F5-肽和/或P-gp抑制剂在制备跨血睾屏障药物上的应用及口服靶向纳米粒子与药物

f5-肽和/或p-gp抑制剂在制备跨血睾屏障药物上的应用及口服靶向纳米粒子与药物
技术领域
1.本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及f5-肽和/或p-gp抑制剂在制备跨血睾屏障药物上的应用及口服靶向纳米粒子与药物。


背景技术：

2.睾丸生精上皮是精子发生过程的起点，主要由连接在基底膜上的支持细胞及多种生殖细胞构成，而支持细胞之间的多种细胞间连接构成了血睾屏障（btb）。btb的存在阻止了有害物质由血液进入睾丸生精上皮，但同时也阻止了大部分小分子药物和大分子药物（例如肽，蛋白质和基于基因的药物）的转移。研究表明，btb不仅阻碍了药物（如避孕药，抗病毒药物）在生精小管内的运输，使得药物无法直接作用于生精上皮近腔室区域，而且使得抗逆转录病毒无法完全清除生精小管内的病毒，睾丸便成为病毒的潜在储蓄池，进而使得寨卡病毒、hiv、covid-19等病毒性疾病的复发风险明显增加，严重限制了睾丸相关疾病（例如睾丸癌、睾丸感染、睾丸损伤等）的治疗。
3.在哺乳动物的睾丸中，支持细胞（sertoli cell，sertoli细胞）与精子细胞之间的粘着连接称为顶端外质特化（apical ectoplasmic specialization，apical es），sertoli细胞之间的粘着连接称为基底外质特化（basal ectoplasmic specialization，basal es）。btb主要由位于生精上皮基底膜附近相邻的sertoli细胞间形成的紧密连接构成，除此之外，basal es、间隙连接以及基于中间丝的桥粒也参与了btb的构成（图1）。btb将生精上皮分隔成基底室和近腔室，为精子的形成创造了相对独立的微环境。啮齿动物生精周期的第viii-ix期，相当于人类的生精上皮周期第vi-vii 期，精母细胞作为一种特殊的细胞群，通过细胞间桥穿越btb，与此同时，成熟的精子也在曲细精管管腔附近释放。虽然这两个细胞事件发生在生精循环的的同一阶段，却位于生精小管中相对的两端。
4.btb具有物理和生化屏障功能，它显著限制了药物向睾丸的转运。首先，btb虽然为精子发生提供了良好的微环境，却也限制了水、电解质、离子、激素、旁分泌因子等细胞旁路和跨细胞途径的扩散和运输，同时也极大地限制了药物的跨屏障转运，例如，小型亲水性药物和无法轻易跨越脂质双分子层扩散的大分子药物（如抗体和抗体-药物结合物）等。因此，抑制btb的物理屏障功能，使btb瞬时“开放”，对于药物跨越btb的转运十分重要。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种f5-肽和/或p-gp抑制剂在制备跨血睾屏障药物上的应用及口服靶向纳米粒子与药物，促进药物跨越这一屏障进入btb后的生精上皮管腔内发挥作用，为跨屏障药物的研发提供新思路，具有重要的社会意义和经济价值。
6.本发明采用的技术解决方案是：f5-肽在制备跨血睾屏障药物上的应用。
7.所述的f5-肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。
8.所述的跨血睾屏障药物包括f5-肽的dna序列，通过递送至体内合成f5-肽。
9.p-gp抑制剂在制备跨血睾屏障药物上的应用。
10.所述的p-gp抑制剂为选择性、非竞争性的p-gp抑制剂tariquidar。
11.f5-肽和p-gp抑制剂tariquidar在制备跨血睾屏障药物上的应用。
12.一种用于避孕的口服靶向纳米粒子，所述的口服靶向纳米粒子包括所述的f5-肽和p-gp抑制剂tariquidar、药物组分fshβ-adjudin偶联体以及纳米基础材料。
13.所述的纳米基础材料为以脂质体或海藻酸盐中的一种或几种。
14.一种所述的口服靶向纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：（1）fshβ-adjudin偶联体的制备：将fshβ溶于dmf， adjudin溶于三氯甲烷， dcc溶于dmso， dmap溶于dmso，将完全溶解的fshβ和adjudin在37℃搅拌均匀；接着加入dcc，反应后；再加入dmap，避光反应；将混合物于1.0kda透析袋内避光透析，冻干备用；（2）faf5t-lan纳米粒子的制备：将f5-肽的质粒dna溶于depc水， tariquidar稀释成2μm/l，40mg/ml的dppc、胆固醇、dspe-peg分别按2:1:0.15摩尔比溶于三氯甲烷，置圆底蒸发瓶中，室温条件下，负压旋转蒸发，彻底去除溶剂成分，将f5-肽的质粒dna、tariquidar与fshβ-adjudin偶联体，加至脂质体成分中旋转超声混匀；随后重悬于海藻酸钠溶液中，在4℃缓慢滴入1mm cacl2，聚合交联得到faf5t-lan 口服靶向纳米制剂。
