胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法与流程

1.本发明涉及一种胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法，以及接种脂肪干细胞的 脱细胞外基质材料的制备方法，属于医用材料技术领域。


背景技术：

2.近年来随着生活水平的提高，人们越来越关注生活的质量。修复机体损伤的组织工程和 再生医学越来越受到人们的关注和研究。实现组织再生修复的基础是寻找合适的材料。脱细 胞外基质材料具有天然的三维空间结构，具有丰富的蛋白、多糖及细胞调控因子等成分，具 有良好的组织相容性，是最理想的生物材料之一。
3.目前脱细胞外基质的来源分为同种来源和异种来源。同种来源的优点是免疫原性相对较 低，跨物种病毒感染的风险小，缺点是来源难以保障，以及可能涉及一些伦理问题。异种来 源的脱细胞外基质的优点是材料易获得，成本低廉，无伦理方面的问题，缺点是免疫原性相 对较高，可能存在跨物种病毒等问题。
4.胎盘是人类分娩时的医疗废弃物，卫计委明文规定归产妇所有，所以产妇有权处理，不 存在伦理问题。胎盘组织含有丰富的造血干细胞、间充质干细胞等多种干细胞，是名副其实 的干细胞宝库，同时含有丰富的血管组织、羊膜组织，可以作为生物材料的来源。平滑绒毛 膜是胎盘羊膜下层的一层膜组织，含有丰富的血管组织。有许多文献提到平滑绒毛膜可以诱 导培养出间充质干细胞。
5.胎盘平滑绒毛膜组织脱去细胞后的外基质，三维结构非常适合人体自身的细胞迁移生长， 其自身所含的蛋白、多糖及细胞调控因子支持细胞的生长。另外胎盘绒毛膜面积较大，可以 根据需要，制备获得较大面积的脱细胞外基质。
6.脂肪干细胞来源于人的脂肪组织，具有取材方便，组织细胞增殖性高、免疫原性低、无 伦理争议等优点。人体自身脂肪组织富含脂肪干细胞，甚至在必要时，可以取少量自身脂肪 组织，在体外培养干细胞，然后移植回自身，进行机体修复或美容。脂肪干细胞被发现后， 受到广泛的研究，现被广泛用于医疗美容业和再生医学研究领域。


技术实现要素：

7.针对上述现有技术，本发明提供了一种胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法， 以及一种接种脂肪干细胞的脱细胞外基质材料的制备方法。
8.本发明是通过以下技术方案实现的：
9.胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法，包括以下步骤：
10.(一)胎盘样本的预处理：取胎盘样本，剔除淤血血块和破损组织块，用生理盐水反复 冲洗，直到生理盐水变清；清洗后，胎盘脐带面朝上放置，揭去胎盘羊膜，剪掉脐带。
11.胎盘样本处理应在万级二级生物实验室处理；胎盘应置于百级生物安全柜内用灭菌的不 锈钢器具盛放。
12.进一步地，对与胎盘样本同源的母血进行病毒检测，检测不合格的胎盘不予采用。
13.(二)平滑绒毛膜预处理：选取完整平滑无硬块的区域，剪下平滑绒毛膜组织，剔除平 滑绒毛膜组织上的红色毛细血管组织，用生理盐水反复涮洗平滑绒毛膜组织，直到洗涤液变 清。
14.进一步地，所述平滑绒毛膜组织的尺寸大于等于25cm2。
15.(三)反复冻融脱细胞：上述清洗的平滑绒毛膜组织，加入适量生理盐水，置于液氮中 使其快速冷冻，取出，解冻；重复冷冻、解冻过程1～3次。
16.具体操作方式如下：
17.(1)上述清洗的平滑绒毛膜组织，取适量置入50ml规格的corning离心管中，加入生 理盐水至40ml，旋紧盖子，用封口膜封口，在管壁上标记样本信息；
18.(2)离心管放入液氮中10分钟，使样本快速结冰；
19.(3)用夹子取出离心管，置于37℃恒温摇床上解冻：200rpm/min，震荡10分钟，使冰 块完全融化；
20.(4)重复(2)和(3)，重复2次。
21.(四)裂解液裂解细胞：上述处理的平滑绒毛膜组织，加入裂解液，37℃恒温摇床上裂 解细胞30min；
22.所述裂解液，选自triton x-100溶液，浓度为0.5～2.0％(质量体积分数，g/ml)，优 选1％。
23.(五)超声法进一步脱细胞：上述处理的平滑绒毛膜组织，进行超声处理；用生理盐水 清洗残留的裂解液和脱落的组织，重复清洗1～3遍；
