一种含平卧菊三七提取物的组合物及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及中药提取技术领域，尤其涉及一种含平卧菊三七提取物的组合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.过敏反应大致分为致敏、激发和效应阶段三个阶段。致敏期间淋巴细胞产生的抗体与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面结合使机体致敏。当过敏原再次进入机体时，会与致敏的肥大细胞或嗜碱性粒细胞的表面抗体结合，促使其释放组胺等生物活性介质，作用于效应组织和器官的组胺受体，引起局部或全身的过敏反应，如平滑肌收缩、毛细血管扩大和通透性增强以及腺体分泌物增多等。近年来，过敏性疾病具有逐年增加的趋势，已成为人们关注的社会现象。常见的过敏性鼻炎、支气管哮喘及荨麻疹等属于ⅰ型过敏反应。对过敏性疾病的治疗，以消除过敏源为本，并通过使用抗组胺药物及抑制肥大细胞释放化学递质的药物进行预防、缓解或脱敏治疗。但是，抗组胺类药物在临床使用中有一定的副作用，常出现瞌睡、口渴、胃肠消化系统受损等。因此，抑制肥大细胞释放组胺是抑制过敏反应的有效手段，对此开发安全性高和有效性好的中药成分用于缓解或治疗组胺释放相关的皮肤过敏症状具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种含平卧菊三七提取物的组合物及其制备方法与应用，所述组合物可以抑制肥大细胞释放组胺，还可以提高磷酸组胺所致瘙痒的致痒阈值，提高机体对组胺的耐受力。
4.为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种含平卧菊三七提取物的组合物，所述组合物的制备原料包含平卧菊三七、酸角壳、西红花和肉桂。
5.平卧菊三七(学名：gynura procumbens(lour.)merr.)又名蛇接骨、神仙草、石三七等，为菊科三七属，多年生草本植物，生息于我国广东、海南、贵州及云南等南部与西南部广阔地区，越南、泰国及印度尼西亚等东南亚各国及非洲部分地区也有分布。平卧菊三七根茎是中成药的原材料，其茎叶营养丰富，在东南亚食用历史悠久，在我国于2012年被国家卫生部批准为普通食品。民间常利用平卧菊三七通经活络、消肿止痛、消炎止咳，临床上常用于改善和治疗跌打损伤，支气管肺炎及肺结核等疾病。近代药理学研究表明平卧菊三七具有消炎、抗癌、抗病毒、降压、降糖、降脂、抗氧化及抗溃疡等诸多功效。另一方面，该植物也具有较好的营养价值。因此，平卧菊三七可广泛应用于食品、保健食品及医药工业等领域，是一种极具潜力和高经济价值的植物资源之一。酸角壳具有降血脂、α-糖苷酶抑制、降低糖化血红蛋白的作用。西红花具有保护肝脏、抗血栓、保护心肌损伤等功能。肉桂具有改善糖尿病、抑菌、抗氧化和免疫调节等生物活性。以上述四种成分复配制备的组合物可协同作用，提升对肥大细胞释放组胺的抑制作用，提高机体对组胺的耐受力。
6.优选地，所述含平卧菊三七提取物的组合物包含如下重量份的制备原料：平卧菊
三七50～70份、酸角壳10～15份、西红花5～10份和肉桂2～5份。以上述配比制备的组合物对组胺释放的抑制率可达40％以上。
7.进一步优选地，所述含平卧菊三七提取物的组合物包含如下重量份的制备原料：平卧菊三七65份、酸角壳12份、西红花8份和肉桂4份。当四者的配比符合上述限定时，组胺释放抑制率可达52.3
±
2.81％。
8.此外，本发明还提供了一种含平卧菊三七提取物的组合物的制备方法，所述制备方法为：将平卧菊三七、酸角壳、西红花和肉桂混合均匀，干燥、粉碎，将粉末加入溶剂中，加热回流提取2～4次，合并提取液，抽滤，将滤液旋干，得到所述含平卧菊三七提取物的组合物。
9.优选地，所述溶剂为水、甲醇、乙醇、丙酮中的至少一种。鉴于平卧菊三七提取物是以食品饮料、药剂或化妆品、护肤品作为最终产品开发形式，从安全性角度考虑提取溶剂优选为水、乙醇中的至少一种。
10.优选地，所述溶剂的用量为粉末的15～25倍；所述加热回流的温度为60～100℃，每次提取的时间为0.5～1.5h，抽滤使用的滤膜的孔径为30～50μm。采用上述条件可以最大程度地提取平卧菊三七、酸角壳、西红花和肉桂中的活性成分。
11.同时，本发明还提供了一种所述的含平卧菊三七提取物的组合物在食品饮料、药物、化妆品、护肤品领域的应用。
12.本发明还公开了一种抑制组胺释放的药物，所述药物包含含平卧菊三七提取物的组合物，还包含赋形剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂中的至少一种。
