诱导型一氧化氮合酶在制备治疗急性高眼压的早期血视网膜屏障损伤药物中的应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及诱导型一氧化氮合酶在制备治疗急性 高眼压的早期血视网膜屏障损伤药物中的应用。


背景技术：

2.青光眼是世界上第二大不可逆致盲性眼病。近年来，许多研究集中在视网 膜神经节细胞死亡方面。视网膜神经细胞的存活与周围的微环境密切相关。血 视网膜屏障(brb)是维持视网膜微环境稳态的关键。在结构上，brb由两 个不同的屏障组成：外层brb(obrb)，由视网膜色素上皮细胞组成，调节 脉络膜毛细血管和视网膜之间的转运；内层brb(ibrb)，调节视网膜毛细血 管之间的转运。视网膜神经节细胞(rgcs)的局部微环境主要受ibrb的保 护。ibrb不是一个绝对的屏障，因为血液中的物质可以通过两种不同的机制 通过它，小囊泡介导的运输(跨细胞)和细胞旁运输。细胞旁转运严格依赖于 紧密连接(tjs)，如claudins和zonula occludens(zo)；粘附连接(aj)，如 血管内皮钙粘蛋白(ve钙粘蛋白)；以及间隙连接(gjs)，例如连接蛋白43 (cx43)。研究表明zo-1是brb完整性的标志，zo-1的丢失或减少与屏障 通透性的增加有关。
3.各种原因，如缺血、糖代谢异常、炎性细胞因子的释放、玻璃体以及视网 膜前膜的机械牵引等都可以造成brb的破坏，导致血管内液体及大分子物质 渗漏到细胞外，形成视网膜水肿，目前常用的治疗药物包括：玻璃体内注射糖 皮质激素类药物gcs如曲安奈德、抗血管内皮生长因子药物如雷珠单抗等， 其中gcs通过调节健米连接蛋白李酸化促进紧密连接蛋白的表达，增强屏障 功能或稳定brb，或者通过抗炎效应至致炎性因子，但是gcs全身应用副作 用大，只能采用局部给药的方式，包括玻璃体注射和球周注射治疗，该类药物 虽然具有较好的疗效，但是药物半衰期段，需要反复多次注射，增加了玻璃体 内感染的几率，以及眼内压升高和白内障的几率。因此需要研发对血视网膜屏 障损伤的药物。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明通过制作大鼠急性高眼压模型后，免疫荧光 定位诱导型一氧化氮合酶inos的表达，免疫印迹检测inos和紧密连接蛋白 zo-1的表达变化，大鼠静脉注射3％伊文思蓝(eb)，检测视网膜铺片中eb 的分布，用分光光度计定量检测brb的损伤，给予inos特异性抑制剂1400w 干预后再次检测inos、zo-1的表达和brb的渗漏，根据上述实验结果，发 现inos的表达主要出现在急性高眼压模型的早期，而后inos和zo-1表达 下调，给予inos特异性抑制剂组中，在损伤前期eb渗漏量明显大于未给予 inos特异性抑制剂组，可知inos在急性眼高压早期上调对brb损伤起到保 护作用。
5.基于上述发现，本发明的目的在于提供诱导性一氧化氮合酶在制备治疗急 性高眼压的早期血视网膜屏障损伤药物中的应用。
6.基于同一发明构思的，本发明实施例还提供了诱导性一氧化氮合酶激活剂 在制
备治疗急性高眼压的血视网膜屏障早期损伤药物中的应用。
7.本发明实施例还提供了一种治疗急性高眼压的早期血视网膜屏障损伤药 物组合物，所述药物组合物包含诱导性一氧化氮合酶。
8.进一步的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、 辅剂和媒介物中的至少一种。
9.有益效果：
10.本发明通过大鼠急性眼高压模型建立，通过荧光定位inos的表达，其主 要表达在视网膜神经纤维层、节细胞层和内核层，与血管内皮细胞标志物cd31 共表达，通过免疫印迹结果，可知急性高眼压后早期(3h、6h)时，inos表 达上调，而后inos和zo-1表达下调，通过给予inos特异抑制剂的干预效 果对比，inos和zo-1表达下调，eb渗漏增多，说明inos对于高眼压的早 期血视网膜屏障损伤具有保护作用，可用于治疗急性高眼压的早期血视网膜屏 障损伤药物，为急性高眼压早期治疗提供了新思路。
附图说明
11.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是 本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的 前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
12.图1为本发明实施例提供的正常对照组、6h和12h组视网膜的免疫荧光 双重染色结果；
13.图2为本发明实施例提供的大鼠急性高眼压后不同时间点inos和zo-1 蛋白表达的变化图；