24.所述超声处理的具体参数为：水温40℃，超声处理2分钟后，停止，晃动离心管，再继 续超声2分钟。
25.所述进行超声处理的超声波清洗仪的超声频率为28khz，功率200w。
26.(六)酶消化去除细胞碎片：上述处理的平滑绒毛膜组织，沥干水分，加入混合酶溶液， 37℃下恒温摇床消化；
27.所述混合酶溶液，是由以下浓度的酶组成的：0.1％的胶原酶ⅰ(质量体积分数，g/ml)， 0.25％的胰蛋白酶(质量体积分数，g/ml)，中性脂肪酶5～10u/ml，dnase 100u/ml，rnase 100μg/ml，溶剂为水。
28.具体操作方式为：将平滑绒毛膜组织置入50ml离心管中，加入混合酶溶液，定容到40ml， 37℃恒温摇床200rpm/min的速率，消化50min。
29.(七)洗涤组织去除酶残留：上述处理的平滑绒毛膜组织，用生理盐水冲洗，加入甘油 或甘油溶液，离心，弃去上清液以去除酶残留，对上清液进行微生物检测，应检测不出微生 物。
30.具体操作方式为：将平滑绒毛膜组织置于带底座的100目不锈钢筛网上，用生理盐水冲 洗，正反面各冲洗3遍；将平滑绒毛膜组织置于50ml离心管中，加20％的甘油溶液(体积百 分数)至40ml，盖紧盖子封口，颠倒混匀，1000rpm/min瞬时离心，上清液做微生物检测； 弃去多余的上清液。
31.(八)保存：上述处理的平滑绒毛膜组织，即为脱细胞外基质生物材料，可以新鲜使用； 若需要长期保存，则加入适量的40％甘油溶液(体积百分数)，封口保存，标记样本信息，置 于-80℃深低温冰箱或者液氮罐中长期保存。
32.进一步地，所述胎盘样本，在收集时应满足以下条件：
33.(1)样本收集之前必须和产妇及家属签订知情同意书和协议；胎盘样本必须是用含有双 抗的pbs储运液浸泡的储运盒保存；样本必须在48小时内到达实验室；运输的温度必须在4～ 25℃；
34.(2)胎盘样本采集之前要调研产妇的健康状况；凡是有乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、巨噬 细胞细胞病毒等传染性疾病的样本不得收集；
35.(3)胎盘样本应该是完好无损的；若胎盘平滑绒毛膜撕裂严重，无完整的区域可供取样， 该胎盘样本不予接收；
36.(4)随样本应该有母亲外周血一管，用于病毒检测。
37.一种接种脂肪干细胞的脱细胞外基质材料的制备方法，先制备胎盘平滑绒毛膜脱细胞外 基质材料，再接种脂肪干细胞，具体包括以下步骤：
38.a.制备胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料，包括以下步骤：
39.(一)胎盘样本的预处理：取胎盘样本，剔除淤血血块和破损组织块，用生理盐水反复 冲洗，直到生理盐水变清；清洗后，胎盘脐带面朝上放置，揭去胎盘羊膜，剪掉脐带。
40.胎盘样本处理应在万级二级生物实验室处理；胎盘应置于百级生物安全柜内用灭菌的不 锈钢器具盛放。
41.进一步地，对与胎盘样本同源的母血进行病毒检测，检测不合格的胎盘不予采用。
42.(二)平滑绒毛膜预处理：选取完整平滑无硬块的区域，剪下平滑绒毛膜组织，剔除平 滑绒毛膜组织上的红色毛细血管组织，用生理盐水反复涮洗平滑绒毛膜组织，直到洗涤液变 清。
43.进一步地，所述平滑绒毛膜组织的尺寸大于等于25cm2。
44.(三)反复冻融脱细胞：上述清洗的平滑绒毛膜组织，加入适量生理盐水，置于液氮中 使其快速冷冻，取出，解冻；重复冷冻、解冻过程1～3次。
45.具体操作方式如下：
46.(1)上述清洗的平滑绒毛膜组织，取适量置入50ml规格的corning离心管中，加入生 理盐水至40ml，旋紧盖子，用封口膜封口，在管壁上标记样本信息；
47.(2)离心管放入液氮中10分钟，使样本快速结冰；
48.(3)用夹子取出离心管，置于37℃恒温摇床上解冻：200rpm/min，震荡10分钟，使冰 块完全融化；
49.(4)重复(2)和(3)，重复2次。
50.(四)裂解液裂解细胞：上述处理的平滑绒毛膜组织，加入裂解液，37℃恒温摇床上裂 解细胞30min；
51.所述裂解液，选自triton x-100溶液，浓度为0.5～2.0％(质量体积分数，g/ml)，优 选1％。
52.(五)超声法进一步脱细胞：上述处理的平滑绒毛膜组织，进行超声处理；用生理盐水 清洗残留的裂解液和脱落的组织，重复清洗1～3遍；
