是推动药物研究的强大催化剂。这种载药载体以自组装(即修饰高分子活性较高的基团后通过非共价键相互作用自发组成纳米粒)的方式形成，粒径的范围在10-1000nm之间，这种由可食用蛋白构成的纳米载体在药物制剂的发展中一直以药用辅料的身份占据重要地位。目前，作为纳米载体使用居多的可食用蛋白质当属酪蛋白。但是目前采用酪蛋白制备纳米微粒多采用多种原料载体，易增强纳米粒毒性，并且反应条件较高，不利于发挥酪蛋白本身的结构特性。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为解决上述技术问题及不足，提供一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法和应用。
6.本发明为解决上述技术问题的不足，所采用的技术方案是：一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
7.s1、将酪蛋白粉末置于蒸馏水中溶解完全，得到酪蛋白样品溶液，备用；
8.s2、将s1中得到的酪蛋白样品溶液用naoh溶液调节ph，备用；
9.s3、向s2得到的溶液中加入姜黄素，然后采用磁力搅拌器搅拌，形成包裹姜黄素的酪蛋白溶液，备用；
10.s4、使用超声波细胞破碎仪对s3中得到包载姜黄素的酪蛋白溶液进行超声破碎，超声破碎处理过程中采用降温处理，超声破碎完成即得到酪蛋白-姜黄素载药纳米粒。
11.作为本发明一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法的进一步优化，s1中将20-40mg所述酪蛋白粉末溶解于10ml的蒸馏水中。
12.作为本发明一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法的进一步优化，s2中所述
naoh溶液的浓度为1m，并将酪蛋白样品溶液的ph调节至5～5.5。
13.作为本发明一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法的进一步优化，s3中加入所述姜黄素的重量为800μg-1.2mg。
14.作为本发明一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法的进一步优化，s3中磁力搅拌时间为24h。
15.作为本发明一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法的进一步优化，s4中超声波细胞破碎仪的工作功率为200-400w，工作时间为10-30min，并且工作频率为每工作4s停2s。
16.作为本发明一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法的进一步优化，s4中所述的降温处理为利用碎冰进行降温。
17.一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒，采用上述方法制备得到。
18.上述酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的包载率为90％-95％。
19.上述酪蛋白-姜黄素载药纳米粒在提高姜黄素杀瘤作用效果中的应用。
20.本发明具有以下有益效果：
21.一、本发明利用酪蛋白在等电点可以自组装的特性，调节ph使其自组装形成纳米粒，最大程度上保证了酪蛋白的特性；本发明仅使用酪蛋白制备纳米粒，不添加其他原料，具有安全、营养、低成本的优势，并且单一的原料充分避免了由于多种原料产生副反应增强纳米粒毒性的现象。本发明制备方法简单，技术工艺合理、易于操作，对设备无特殊要求，简单的制备过程充分保证了酪蛋白本身的结构特征，更加有利于其发挥出酪蛋白的特性；且本发明制备条件温和，最大程度上保证了酪蛋白的良好特性。
22.二、本发明采用超声处理能够增加分子间的表面活性、降低表观粘度，改变蛋白质二级结构，可增加酪蛋白蛋白的表面疏水性，使酪蛋白的结构伸展、分子间相互作用有所降低，改善溶解性。
23.三、本发明制备得到的酪蛋白载药纳米粒容易被微绒毛捕获并粘附到粘膜上，可以延长载体的滞留时间而促进吸收，可以在保证姜黄素分散良好、稳定性佳的前提下实现姜黄素的递送，从而提高姜黄素的利用率，减少给药量的损失，生物利用度为60％-65％，从而突破姜黄素的局限性，为癌症治疗提供一种新的思路和方法。
