一种抗抑郁症药物及其筛选方法

1.本发明涉及医药领域，具体讲是一种抗抑郁症药物及其筛选方法。


背景技术：

2.抑郁症是一种常见的精神障碍类疾病，其临床表现为情绪低落、失眠、食欲不振以及注意力不集中等。严重的抑郁症甚至会增加自杀风险。根据世界卫生组织的数据，全球有超过3.2亿人患有抑郁症。已有研究分析预测到2030年，抑郁症将成为中等收入和高收入国家的主要疾病负担。因此，深入探索抑郁症发病机制迫在眉睫。
3.目前在市面上已经出现很多种类抗抑郁药物主要包含单胺氧化酶类抑制剂、三环类药物和选择性五轻色胺再摄取抑制剂。但是这些药物都普遍存在见效时间长、副作用强以及人群药物敏感性差异等问题。分析其原因可能在于疾病的发病机理复杂以及药物针对的靶点特异性不强。解决此类问题关键在于在揭示抑郁症机制的基础上找到确切的药物靶点。
4.抑郁症的病理生理机制复杂，患者所表现出的中枢精神障碍涉及多个系统的病理变化，并累及体内代谢和组织微结构异常。其中肠道炎症与抑郁的联系越来越受到关注。临床研究表明ibd(炎症性肠病)患者在确诊之前的9年之内更有可能被诊断为抑郁症；与没有抑郁症状的人相比，在出现抑郁症状前报告胃肠道症状的人患ibd的可能性高出40％。近年来研究发现，uc(溃疡性结肠炎)患者常伴有焦虑、抑郁等多种心理健康问题。肠道炎症一定程度上是抑郁的诱因，但相关机制阐述不清晰，未能从外周炎症变化探讨其在抑郁症中的作用机制。因此需要深入发掘肠道炎症与抑郁症相关的机制，以其为靶点寻找新型抗抑郁症的药物。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种抗抑郁症药物及其筛选方法。
6.本发明的技术解决方案如下：
7.一种抑制肠道炎症的药物在制备抗抑郁药物上的应用。
8.本发明还公开了一种抗抑郁药物，以肠道炎症因子调节肠道ido1作为靶点。
9.优选地，所述抑制肠道炎症的药物为美沙拉嗪、奥沙拉嗪、巴柳氮、柳氮磺吡啶的一种或多种。
10.优选地，其能够抑制肠道中的炎症因子，下调肠道中ido1。
11.优选地，所述抗抑郁药物为美沙拉嗪或黄芩-黄连提取物。
12.本发明还公开了一种抗抑郁药物的筛选方法，通过建立动物慢性抑郁模型，检测动物体内是否有肠道炎症，将待选药物对模型进行给药，检测待选药物是否起抗抑郁作用。
13.进一步地，还包括以下步骤：
14.检测待选药物是否下调动物肠道中的炎症因子；
15.检测待选药物是否下调动物肠道中ido1的表达；
16.检测待选药物是否调节动物肠道中色氨酸代谢；从而识别出动物体内抗抑郁药物的作用靶点。
17.进一步地，所述步骤一中，是否起抗抑郁作用的判断条件为：采用免疫印迹方法检测动物结肠组织中ido1的表达。
18.进一步地，采用elisa法检测所述炎性因子的水平。
19.本发明的有益效果是：本发明的一种抗抑郁症药物，此药物以炎症因子调节肠道ido1为靶点且通过抑制肠道中的促炎因子，进而下调肠道中ido1，调节色氨酸代谢，抑制肠道中色氨酸向犬尿氨酸的转化，促进色氨酸转化生成5-ht水平，从而起到抗抑郁作用。本发明是一个新的治疗性药物设计靶点，将有望推动以抑制肠道炎症和/或抑制ido1表达的成分为基础的抗抑郁药物筛选。
附图说明
20.图1为本发明实验组1(美沙拉嗪)中糖水偏好实验的结果；
21.图2为本发明实验组1(美沙拉嗪)中强迫游泳的结果；
22.图3为本发明实验组1(美沙拉嗪)中炎症因子elisa的结果；
23.图4为本发明实验组1(美沙拉嗪)中肠道ido1表达量的结果；
24.图5为本发明实验组1(美沙拉嗪)中色氨酸代谢的结果；