15.一种用于避孕的口服靶向药物，所述的口服靶向药物包含权利要求7所述的口服靶向纳米粒子。
16.机理：转运十分重要。在生精上皮周期的viii期，sertoli细胞大量表达基质金属蛋白酶2，介导lamininγ3（apical es连接蛋白）的水解，释放结构域iv片段，从该片段克隆出的50个氨基酸残基称为f5-肽，它可使btb可逆性地“渗漏”，并促进apical es的降解，利于精子的成熟和释放（图2）。项目申请人曾在雄性sd大鼠睾丸内过表达f5-肽发现，大量未成熟的精子细胞释放至曲细精管管腔或局限于基底膜附近。f5肽通过影响肌动蛋白调节蛋白（如eps8和arp3）以及微管的调控蛋白（如mark4、eb1）来改变细胞骨架的组装过程、形态与功能，从而调节btb的完整性。因此，内源性的f5-肽可成为“开启”btb物理屏障的理想分子。
17.除此之外，btb上具有许多药物转运蛋白，如p-糖蛋白（permeability glycoprotein，p-gp）和多药耐药相关蛋白1，它们能将药物从睾丸中的btb处泵出。p-gp又称mdr1，由两个疏水结构域组成，其中12个跨膜α螺旋结构为药物结合结构域，负责将毒素和药物向细胞外转运。p-gp在睾丸sertoli细胞、生殖细胞、肾小管周肌样细胞及微血管的内皮细胞上均有大量表达。p-gp与其他外排药物泵具有协同作用，主动将渗透到btb中的外源性药物从睾丸中泵出，阻止药物进入生精上皮，因此，阻断p-gp的药物外排作用对于跨越btb屏障运输药物的研发十分关键。tariquidar是一种选择性、非竞争性的p-gp抑制剂，它可高亲和力地结合到p-gp，阻断p-gp将外源性药物从组织泵出。因此，tariquidar可成为药物进入睾丸的另一个有效靶点，在药物完成转运过程后，可利用tariquidar弱化btb的生化屏障功能，使btb瞬时“关闭”，减少药物的外排，增加药物利用度。
18.本发明的有益效果是：本发明提供了一种f5-肽和/或p-gp抑制剂在制备跨血睾屏障药物上的应用及口服靶向纳米粒子与药物，首次提出利用f5-肽破坏btb的物理屏障，tariquidar抑制p-gp破坏btb的生化屏障，使btb瞬间“开放”和“闭合”，basal es蛋白与紧
密连接蛋白不再与基底膜附近的btb处紧密相连，p-gp转运蛋白无法将外源性药物adjudin泵出btb，从而使得adjudin顺利转运至生精上皮，提出构建携带活性adjudin分子的faf5t-lan口服靶向纳米制剂，并有望成为高依从性的男性避孕药，具有重要的社会意义与经济价值。
附图说明
19.图1为生精上皮中btb的位置和形态图。
20.图2为2. f5-肽抑制apical es和basales/btb。
21.图3为faf5t-lan纳米粒子调节btb屏障功能和精子发生的科学假说。
22.图4为4. adjudin与fshβ偶联原理。
23.图5为本发明技术路线图。
24.图6（a）faf5t-lan的粒径分布，（b）faf5t-lan的透射电镜检测，（c）faf5t-lan的细胞毒性测试。
25.图7（a）rt-pcr检测f5-肽过表达的水平，（b）f5-肽过表达的半定量水平，（c）wb检测p-gp蛋白水平，（d）p-gp半定量水平，（e）免疫荧光检测细胞核（dapi）附近红色荧光（含cy 5.5的faf5t-lan），证实faf5t-lan成功转染sertoli细胞（绿色荧光gfp）。
26.图8（a）ter（跨上皮电阻）检测faf5t-lan抑制体外sertoli细胞btb屏障功能，（b）wb检测faf5t-lan抑制btb紧密连接蛋白水平，（c）btb紧密连接蛋白的半定量水平。
27.图9 为if检测faf5t-lan抑制btb紧密连接蛋白的分布。
28.图10为免疫荧光或phalloidin染色评估faf5t-lan抑制f-actin，α-tubulin，vimentin的表达和分布。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.adjudin干扰精子发生的过程及应用限制adjudin，也称af2364（mw：335.18），为氯尼达明的衍生物，通过影响肌动蛋白调节蛋白（eps8、arp3、palladin、formin1等）与微管调节蛋白（camsap2，eb1，mark4等）在生精上皮的表达和分布，从而使肌动蛋白和微管不能正常地聚合和解聚，干扰sertoli细胞与精子细胞之间的锚定连接，影响其粘附蛋白复合物的形态与功能，导致包含伸长精子细胞、圆形精子和精细胞在内的未成熟生殖细胞从生精上皮脱落（但精原细胞不受影响），从而达到雄性避孕的效果。adjudin可能通过调控p-fak-y407和n-wasp的表达水平影响细胞骨架的稳定性，从而干扰精子发生的过程。