附图说明
24.图1为本发明实施例1的酪蛋白-姜黄素载药纳米粒(cc-nps)的透射电子显微图；
25.图2为本发明实施例1制备的酪蛋白-姜黄素纳米粒在4℃贮藏下载药纳米粒30天的粒径分布图；
26.图3为本发明酪蛋白-姜黄素纳米粒的细胞摄取实验图像；
27.图4为不同时间不同浓度的姜黄素对hela细胞的抑制作用图；
28.图5为不同时间不同浓度的cc-nps对hela细胞的抑制作用图；
29.图6为游离姜黄素和酪蛋白-姜黄素纳米粒生物利用度的对比图；
30.图7为酪蛋白自组装纳米粒效果验证实验中cs-nps的制备流程；
31.图8为cs-nps透射电子显微镜图；
32.图9为不同浓度的酪蛋白样品制成载药纳米粒平均粒径和分散系数(pdi)的对比
结果图；
33.图10为不同浓度酪蛋白溶液经不同时间的超声处理后测得的表面疏水性指数变化图；
34.图11为不同浓度cs-nps对hela细胞的毒性检测结果图。
具体实施方式
35.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
36.实施例中使用到的药品及试剂明细如下表1：
37.实施例中使用的试验设备明细如下表2：实施例1
38.一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
39.s1、将20mg酪蛋白粉末置于10ml蒸馏水中溶解完全，得到酪蛋白样品溶液，备用；
40.s2、将s1中得到的酪蛋白样品溶液用浓度为1m的naoh溶液调节ph至5～5.5，备用；
41.s3、向s2得到的溶液中加入姜黄素800μg，然后采用磁力搅拌器搅拌24h，形成包裹姜黄素的酪蛋白溶液，备用；
42.s4、使用超声波细胞破碎仪对s3中得到包载姜黄素的酪蛋白溶液进行超声破碎，超声波细胞破碎仪的工作功率为200w，工作时间为10min，且工作频率为每工作4s停2s，超声破碎处理过程中采用碎冰降温处理，超声破碎完成即得到酪蛋白-姜黄素载药纳米粒(cc-nps)。
43.取本实施例制备得到的酪蛋白-姜黄素载药纳米粒(cc-nps)透射电子显微图，如图1所示，本实施例制备得到的酪蛋白-姜黄素纳米颗粒大小较均一，形状呈球形，酪蛋白-姜黄素纳米颗粒直径在260nm左右。
44.采用上述制备方法制备得到的酪蛋白-姜黄素载药纳米粒，所述酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的包载率为95％。实施例2
45.一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
46.s1、将30mg酪蛋白粉末置于10ml蒸馏水中溶解完全，得到酪蛋白样品溶液，备用；
47.s2、将s1中得到的酪蛋白样品溶液用浓度为1m的naoh溶液调节ph至5～5.5，备用；
48.s3、向s2得到的溶液中加入姜黄素1.0mg，然后采用磁力搅拌器搅拌24h，形成包裹姜黄素的酪蛋白溶液，备用；
49.s4、使用超声波细胞破碎仪对s3中得到包载姜黄素的酪蛋白溶液进行超声破碎，超声波细胞破碎仪的工作功率为300w，工作时间为20min，且工作频率为每工作4s停2s，超声破碎处理过程中采用碎冰降温处理，超声破碎完成即得到酪蛋白-姜黄素载药纳米粒。
50.采用上述制备方法制备得到的酪蛋白-姜黄素载药纳米粒，所述酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的包载率为93％。实施例3
51.一种酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
52.s1、将40mg酪蛋白粉末置于10ml蒸馏水中溶解完全，得到酪蛋白样品溶液，备用；
53.s2、将s1中得到的酪蛋白样品溶液用浓度为1m的naoh溶液调节ph至5～5.5，备用；
54.s3、向s2得到的溶液中加入姜黄素1.2mg，然后采用磁力搅拌器搅拌24h，形成包裹姜黄素的酪蛋白溶液，备用；