25.图6为本发明实验组2(黄芩-黄连)中糖水偏好实验的结果；
26.图7为本发明实验组2(黄芩-黄连)中强迫游泳的结果；
27.图8为本发明实验组2(黄芩-黄连)中炎症因子elisa的结果；
28.图9为本发明实验组2(黄芩-黄连)中肠道ido1表达量的结果；
29.图10为本发明实验组2(黄芩-黄连)中色氨酸代谢的结果；
30.图中，与模型组对比，“*”表示p《0.05,“**”表示p《0.01,“***”表示p《0.001，p《0.05具有统计学意义。
具体实施方式
31.本部分将详细描述本发明的具体实施例，但其不能理解为对本发明保护范围的限制。
32.该实施例是以炎症因子调节肠道ido1为作用靶点的抗抑郁症药物，其通过肠道炎症水平和ido1表达以及色氨酸代谢来验证其抗抑郁症作用是否是以炎症因子调节肠道ido1为作用靶点。
33.具体实施例采用美沙拉嗪作为治疗抗抑郁症的药物，具体地不限制于此。在动物行为绝望抑郁症模型实验中动物抑郁症行为明显改善减轻或消失并且进一步检测发现实验动物肠道炎症下降，肠道ido1表达下降，同时色氨酸代谢恢复正常。具体该药物的作用靶点试验方法如下：
34.需要说明的是ido1是指色氨酸代谢限速酶，吲哚胺2，3-双加氧化酶1。
35.elisa：酶联免疫吸附实验。
36.cums：慢性不可预知温和应激。
37.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
38.步骤一：小鼠抑郁模型建立及给药
39.实验动物采取雄性、7周龄c57小鼠。所有小鼠自由摄食饮水，采用12h的昼夜周期(8：00-20：00为夜，20：00-8：00为白昼。)
40.实验组1：将美沙拉嗪配制成30mg/ml浓度，美沙拉嗪具体采用美沙拉嗪缓释颗粒(艾迪莎)，上海爱的发制药有限公司。
41.实验组2：将黄芩-黄连提取物配制成2g
·
ml-1
的混悬液，按0.1ml/10g灌胃给药。其中黄芩-黄连提取物制备：取黄芩、黄连饮片，粉碎，干燥后分别称取黄芩、黄连各50g，为原料，按原料：水的1∶12(g∶m l)加水，浸泡30min，煎煮2h，趁热过滤。药渣加10倍的水再提取2h，趁热过滤。合并2次提取液，浓缩至相对密度为1.02(80℃下)的稠膏，各稠膏经冷冻干燥，即得黄芩-黄连提取物。
42.将小鼠随机分成模型组、空白组、实验组1和实验组2，通过口服相应的药物，每组8只小鼠，除空白组小鼠外，其余组小鼠均需建立抑郁模型。模型建立的方式是采取小鼠慢性不可预知刺激的方式。在本次实验中，共采用了14种应激源，14个应激方式分别为改变光照性质、调整昼夜节律、禁水、禁食、4℃冰水游泳、45℃高温游泳、倾斜45℃鼠笼、潮湿垫料、水平震荡、轻夹鼠尾、束缚、白噪音、间断(闪光)刺激，悬尾，共14种。具体的应激方式见表1。cums组小鼠每日不定时随机给予2种应激，每种应激源不连续出现2次。
43.表1 cums抑郁造模应激刺激试验日程表
44.[0045][0046]
模型建立完成以后，需对各造模组进行给药。按照已安排好的组别分别进行给药，边造模边给药，给药周期为三周。
[0047]
(1)空白组(不需要建立模型)：作为空白对照，除每日给予灌胃0.2ml/20g的生理盐水外，不进行任何处理，连续灌胃15天。
[0048]
(2)模型组：作为阴性对照，在小鼠造模成功后，每日给予灌胃0.2ml/20g的生理盐水，连续灌胃21天。
[0049]
(3)美沙拉嗪组：作为实验组1，小鼠造模成功后，每日给予灌胃0.2ml/20g的浓度为30mg/ml的美沙拉嗪，连续灌胃21天。