13.相比于现有技术，本发明的有益效果为：本发明通过对天然植物的种类进行选择，并通过实验证实了，含平卧菊三七提取物的组合物能够预防和缓解组胺的释放及相关过敏症状，提升机体对磷酸组胺致痒的阈值，有利于易敏体质人群的脱敏治疗，并且可以长期服用、安全、无副作用。
具体实施方式
14.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
15.实施例1～12
16.本发明所述含平卧菊三七提取物的组合物的实施例，实施例1～12所述含平卧菊三七提取物的组合物的制备原料如表1所示，制备方法为：将平卧菊三七、酸角壳、西红花、肉桂混合均匀，干燥、粉碎，将粉末加入20倍质量的超纯水中，加热回流提取3次，温度为60～100℃，每次1h，合并提取物，使用中速定性滤纸(孔径为30～50μm)抽滤，将滤液旋干，得到所述含平卧菊三七提取物的组合物。
17.对比例1～5
18.对比例1为平卧菊三七提取物；对比例2与实施例9的区别在于制备原料不含肉桂；对比例3与实施例9的区别在于制备原料不含酸角壳；对比例4与实施例9的区别在于制备原料不含西红花；对比例5与实施例9的区别在于制备原料不含平卧菊三七；对比例1～5的制备方法与实施例1～12相同。
19.表1(重量份)
20.项目平卧菊三七酸角壳西红花肉桂实施例1501052实施例2601052实施例3651052实施例4701052实施例5651252实施例6651552实施例7651282实施例86512102实施例9651284实施例10651285实施例11751032实施例125018152
21.性能测试
22.1、测试实施例1～12和对比例1～5对肥大细胞释放组胺的抑制效果
23.将7周龄sd雄性大鼠麻醉放血致死后，并向大鼠腹腔内注射50ml预冷的mcm注射液(mcm液组成为：150mm nacl，3.7mm kcl，3mm na2hpo4，5.6mm葡萄糖，0.1wt.％牛血清白蛋白，0.1wt.％明胶，ph 6.8)，轻轻揉动大鼠腹部3分钟后，收集腹腔内含有肥大细胞的mcm液。然后4℃、600rpm离心5分钟，回收肥大细胞。再添加35ml mcm，在600rpm、4℃条件下离心5分钟。将肥大细胞用mcm液稀释配成1
×
105/ml细胞悬液。
24.测定组胺释放抑制活性的具体步骤如下：取500μl肥大细胞悬液，在37℃孵化培养5分钟后，加入4μl 250mm氯化钙溶液。继续在37℃孵育5分钟后加入5μl供试样品(浓度为1μg/μl)，继在37℃孵育10分钟后加入5μl 0.05mg/ml的compound 48/80溶液刺激细胞，再孵育10分钟后冷却中止反应。在6000rpm、4℃条件下离心3分钟，回收细胞上清液。取400μl添加20μl的60wt.％pca(高氯酸，perchloric acid)除蛋白。室温放置20分钟后，添加400μl生理盐水，然后在13000rpm和4℃条件下离心3分钟，上清液用hplc方法测定组胺含量。
25.组胺含量的hplc测定法：分析柱：tsk gel histamine pak(4
×
60mm)；前处理柱：tsk precolumn his(4
×
60mm)；反应温度：45℃；流动相流速：0.6ml/min；前处理液流速：0.6ml/min；反应液流速：0.1wt.％邻苯二甲醛溶液0.2ml/min；4n naoh溶液：0.2ml/min；25wt.％h3po4溶液：0.3ml/min；检测(em：350nm；ex：460nm)。hplc详细条件参照文献(biol.pharm.bull.2003 oct；26(10):1393-7)。并通过如下公式计算：组胺释放抑制率(％)＝(1-(sample-blank))/(comp48/80-blank)
×
100。测试结果如表2所示。
26.表2
[0027][0028][0029]
从表2中可知，对比例1平卧菊三七提取物在浓度为100μg/ml时可有效抑制肥大细胞释放组胺，表明平卧菊三七提取物对组胺释放具有抑制活性。但是对比实施例1～12和对比例1～5的测试结果可知，当以平卧菊三七、酸角壳、肉桂和西红花四者复配时，制备的组合物的组胺释放抑制活性可达40％以上，抑制活性得到了显著的提升。另外，对比实施例1～10和实施例11～12的测试结果可知，当制备原料中，平卧菊三七：酸角壳：西红花：肉桂的质量比为50～70:10～15:5～10:2～5时，组合物对组胺释放的抑制活性更好，虽然实施例11中含有较多组胺释放抑制活性更高的平卧菊三七，但不同原料之间存在相互作用，只有符合上述配比时，才能保证组合物对组胺的释放率可以达到40％以上。
[0030]
2、测试实施例1和对比例1对致敏小鼠血浆中组胺水平的影响