55.s4、使用超声波细胞破碎仪对s3中得到包载姜黄素的酪蛋白溶液进行超声破碎，超声波细胞破碎仪的工作功率为400w，工作时间为10min，且工作频率为每工作4s停2s，超声破碎处理过程中采用碎冰降温处理，超声破碎完成即得到酪蛋白-姜黄素载药纳米粒。
56.采用上述制备方法制备得到的酪蛋白-姜黄素载药纳米粒，所述酪蛋白-姜黄素载药纳米粒的包载率为90.8％。
57.实施例效果数据
58.一、姜黄素包封率和载药量测定
59.取实施例1制备得到的酪蛋白-姜黄素纳米粒。将新鲜制得的酪蛋白-姜黄素纳米粒放置于-20℃低温冰箱中过夜预冻，然后迅速放入冻干机中冻干，得到冻干粉末状样品。
称取适量冻干后的姜黄素纳米粒粉末，加入2ml无水乙醇涡旋洗涤未包裹在纳米粒中的游离姜黄素，然后在2000r下离心10min，取出上清液。用上述同样的方法对离心后的纳米粒沉淀物再次洗涤，反复三次，将洗涤离心后的上清液合并。计算得到游离姜黄素的质量，并通过下面的公式计算纳米粒体系对姜黄素的包封率和载药量：
[0060][0061]
结果如下：
[0062]
酪蛋白纳米粒对姜黄素的包封率可以达到90％，表明可以实现对姜黄素的高效包封载，更有利于提高姜黄素的水溶解度，提高姜黄素的稳定性。
[0063]
二、4℃储存稳定性和胃肠ph稳定性
[0064]
将酪蛋白-姜黄素纳米溶液储存在4℃冰箱中，每隔一段时间观察样品是否出现沉淀，用紫外-可见光分光光度计度450nm处测定样品的浊度，并使用粒度仪检测粒径大小和分布。另外，每隔一段时间取样测定姜黄素的含量。
[0065]
配制不加酶的ph＝1.5的模拟胃液和ph＝7.4的模拟肠液，将酪蛋白纳米粒与模拟肠液和模拟胃液等体积混合，用激光粒度仪测定样品的粒度大小及分布。
[0066]
结果如下：
[0067]
将载药纳米溶液在4℃放置，每隔一段时间测量粒径。如图2所示，在30天的储存时间内未出现明显沉淀，载药纳米粒的粒径基本保持稳定，表明载药纳米粒良好的储存稳定性，显示了载药纳米粒较高的实际应用价值。
[0068]
载药纳米粒在胃肠ph环境下的粒径变化，载药纳米粒进入胃ph值环境后，粒径由260.2nm增大到了268.9nm，基本保持稳定，图中显示粒度分布较窄。而当纳米粒进入肠ph值环境后测得的纳米粒平均粒径为354.5nm，将图中胃肠ph值环境下的粒径分布图进行比较可以看出，载药纳米粒在胃中的稳定性高于在肠中的稳定性。
[0069]
三、酪蛋白-姜黄素纳米粒溶解性实验
[0070]
将一定量的酪蛋白-姜黄素纳米粒冻干粉复溶解在蒸馏水中，并计算重新溶解后纳米粒的浓度来计算酪蛋白-姜黄素纳米颗粒的溶解度。
[0071]
结果如下：
[0072]
酪蛋白-姜黄素纳米粒溶解度可以达到0.2-0.5mg/ml，可证明酪蛋白-姜黄素纳米粒有良好的的溶解性，由于极大的溶解度可以提高姜黄素的生物利用率。
[0073]
四、细胞摄取实验
[0074]
依据实施例1在制备酪蛋白-姜黄素时加入异硫氰基荧光素(fluorescein isothiocyanate,fitc)，制备被荧光素所标记的标记酪蛋白-姜黄素纳米粒。
[0075]
将hela细胞培养在细胞板(96孔板)中，5％co2、37℃培养箱中培养，当80％的细胞贴壁后移除培养液，加入fitc标记的酪蛋白-姜黄素纳米粒，仍然将其置于培养箱中培养。然后在培养4h完成后，利用荧光显微镜下观察酪蛋白-姜黄素纳米粒摄取情况。
[0076]
结果如下：
[0077]
如图3可观察到有明显的荧光出现，可证明细胞对此纳米粒进行了摄取，且摄取情况良好。
[0078]
五、姜黄素对肿瘤细胞的体外抑制作用
[0079]
将hela细胞培养在细胞板(96孔板)中，在37℃，5％co2培养箱中培养，当80％的细胞贴壁后移除培养液，分别加入浓度为40μg/ml、80μg/ml、120μg/ml的姜黄素样品，每个浓度设置6个平行孔，并且根据实验情况将96孔板周边添加单纯培养液做为对照组，仍然将其置于培养箱中培养(培养条件不变)。然后在培养24h完成后，利用倒置显微镜观察并拍照以备后续对比；紧接着在超净工作台中吸出每一孔的上清液，加入20μl的mtt(质量浓度应为5mg/ml)，继续在自然条件下培养4h，吸出原培养液，将配置好的dmso(dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜)加入到每孔中，加入的量固定为150μl，加入后需振荡，并参照以下公式计算细胞存活率。