[0050]
(4)黄芩-黄连药对组：作为实验组2，小鼠造模成功后，每日给予灌胃0.1ml/10g的黄芩-黄连药对，连续灌胃21天。
[0051]
步骤二：小鼠糖水实验
[0052]
糖水偏好实验用于评估小鼠糖水喜好，可反映小鼠快感缺失程度。在整个动物实验中，共进行两次糖水偏好实验。在造模前，通过糖水偏好实验测量所有小鼠蔗糖偏好系数，保证进行实验的小鼠状态一致。在实验结束后，糖水偏好实验作为动物行为学的一部分，用于评价小鼠快感缺失的程度。糖水偏好实验包括两个部分，分别为适应训练部分和测试部分。在训练中，小鼠在前24h每笼放入两瓶1％(w/v)的蔗糖溶液，紧接着24h将其中的一瓶换成纯水，适应结束后，禁食禁水24h，之后开始测量糖水偏好系数。在测试中，小鼠只能选择事前称量好的两个瓶子，一瓶为1％(w/v)的蔗糖溶液，另一瓶为纯水，禁食，24h后，取走两瓶并称重，记录小鼠的总液体消耗，糖水消耗和纯水消耗。糖水偏好系数计算方式为：糖水偏好系数(％)＝糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)
×
100％。
[0053]
实验前，所有小鼠测量了糖水偏好基线，各组小鼠糖水基线无显著差异(图1a以及图6a)。造模后，如图1b和图6b所示，cums组糖水偏好系数均显著下降(p《0.01)，而美沙拉嗪组以及黄芩-黄连药对组糖水较模型组偏好系数均上升(p《0.01)。
[0054]
步骤三：小鼠强迫游泳实验
[0055]
强迫游泳实验仪器为一个装有纯净水的透明的圆形桶，直径12cm，水深25cm。纯水温度为23-25℃。仪器正前方装有摄像机，并与水面齐平。将小鼠放入水中后，采集其在水中6min的活动视频。采用分析软件分析视频后5min内小鼠的静止不动时间。静止不动行为定义为小鼠漂浮、不挣扎，或仅依靠偶尔摆动维持漂浮不动的行为。
[0056]
实验结果以平均值
±
标准误差表示，以t检验统计处理。
[0057]
强迫游泳实验结果如图2和图7。cums组的静止不动时间均显著多于空白组(p《0.05)。而美沙拉嗪组以及黄芩-黄连药对组的静止不动时间则均显著少于cums组(模型组)。
[0058]
经过以上动物实验模型验证，证明了美沙拉嗪口服可以增加小鼠的糖水偏好，缩短小鼠强迫游泳过程中的不动总时间，综上所述，美沙拉嗪对抑郁症具有确切的疗效。
[0059]
步骤四：小鼠血清与结肠组织中炎症因子测定实验
[0060]
elisa法检测空白、模型、美沙拉嗪组血清和结肠组织中炎性因子tnf-α和ifn-γ水平，结果见图3和图8。
[0061]
从图3和图8可知，与空白组比较，模型组血清与结肠组织中的促炎因子tnf-α和ifn-γ水平显著升高(p＜0.05)，表明cums造模可引起小鼠机体与局部结肠组织发生促炎症细胞因子的变化，美沙拉嗪组以及黄芩-黄连药对组均显著降低血清与结肠中tnf-α和ifn-γ(p＜0.05)，表明美沙拉嗪以及黄芩-黄连药对组治疗对抑郁小鼠的促炎因子有明显的影响，能显著降低其在血清与结肠组织中的水平。即本发明建立的是慢性抑郁症模型，检测到体内的肠道的促炎因子显著升高，采用抑制肠道炎症的药物能够治疗抑郁症。
[0062]
步骤五：免疫印迹方法检测结肠组织中ido1表达
[0063]
在冰上用ripa裂解液(北京索莱宝科技有限公司)裂解研磨后的各组小鼠结肠组织长达半小时，在4℃离心机上12000r/min离心15分钟。通过bca试剂盒(thermo scientific公司)测定蛋白浓度，蛋白变性后进行电泳和转膜，通过ido1抗体孵育后，进行蛋白定量分析，结果见图4和图9。