14.图3为本发明实施例提供的大鼠急性高眼压后不同时间点brb的渗漏量；
15.图4为本发明实施例提供的不同组大鼠视网膜进行westernblot检测inos 和zo-1的表达情况；
16.图5为本发明实施例提供的不同组大鼠视网膜的渗漏情况。
具体实施方式
17.为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附 图及具体实施例进行详细描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
18.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解 含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是 旨在限制本发明的保护范围。
19.本发明遵循“赫尔辛基宣言”和“阿尔沃动物在眼科和视力研究中使用动 物声明”的原则。
20.在本发明实施例中，实验动物纳入标准为体重200g-250g的生长发育良好、 健康sd大鼠，雌雄不限。动物购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司和海口 宇氏生物科技有限公司。实验期间，大鼠饲养在标准情况下，每个笼子里饲养 2-3只，并提供标准的食物和水。动物合格证号：1107262011000875、 430727211101955725、430727211102090613。
21.在本方实施例中，首先采用免疫荧光定位inos的表达，免疫印迹检测其 蛋白在高眼压后的表达变化，eb定量检测视网膜中血-视网膜屏障在急性高眼 压不同时间段的损伤情况，接着再利用inos特异性抑制剂1400w，研究inos 在血-视网膜屏障损伤中的作用。免疫荧光双标染色用9只大鼠，分别为对照 组、6h组和12h组；免疫印迹和eb定量检测分别用21只大鼠，随机将动物 分为对照组，3h、6h、12h、1d、2d、3d组，每组3只大鼠；给予inos的特 异性抑制剂1400w(medchemexpress)干预后的免疫印迹用12只大鼠，eb 检测用24只大鼠，随机将动物分为对照组(cont)，正常+抑制剂组(cont+inh)， 6h组(6h)和6h+抑制剂组(6h+inh)，每组3只大鼠。正常+抑制剂组大鼠为在 取材前1d腹腔注射内注射用10％dmso与90％(20％sbe-β-cd in saline)配 制的1mg/100g的1400w；在建造6h+抑制剂组大鼠在建造急性高眼压模型前 1d，腹腔内注射用10％dmso与90％(20％sbe-β-cd in saline)配制的 1mg/100g的1400w；对照组和6h组大鼠腹腔注射等体积0.9％生理盐水。
22.大鼠急性高眼压模型的建立：
23.10％水合氯醛溶液3-5ml/kg对大鼠进行腹腔注射使其麻醉，若干分钟后掐 其尾巴判断大鼠麻醉情况是否良好，无反应则麻醉完成。将大鼠放置在江湾i 型定位仪(第二军医大学)上，大鼠上齿挂住铁块，四肢用棉线打活结绑好固定。 在大鼠眼部先后滴氯霉素滴眼液抑菌，盐酸丙美卡因滴眼液(爱尔凯因公司， 进口药品注册证号：h20160133)用作眼部镇痛剂，复方托吡卡胺滴眼液(永光 制药，国药准字：h20066782)用作散瞳剂。待散瞳完成后，调节输液器使针头 液滴缓慢滴出，从角膜与结膜的交界处之间进针，插至眼前房，无液体从眼部 流出即为插针成功。插针成功后，固定头皮针。每2min将生理盐水瓶上移0.3m， 直至1.5m处，开始计时1h。为防止大鼠挣脱，可在30min时视情况补水合氯 醛0.1-0.2ml以及眼部镇痛剂。1h后，每2min下移0.3m，直至与鼠平行，停 留2min后平行取针，建模完成。将鼠平放10min后，在大鼠眼部滴氯霉素滴 眼液后放入笼中饲养。
24.组织准备：
25.制作大鼠急性高眼压模型，使大鼠存活相应的时间点后将大鼠麻醉，用水 浴锅预热到37℃的200ml生理盐水对大鼠进行灌注，再用200ml的4％多聚甲 醛进行快灌，随即用200ml的4％多聚甲醛进行慢灌。而后解剖眼睛，去除角 膜、晶状体、玻璃体后将眼球做成视杯。梯度蔗糖溶液脱水，oct冷冻切片 包埋剂(日本樱花sakura)包埋，在全自动冷冻切片机(美国thermo)上 切片，片厚10μm，室温放置30min，待样本贴壁牢固后放置于4℃冰箱保 存待用。用作免疫印迹的样品，在制作大鼠急性高眼压模型并使大鼠存活相应 的时间点后立即麻醉，解剖眼睛，去除角膜、晶状体、玻璃体，并刮下视网膜， 将其放入冻存管后于液氮中速冻，-80℃保存以备后用。
26.免疫荧光检测：
27.将切片从冰箱中拿出，放在室温待切片上无水珠，用1
×