[0080]
cell viability(％)＝ods/odc
×
100％
[0081]
将对照组和实验组在490nm波长处的吸光度值表示为odc和ods。
[0082]
结果如下：
[0083]
实验结果表明，姜黄素浓度的升高和死亡的细胞数量增加有着同样的趋势，当给药浓度增加到80μg/ml，在24h内肿瘤细胞存活率急剧下降，至120μg/ml时，细胞几乎全部死亡，说明姜黄素的浓度越高，对肿瘤细胞的杀伤力越大(见附图4)。
[0084]
六、cc-nps对肿瘤细胞的抑制作用，即所述酪蛋白-姜黄素载药纳米粒在提高姜黄素杀瘤作用效果中的应用。
[0085]
用mtt比色法考察cc-nps纳米粒对体外肿瘤细胞生长情况的抑制程度。使用96孔板培养hela细胞至贴壁，移除培养液，加入cc-nps溶液，置于培养箱中(培养箱的条件设定为37℃，5％co2)培养时间为24h、48h。通过酶标仪测定波长490nm的od值，并计算肿瘤细胞的相对存活率。
[0086]
结果如下：
[0087]
在同样的浓度下，cc-nps相较于姜黄素对细胞的杀伤力更强，经过培养48h后，细胞的存活率极低。说明此载药纳米粒有缓释作用，随着时间的增加对癌细胞的抑制效果也逐渐增加(附图5)。
[0088]
七、细胞跨膜转运实验
[0089]
采用hela单层细胞模型研究姜黄素-酪蛋白纳米分散液单层细胞跨膜转运情况。
[0090]
为了模拟小肠的酸性环境，使用上室ph6.5和下室ph7.4。分别用0.5ml细胞悬液和1.5ml完全培养基填充上室和下室。hela细胞板在37℃的湿度为5％的co2的环境中培养过夜。不贴壁的细胞悬浊液，再开始转运前1h进行换液，加入1ml，20mg/ml游离姜黄素溶液和姜黄素纳米体系加到上室作为供给池，同时下室加入1.5ml的完全培养基作为接收池，每组设3个重复，于37℃、5％co2培养箱中培养，每次转运间隔2小时。转运研究后，用pbs清洗两次上室，在激发光425nm，发射光518nm波长下测荧光强度，并通过下面的公式计算得到姜黄素在细胞水平的生物利用度。
[0091][0092]
结果如下：
[0093]
从图6中可以看出，酪蛋白负载姜黄素制成的纳米粒生物利用度要高于游离的姜
黄素生物利用度，进一步证明了本发明制备的酪蛋白-姜黄素纳米粒采用超声技术制备了生物利用度较高的纳米载药体系。——酪蛋白自组装纳米粒效果验证实验
[0094]
一种酪蛋白自组装纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
[0095]
s1：分别称取20mg、30mg、40mg酪蛋白粉末完全溶解于10ml蒸馏水中，分别配置成2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml的酪蛋白溶液。
[0096]
s2:用1m的naoh溶液调节酪蛋白溶液的ph值至ph5-5.5左右。
[0097]
s3：使用超声波细胞破碎仪对酪蛋白溶液进行超声破碎，需要利用碎冰降温，调节工作功率至200w，工作时间为30min(工作4s，停2s)，即得到由酪蛋白自组装形成的纳米粒(cs-nps)。
[0098]
结果如下：
[0099]
如图7所示：cs-nps的制备流程
[0100]
可明显观察到：超声处理后的酪蛋白溶液和超声处理前溶液的颜色出现了由澄清到乳白色的明显变化。
[0101]
如图8所示：cs-nps的透射电子显微镜图：酪蛋白溶液在超声前与在超声后的状态有明显的改变，并且发现绝大多数酪蛋白聚集成了球形颗粒，在超声波的剪切和分散作用下酪蛋白颗粒的大小和分布更均一。
[0102]
一、对本实验制备得到的纳米粒进行平均粒径、分散系数的测定，结果如下表3所示：
[0103]
由上表可以看出：三种纳米粒的平均粒径分别为251.8
±
5.63nm、372.9
±
4.15nm和468
±
5.25nm，分散指数依次为0.221、0.323和0.415。不同浓度的酪蛋白样品制成载药纳米粒平均粒径和分散系数(pdi)的对比结果图，如图9所示。由图9和表3可以看出：随着浓度的增加，cs-nps的平均粒径在不断增大，粒径的分散系数也在不断地增大。