53.所述超声处理的具体参数为：水温40℃，超声处理2分钟后，停止，晃动离心管，再继 续超声2分钟。
54.所述进行超声处理的超声波清洗仪的超声频率为28khz，功率200w。
细胞筛，当细胞筛即将装满时，换另外一个细胞筛。
74.(四)组织贴瓶：上述细胞筛收集的脂肪细胞，置于培养瓶中贴壁培养。
75.具体操作方式如下：
76.(1)用细胞刮刀将细胞筛上的收集的组织转移到t175培养瓶中，按照1cm
×
1cm的间 距接种，每个接种点组织块绿豆大小；
77.(2)将培养瓶置于37℃，5％浓度二氧化碳培养箱中，贴壁1h，组织贴附在培养面上； 从非培养面加入25ml添加血清替代物的无血清培养基。
78.(五)传代和换液：培养至组织块上爬出的细胞80％～90％愈合，进行传代培养；培养过 程中定期换液。
79.具体操作方式如下：
80.(1)二氧化碳培养箱中培养4天，全量换液，加完全培养基继续培养，直到组织块上爬 出的细胞80％～90％愈合，进行传代；
81.(2)传代每瓶用3.5ml胰蛋白酶室温消化3分钟，然后用旧培养基10ml终止胰酶反应；
82.(3)1500rpm离心5分钟，去上清，用完全培养基重悬合并到一管，取样计数，细胞 表型流式检测，其它细胞备用。
83.进一步地，所述脂肪组织，在收集时应满足以下条件：
84.(1)样本收集之前必须和捐献者签订知情同意书和协议；
85.(2)脂肪组织收集之前要提供者的健康状况，凡是有乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、巨噬细 胞细胞病毒等传染性疾病的样本不得收集；
86.(3)脂肪组织外观检查应该是未受到杂质污染的；
87.(4)随样本应该有捐献者外周血一管，用于病毒检测。
88.c.接种脂肪干细胞：将脂肪干细胞接种到上述制备的胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质上面， 待细胞生长融合度到80％时，收取组织，进行移植或长期冻存；具体包括以下步骤：
89.(一)脱细胞外基质接种脂肪干细胞：向步骤a制得的脱细胞外基质上接种脂肪干细胞。
90.具体操作方式如下：
91.(1)脱细胞外基质的包被：将制备的脱细胞外基质从保护液中取出，用生理盐水冲洗三 遍；用灭菌的医用纱布吸干组织表面的水份；将吸干水份的脱细胞外基质浸泡在纤连蛋白溶 液中，37℃处理8～12h；将脱细胞外基质取出，沥干液体，放在大培养皿中晾一个小时， 备用；
92.所述纤连蛋白溶液，浓度为10μg/ml(纤连蛋白从sigma公司购买，包装规格1mg，用 pbs缓冲液配制成浓度为10μg/ml的溶液)；
93.(2)制得的脱细胞外基质置于直径15cm的一次性培养皿上，平整的摊开，按照2
×
104/ml 细胞密度，接种上述b制备的脂肪干细胞中，一个培养面接种25ml。
94.(二)脂肪干细胞接种后培养：待细胞生长融合度到80％时，收取组织。
95.具体操作方式如下：
96.(1)将培养皿置于二氧化碳培养箱中培养，每三天进行半量换液或者全量换液；
97.(2)倒置显微镜观察培养皿内细胞长势，待到组织边缘上的细胞长到80％愈合时，收取 组织。
98.(三)获取培养物：收取组织前，吸干培养皿中的培养基，做微生物检测，用生理盐水 润洗组织三遍，借用镊子和细胞刮刀，轻轻将组织从培养皿中分离下来，即为接种脂肪干细 胞的脱细胞外基质材料。
99.(四)出库或冻存：根据实际需求培养物新鲜出库或者冻存，组织出库时，用含dmem的 储运瓶保存，应该在8h内送到医生手上，储运温度应该在4～25℃；如果最终成品需要长期 保存则应该执行冻存操作，将长满细胞的组织转入到50ml离心管中，加入40％的甘油溶液， 2～8℃冰箱放置30min，转入-80℃深低温冰箱过夜，然后转入液氮中。
100.本发明的接种脂肪干细胞的脱细胞外基质材料，具有低免疫原性和干细胞的活性，可以 减少排斥作用，支持新的皮肤细胞生长，脂肪层和毛细血管再生速度更快，加速完整功能新 皮肤组织的生成，是一种高端的修复材料。可用于多种组织的修复，如难愈创面、疝气、肛 瘘、尿道、膀胱、子宫壁修复等。具体应用时，可以新鲜使用，也可以进行深低温保存，有 需要时进行复温。产品尺寸大小，脂肪干细胞接种量可以根据临床需要调整，个性化定制产 品，以满足客户需求。