pbs配制的5％ 驴血清和0.3％tritonx-100混合液封闭后，加一抗，4℃冰箱过夜孵育。经3
×ꢀ
5min的pbs洗涤后，样本与二抗在37℃，避光条件下孵育1h。再经过3
×
5min 的pbs洗涤，用含有dapi的抗荧光猝灭剂进行封片。在激光共聚焦显微镜 (奥林巴斯fv1000)下分别观察并拍照。其结果如图1所示。免疫荧光双重 染色结果显示inos在正常对照组和6h组视网膜有表达，12h组未见表达，其 主要表达在视网膜神经纤维层、节细胞层和内核层两边；与血管内皮细胞标记 物cd31有共表达，与视网膜节细胞标记物neun没有共表达。
28.westernblot检测：
29.提取视网膜蛋白质之后，分装出60μl蛋白用bca蛋白检测试剂盒 (thermo)测定蛋白含量，剩余蛋白分装放置于-80℃冰箱待用。按照每孔上样 量为40μg蛋白质进行sds-page电泳，先设置电压为80v，待上样缓冲液 跑至分离胶与浓缩胶的分界处，约为25min，而后改为120v电泳分离60min。 电泳完毕后，将蛋白质在330ma的电流下，90min转移到硝酸纤维素膜上。 将膜放置于用tbst配制的5％脱脂奶粉中常温封闭2h，封闭完成后立马用 tbst洗涤3
×
10min。然后将膜与相应的特异性一抗稀释在tbst中于4℃孵 育过夜。再次用tbst将膜洗涤3
×
10min，在室温下与稀释后的二抗孵育 90min来检测抗体-抗原复合物，并使用超敏ecl化学发光试剂盒(碧云天) 使蛋白质条带可视化。β-肌动蛋白用作标准蛋白，inos以及zo-1为检测蛋 白。用imagej计算inos或zo-1与标准蛋白灰度值的比值，表示inos或zo-1 蛋白水平。其结果如图2所示，急性高眼压后，取不同时间点大鼠视网膜进行western blot检测inos和zo-1的表达，结果显示inos在急性高眼压后3h 开始升高，6h达高峰(p《0.001)，而后12h，24h，48h和72h基本不表达； zo-1在3h和6h表达与正常组比较没有差别，而后12h，24h，48h和72h表 达下调(p《0.001)。
30.eb检测brb的损伤：
31.四个组cont，cont+inh，6h，6h+inh的大鼠都是在处死前腹腔注射10％ 水合氯醛麻醉，大隐静脉注射3％的伊文思蓝(4.5mg/100g)(sigma,e2129)， 注射完后，可见大鼠眼睛、足趾变为蓝色。到相应时间节点，立即冰上取眼球， 剪除角膜和挖出晶状体、玻璃体后，避光条件下放4％多聚甲醛中后固定30 分钟，然后取视网膜铺片，荧光显微镜(olympus ix51)观察拍照。eb定量 检测则为用1ml甲酞胺把1μl伊文思蓝(2％)稀释1000倍,浓度为20ng/μl,然 后依次对半稀释7次和甲酞胺空白管总共8个标准管用于eb在甲酞胺中的标 准曲线制备。取出眼球视网膜，自然晾干后称其重，而后分别将其与160μl 甲酰胺混合于ep管里在60℃恒温箱一起孵育24h。然后将提取液在4℃， 15294g下高速离心30min。取标准管和样本管上清液用分光光度计在波长620 nm测其光密度值。
32.取cont，cont+inh，6h，6h+inh组的大鼠视网膜进行westernblot检测inos 和zo-1的表达，结果显示6h组inos表达上调，对照+抑制剂组，6h+抑制剂 组inos基本不表达；zo-1表达在对照+抑制剂组、6h组变化不明显，6h+抑 制剂组下调明显，其结果如图4所示。cont，cont+inh，6h，6h+inh组的大鼠 进行伊文思蓝注射，取大鼠视网膜进行铺片和伊文思蓝定量检测brb渗漏情 况，铺片结果显示对照组血管外未见红色eb荧光斑点，加抑制剂后，血管外 可见荧光斑点，6h组可见少量红色荧光斑点，加抑制剂后，可见血管红色eb 荧光斑块(可能是eb红色荧光斑点融合而成)。定量结果显示对照+抑制剂组 eb渗漏量增多，6h+抑制剂组渗漏量明显增多(p《0.001)，具体结果详见图5。
33.由上述实验和结果可知，急性高眼压后inos主要表达在视网膜神经纤维 层、节细胞层和内核层，与血管内皮细胞标记物cd31有共表达。急性高眼压 后早期(3h，6h)时，inos表达上调，而后inos和zo-1表达下调。eb定 量结果显示，急性高眼压后brb出现明显损伤，但6h时，eb渗漏很少。并 根据抑制剂组结果数据，可知inos和zo-1表达下调，eb渗漏量比加抑制剂 前明显增多，可以得出，inos在急性高眼压后早期上调可能对brb损伤起保 护作用。
34.以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员
来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。