[0031] adjudin为小分子亲脂性化合物，却不能自由跨越btb扩散至生精上皮，反而使btb变得更加紧密难以跨越。adjudin可能通过位于sertoli细胞底部及btb的药物流入泵和流出泵进出生精上皮，这也导致了adjudin的有效作用剂量和中毒浓度的差异很小，生物利用度低于1%。项目申请人曾将adjudin与f5肽共同作用于大鼠sertoli细胞，降低adjudin的
有效避孕剂量，但依旧未能实现adjudin的口服应用。本研究将选择adjudin作为药物研究模型，评估其在睾丸的分布，并利用f5-肽和p-gp抑制剂tariquidar破坏btb的物理屏障和生化屏障，促进adjudin在生精上皮内跨btb的转运，增加其生物利用度。通过深入的动物模型研究，了解药物跨btb转运的机制，也为其他药物跨组织-血液屏障研究开创新思路。
[0032]
fshβ肽靶向sertoli细胞促卵泡激素（fsh）是由垂体前叶合成的糖基化蛋白质激素，它与sertoli细胞上的fsh受体（fshr）结合，刺激sertoli细胞为不同发育阶段的生殖细胞提供结构和营养支持。fsh由α和β两个亚基组成，彼此通过非共价键形成异二聚体，其中，fshβ亚基为fsh主要活性成分，由118个氨基酸残基组成，第33~53与81~95氨基酸区间为fshr的结合位点。fshr主要存在于雄性哺乳动物的睾丸sertoli细胞上，而在生殖细胞和其他组织细胞内表达非常低，因此fshβ亚基是向睾丸靶向递送药物的优选载体。实际上，fsh突变体-occludin偶联物可靶向性地破坏btb，美法仑和fshβ缀合物可诱导损伤小鼠睾丸而达到雄性避孕效果。申请人所在课题组根据fshr的结合位点，合成了fshβ短肽（简称fshβ），通过与fshβ结合，使得adjudin的避孕效率约提高了10,000倍，且无不良反应发生，但fshβ-adjudin偶联物一经口服使用，便会被胃内多种蛋白酶水解而失活，因此该偶联物仅限于腹腔注射应用。如何将fshβ-adjudin偶联物经口服使用并诱导产生可逆的效果，仍未得到解决。
[0033]
纳米药物缓释系统纳米药物尺寸多分布在50-500nm范围内，通过调节纳米药物的释放时间和速度，可实现药物的控制释放，延长药物作用时间，减少给药量，降低药物的毒副作用。申请人曾制备含5-fu携带环状crgdfk肽和chlorin e6的多功能丝素蛋白纳米颗粒，可有效靶向并实现胃癌的多模态治疗。在最初的4小时，游离的5-fu被完全释放（》 97％），5-fu @ sf（粒径226.0 nm）释放了60％的5-fu，而5-fu @ sf-crgdfk-ce6 np（粒径364.9nm）中5-fu仅释放了约33％，提示药物经纳米复合物重新组装后，可有效控制其释放速率。因此，将adjudin制备成纳米缓释药物，并靶向性地递送至睾丸生精上皮，具有一定的潜在应用价值和社会意义。
[0034]
脂质体由脂质双分子层组成，粒径约100 nm。相较于病毒载体，脂质体与基因的复合过程更简单；脂质体与细胞膜融合后将目的基因导入细胞，脂质即被降解，无免疫原性，可有效保护dna或rna不被血浆核酶降解。kevin和luca等，在脂质体表面上连接基于dna的triskelion结构并成功用于药物的靶向递送；jennifer和andrew等，将球形核酸和药物共同包被于脂质体内，便于脂质体向肝脏以外的组织递送。上述研究表明，脂质体携带的基因可转运至特定部位，转染过程方便易行，重复性好。海藻酸是来源于褐藻的天然阴离子聚合物，具有无免疫原性、生物相容性好等特性，它与ca2+交联形成的三维网络纳米凝胶或纳米颗粒，可广泛用于药物、质粒、线性核酸的负载。不仅如此，海藻酸纳米凝胶对ph敏感度高，在酸性环境中（如胃液）非常稳定，但在弱碱性环境中（如肠液）逐渐降解，它的这种ph反应特性，十分利于小分子药物的口服制剂的制备。patil和devarajan等，制备了以尼古丁-酰胺作为渗透剂的含胰岛素的藻酸盐纳米颗粒，生物利用度高达80％。因此，以脂质体、海藻酸为基础的纳米材料可有效用于药物的靶向递送。
[0035]
faf5t-lan的制备与表征（1）fshβ-adjudin偶联体的制备（图4）：将1mg fshβ溶于10ml dmf，2mg adjudin溶