[0031]
将60只小鼠随机分为正常对照组，致敏模型组，对比例1 200mg/kg和400mg/kg两个剂量组，实施例1 200和400mg/kg两个剂量组，每组10只。除了正常对照组外，其余各组小鼠于右耳皮内注射100mg的粉尘螨粗提浸液，一周2次，共注射4次，正常组给与同体积的生理盐水。对比例1和实施例1四个给药保护组提前灌胃给药1周，致敏实验结束后继续给药2周，正常组和模型组给与等容量的生理盐水。给药结束后，异氟烷麻醉小鼠后心脏取血。
[0032]
小鼠血浆组胺检测的具体步骤如下：心脏取血置于抗凝剂处理的离心管中，室温4000rpm离心5min，收集上清血浆，使用小鼠组胺酶联免疫分析试剂盒检测小鼠血浆中组胺的水平。实验结果见表3。
[0033]
表3
[0034][0035][0036]
与正常对照组相比，
*
p《0.05；与致敏模型组相比，
#
p《0.05。
[0037]
由表3可知，与致敏模型组相比，200mg/kg和400mg/kg的对比例1和实施例1均能明显降低小鼠血浆中组胺含量(p《0.05)。进一步地，实施例1的抑制活性明显高于对比例1。
[0038]
3、测试含平卧菊三七提取物的组合物对磷酸组胺致痒阈值的影响
[0039]
参考“新疆中医药,2011,29(01):14-15”造模，将40只豚鼠随机分为4组，每组10只，分别为正常对照组，实施例1 60mg/kg、120mg/kg和240mg/kg三个剂量组。给药组连续灌胃给药3周，正常对照组给与等容量的生理盐水。给药结束后，各组小鼠均脱去右后足背毛，并用粗砂纸擦伤脱毛区，面积约1cm2，向创面滴加50μl的磷酸组胺溶液，质量浓度依次递增，分别为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％等，直至豚鼠回舔右后足，最后出现舔足时所用磷酸组胺的总量(μg)即为致痒阈值。测试结果见表4。
[0040]
表4
[0041]
组别致痒阈(μg)正常对照组40.0
±
21.86组合物低剂量(60mg/kg)86.0
±
29.14
*
组合物中剂量(120mg/kg)140.0
±
27.89
*
组合物高剂量(240mg/kg)191.0
±
32.21
*
[0042]
与正常对照组相比，
*
p《0.05。
[0043]
由表4可知，本发明所述含有平卧菊三七提取物的组合物对磷酸组胺所致豚鼠瘙痒有一定的抑制作用，可显著提高磷酸组胺所致瘙痒的致痒阈值，且具有剂量依赖性。
[0044]
4、测试含平卧菊三七提取物的组合物对豚鼠足底皮肤hrh1水平的影响
[0045]
组胺受体ⅰ型hrh1广泛存在于中枢和外周，过敏反应发生时表现的皮肤红肿和瘙痒，与组胺作用于hrh1受体有关。实际上常用的抗组胺药，如氯雷他定、苯海拉明和依巴斯汀等均为选择性hrh1拮抗剂。因此，本发明也对性能测试3中豚鼠皮肤组织中hrh1受体的水平进行了检测。
[0046]
以western blot技术检测hrh1蛋白的表达。具体实验步骤如下：将豚鼠足底皮肤组织用液氮研磨成匀浆后，冰浴裂解1小时，以12000rpm、4℃低温离心20分钟，收取上清并通过bca法检测蛋白浓度，加入1/4体积的5
×
loading buffer，100℃煮沸5分钟变性即得蛋白样品。sds-page：蛋白上样30μg，60v恒压30分钟，120v恒压分离90分钟。转膜：将蛋白从凝胶转至甲醇活化的pvdf膜上，300ma恒流转印60分钟。封闭：5％脱脂牛奶常温封闭pvdf膜60
分钟。抗体孵育：tbst稀释hrh1抗体(1:1000)，置于4℃冰箱过夜。hrp孵育：tbst稀释二抗-hrp(1∶3000)室温孵育2小时。ecl化学发光：将条带放入ecl工作液中充分接触，置于天能发光工作站进行成像，image j软件对蛋白条带进行半定量分析。测试结果如表5所示。
[0047]
表5
[0048]
组别hrh1蛋白相对表达量正常对照组1.0
±
0.09组合物低剂量(60mg/kg)0.95
±
0.1组合物中剂量(120mg/kg)0.84
±
0.06组合物高剂量(240mg/kg)0.73
±
0.12
*
[0049]
与正常对照组相比，
*
p《0.05。
[0050]
由表5可知，实施例1(240mg/kg)能够显著抑制豚鼠足底皮肤组织中hrh1蛋白表达。该结果进一步表明，含平卧菊三七提取物的组合物不仅可以抑制肥大细胞释放组胺，同时还具有提升机体对组胺的耐受力、降低皮肤中组胺受体hrh1水平的作用。
[0051]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但并不脱离本发明技术方案的实质和范围。