[0064]
从图4和图9可知，与空白组比较，模型组结肠组织中的ido1表达显著上升(p＜0.05)，表明cums造模可引起小鼠结肠组织ido1变化，美沙拉嗪组以及黄芩-黄连药对组均显著降低结肠中ido1表达(p＜0.05)，表明美沙拉嗪以及黄芩-黄连药对组对抑郁小鼠的ido1均有明显的影响，均能显著降低其结肠组织中的表达。
[0065]
步骤六：uplc-ms/ms色氨酸靶向代谢分析
[0066]
制备各组小鼠脑组织供试品溶液，结肠组织供试品溶液以及血清供试品溶液，加入内标液，混匀后，进行测样。
[0067]
向不同浓度(4000、2000、1000、500、200、100、5、2、1ng/ml)的混和标准溶液中加入相同体积的内标溶液，加入到ep管中，然后加入100ul的各项下各空白混合匀浆溶液，混合均匀后作为校准标准溶液，确定其峰面积为a，再在加入100ul的各项下各空白混合匀浆溶液，不再加入混和标准溶液和内标溶液，确定其峰面积b作为“空白基质背景效应”。由于组织中存在内源性神经递质及其前体化合物，因此应从每个校准点中减去它们的空白值。校准曲线由分析物峰面积(y，a-b)与相应浓度(x)的最小二乘线性回归分析建立，得到标准曲线。
[0068]
通过graphpad prism 7(graphpad software，san diego，ca，usa)软件对实验数
据进行统计分析，所有统计数据均以mean
±
sem表示，使用单因素方差分析(one-way anova)比较三组以上组数据，采用t检验比较两组数据，p《0.05时差异具有统计学意义。结果如图5和图10。
[0069]
从图5a和图10a可知，与空白组相比，模型组小鼠血清trp含量明显减少(p《0.001)；结肠组织trp水平显著增加(p《0.01)；模型组小鼠脑组织trp水平显著增加(p《0.05)；而美沙拉嗪组能显著逆转这一情况。如图5b和图10b所示，与空白组相比，模型组小鼠血清5-ht含量明显减少(p《0.05)；模型组小鼠结肠5-ht含量显著减少(p《0.01)；模型组小鼠脑5-ht含量显著减少(p《0.01)；美沙拉嗪组以及黄芩-黄连药对组对抑郁小鼠的5-ht有明显的影响，能显著增加其结肠、脑组织和血清中的表达。如图5c和图10c所示，与空白组相比，模型组小鼠血清kyn含量均明显减少(p《0.001)；模型组小鼠结肠kyn含量均显著增加(p《0.05)；模型组小鼠脑kyn含量显著增加(p《0.01)；而美沙拉嗪组以及黄芩-黄连药对组均能显著逆转这一情况。
[0070]
因此，从上述试验可以说明，cums造模过程中不仅会导致抑郁样行为的发生，还会引起外周炎症如肠道炎症的发生。而美沙拉嗪以及黄芩-黄连药对组，作为一个治疗肠道炎症的药物，在降低肠道炎症的同时，能够治疗抑郁。说明肠道炎症与抑郁症之间存在一定的关联。以炎症因子调节肠道ido1为作用靶点的药物能够有效治疗抑郁症，主要的原因可能如下：该药物能够抑制干扰素ifn-γ，抑制ido1的表达，然后影响色氨酸代谢，降低犬尿氨酸的活性，提高5-ht的水平，从而起到治疗抑郁症的作用。所以肠道炎症引起ido1过表达进而调控色氨酸代谢会导致抑郁症，而肠道炎症引起ido1表达也就可作为抗抑郁症药物的作用靶点，并应用于筛选具有潜在抗抑郁症功效的药物。
[0071]
在不出现冲突的前提下，本领域技术人员可以将上述附加技术特征自由组合以及叠加使用。
[0072]
以上所述仅为本发明的优选实施方式，只要以基本相同手段实现本发明目的的技术方案都属于本发明的保护范围之内。