和n-wasp-/-sertoli细胞，孵育24小时后，更换培养基，孵育24小时，收集细胞。通过qpcr、wb、if、co-ip等技术检测btb相关蛋白（同上），细胞骨架蛋白及其调节蛋白（同上）的表达分布；通过f-actin bundling assay和microtubule spin-down assay分别检测肌动蛋白动力学和微管动力学；每天定时测量ter，检测体外btb的紧密连接的连续变化，探索fak/n-wasp在faf5t-lan调节btb中的作用。
[0045]
faf5t-lan干扰大鼠精子发生的作用和跨btb转运机制（1）动物模型：将300g成年雄性sd大鼠分为8组（每组8只），分别为faf5t-lan（分别含adjudin 1、5、50mg/kg），fshβ-lan 、adjudin-lan、f5-lan，tariquidar-lan和空白lan，隔天口服饲喂1次，连续3次。
[0046]
（2）faf5t-lan干扰大鼠睾丸btb功能和精子发生过程：在第12天向睾丸内注射100μl生物素溶液，30分钟后取睾丸并切片；加入alexa fluor 555-链霉亲和素，室温孵育1小时。通过计算生物素从生精小管的基底部向管腔的扩散距离占相应生精小管半径的百分比，准确评估btb“泄漏”程度。在第21天取睾丸、肝、肾等组织进行脱水包埋、切片与he染色，评估精子发生的缺陷和组织器官的毒性作用；取精液进行常规检测，评估精子的活力缺陷。
[0047]
（3）faf5t-lan促进adjudin跨btb转运的机制：在第21天，取适量睾丸组织进行qpcr、wb、co-ip、if等实验技术，检测睾丸中的btb连接蛋白，细胞骨架蛋白及其调节蛋白表达与分布水平，btb调控分子的表达变化，进一步在体内探索faf5t-lan促进adjudin跨btb转运的调控机制。
[0048]
技术路线图：（见图5）。
[0049]
faf5t-lan的粒径分布和细胞毒性评估目前，我们已经初步完成fshβ、adjudin的化学偶联，含f5、tariquidar脂质体及海藻酸壳层交联粒子的制备，初步的表征和细胞毒性检测表明：粒径约150nm，分布均匀，对sertoli细胞没有明显的毒性（图6）。
[0050]
faf5t-lan靶向sertoli细胞faf5t-lan作用于体外sertoli细胞后，f5-肽的基因水平明显升高（图7a，b），p-gp蛋白水平显著下调（图7c，d），faf5t-lan（cy 5.5，红色荧光）成功定位于sertoli细胞核附近（图7e）。
[0051]
faf5t-lan抑制了体外btb屏障功能faf5t-lan作用于体外sertoli细胞后，ter（跨上皮电阻）显著下调，free adjudin明显上调ter水平（图8a），btb紧密连接蛋白（n-cadherin和β-catenin）水平呈不同程度地下降（图8b，c）。
[0052]
faf5t-lan抑制了体外btb紧密连接蛋白的表达与分布作用于体外sertoli细胞后，faf5t-lan较free adjudin显著抑制了btb紧密连接蛋白n-cadherin（绿色荧光）和β-catenin（红色荧光）的表达与分布（图9）。
[0053]
faf5t-lan干扰了sertoli细胞的细胞骨架蛋白的表达和分布。
[0054]
与free adjudin相比，faf5t-lan作用于体外sertoli细胞后，细胞骨架蛋白f-actin（绿色荧光），α-tubulin（红色荧光），vimentin（红色荧光）的表达和分布显著下调（图10）。
[0055]
结论
（1）首次提出利用f5-肽破坏btb的物理屏障，tariquidar抑制p-gp破坏btb的生化屏障，使btb瞬间“开放”和“闭合”，basal es蛋白与紧密连接蛋白不再与基底膜附近的btb处紧密相连，p-gp转运蛋白无法将外源性药物adjudin泵出btb，从而使得adjudin顺利转运至生精上皮。
[0056]
（2）首次提出构建携带活性adjudin分子的faf5t-lan口服靶向纳米制剂，并有望成为高依从性的男性避孕药，具有重要的社会意义与经济价值。
[0057]
（3）有望揭示faf5t-lan干扰btb功能和促进adjudin跨btb转运的分子机制，本项目拟从细胞骨架蛋白的角度，通过crispr/cas9基因编辑技术，进一步揭示p-fak-y407、p-fak-y397和n-wasp在faf5t-lan促进adjudin跨btb转运过程中的作用。
[0058]
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
[0059]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。