[0104]
综上所述，三种纳米微粒粒径在240-470nm之间，分散较均一，体系稳定良好。
[0105]
二、对比超声波前后酪蛋白自组装纳米粒的形成
[0106]
考察超声功率对形成纳米粒粒径的影响，固定ph值为5.3，溶液浓度为2mg/ml，考察无超声操作和超声功率为200w时得到的纳米粒的粒径。超声前后酪蛋白溶液粒径和分布系数变化如下表4所示：
[0107]
表4：超声前后酪蛋白溶液粒径和分布系数变化
[0108]
由表4可知：
[0109]
酪蛋白溶液的ph值接近等电点时，一些酪蛋白分子开始聚集，形成了细小的絮状聚集物，使粒径较大，超声使聚集物分散开，并参与了溶液中酪蛋白分子的组装。超声后酪蛋白纳米粒的分布系数减小说明通过超声处理后溶液中纳米粒的粒径更为均匀。超声后的粒径数值比超声前粒径有所减小。
[0110]
三、酪蛋白纳米表面疏水性测量
[0111]
应用荧光探针测量酪蛋白纳米微团分散液的表面疏水性。将酪蛋白纳米微团分散液用超纯水稀释成五个浓度梯度(0.0025％到0.02％)。配制8mm ans溶液溶于10mm pbs中，ph7.2，吸取0.04ml配置好ans溶液加入到5ml稀释好的样品中。通过荧光光度计来测量相对荧光强度。设置激发波长365nm、发射波长484nm。表面疏水性指数等于相对荧光强度与蛋白质浓度的初始斜率。
[0112]
结果如下：
[0113]
图10是不同浓度酪蛋白溶液经不同时间的超声处理后测得的表面疏水性指数变化。结果表明，低浓度的蛋白溶液(20mg/ml)，在超声处理5min后，表面疏水性显著降低，但进一步的超声处理，疏水性变化趋于平缓。超声使酪蛋白纳米微团粒径显著减小，比表面积增加，然而表面疏水性不升反降。这种现象说明，超声处理并非简单的使大的酪蛋白微团分裂，而是使酪蛋白纳米簇进行了重新的组装而形成新的纳米微团，新形成的纳米微团的内部聚集了疏水基团，而表层的疏水基团大大减少。但蛋白浓度增高，5min超声处理后纳米微团的表面疏水性指数下降愈来愈不明显，可能是因为蛋白浓度高时，纳米簇自发形成的纳米微团本来就是通过疏水性聚集形成的纳米微团。因为，高浓度下，疏水性聚集更容易发生。
[0114]
四、酪蛋白纳米粒子的细胞毒性实验
[0115]
1.细胞的培养
[0116]
hela细胞，在含有10％小牛血清的dmem高糖培养液(含有100u/ml青霉素与链霉素)37℃、5％co2，孵箱中培养。隔天换液，隔3-4天用胰酶消化传代。
[0117]
2.cs-nps毒性实验
[0118]
首先调整培养至对数生长期的hela细胞的浓度为4000个/ml，接种200μl到96孔中，将接种好的96孔培养板置于培养箱中培养(培养箱的条件设定为37℃，5％co2)，当孔板中贴壁生长的细胞占80％时，将孔板中的培养液移除，随后分别加入cs-nps浓度为(样品1)100μg/ml、(样品2)200μg/ml、(样品3)400μg/ml和(样品4)600μg/ml的培养液。每个浓度设置6个平行孔，并且根据实验情况将96孔板周边添加单纯培养液做为对照组，仍然将其置于培养箱中培养(培养条件不变)。然后在培养24h完成后，利用倒置显微镜观察并拍照以备后续对比；紧接着在超净工作台中吸出每一孔的上清液，加入20μl的mtt(质量浓度应为5mg/ml)，继续在自然条件下培养4h，吸出原培养液，将配置好的dmso(dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜)加入到每孔中，加入的量固定为150μl，加入后需振荡，并参照以下公式计算细胞存活率。
[0119]
cell viability(％)＝ods/odc
×
100％
[0120]
将对照组和实验组在490nm波长处的吸光度值表示为odc和ods。
[0121]
从实验结果来看，可以看出经过24小时培养后，不同浓度的cs-nps下的细胞生存
率较高，无明显的细胞死亡，观测实验结果初步表明：酪蛋白无显著的细胞毒性，单一的酪蛋白原材料从根本上保证了纳米粒的安全性和可靠性。(如附图11)。
[0122]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。