101.本发明的接种脂肪干细胞的脱细胞外基质材料，接种在脱细胞外基质上的脂肪干细胞和 外基质结合紧密，干细胞不容易流失，干细胞数量可控。细胞均匀分散在外基质上，能避免 干细胞抱团或空洞情况，产品质量可靠。
102.本发明具有以下有益效果：
103.(1)材料来源于自体胎盘组织和人体脂肪干细胞，材料的免疫原性都很低，不会引起排 斥作用，且不存在伦理和法律风险。
104.(2)材料来源于人体胎盘组织，相对于其他动物来源的生物材料，具有更低的免疫原性。
105.(3)胎盘平滑绒毛膜的厚度高于膀胱或胎盘羊膜的厚度，制成的脱细胞外基质材料厚度 和强度作为敷料和填充材料合适。
106.(4)本发明的制备方法，大大缩短了制备时间，极大地提高了制备效率，可以批量化和 标准化制备，制备过程可以控制和追溯。
107.(5)脂肪干细胞的制备采取离心和贴壁诱导的方法，不同于常用的酶消化法，得到的脂 肪干细胞活性高，增殖快。
108.(6)经过包被处理的脱细胞外基质，接种脂肪间充质干细胞，细胞贴壁效果好，细胞能 长满整个脱细胞外基质的表面，贴合牢固，可以避免珍贵的细胞流失。
109.本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
110.图1：初步处理的胎盘示意图。
111.图2：去除血管和羊膜的平滑绒毛膜组织示意图。
112.图3：脱细胞后的平滑绒毛膜组织示意图。
113.图4：爬出细胞的脂肪组织示意图。
114.图5：脱细胞基质接种脂肪干细胞示意图(长满)。
具体实施方式
115.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。 本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各 种变化和修饰。
116.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常 规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测 方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
117.实施例1制备接种脂肪干细胞的脱细胞外基质材料
118.先制备胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料，再接种脂肪干细胞，具体包括以下步骤：
119.a.制备胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料，步骤如下：
120.(一)胎盘样本的预处理：取胎盘样本，剔除淤血血块和破损组织块，如图1所示，用 生理盐水反复冲洗，直到生理盐水变清；清洗后，胎盘脐带面朝上放置，揭去胎盘羊膜，剪 掉脐带。
121.胎盘样本在万级二级生物实验室处理；胎盘置于百级生物安全柜内用灭菌的不锈钢器具 盛放。
122.对与胎盘样本同源的母血进行病毒检测，检测不合格的胎盘不予采用。
123.所述胎盘样本，在收集时满足以下条件：
124.(1)样本收集之前必须和产妇及家属签订知情同意书和协议；胎盘样本必须是用含有双 抗的pbs储运液浸泡的储运盒保存；样本必须在48小时内到达实验室；运输的温度必须在4～ 25℃；
125.(2)胎盘样本采集之前要调研产妇的健康状况；凡是有乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、巨噬 细胞细胞病毒等传染性疾病的样本不得收集；
126.(3)胎盘样本应该是完好无损的；若胎盘平滑绒毛膜撕裂严重，无完整的区域可供取样， 该胎盘样本不予接收；
127.(4)随样本应该有母亲外周血一管，用于病毒检测。
128.(二)平滑绒毛膜预处理：选取完整平滑无硬块的区域，剪下平滑绒毛膜组织(尺寸约 为25cm2)，剔除平滑绒毛膜组织上的红色毛细血管组织，如图2所示，用生理盐水反复涮洗 平滑绒毛膜组织，直到洗涤液变清。
129.(三)反复冻融脱细胞：
130.(1)上述清洗的平滑绒毛膜组织，取适量置入50ml规格的corning离心管中，加入生 理盐水至40ml，旋紧盖子，用封口膜封口，在管壁上标记样本信息；
131.(2)离心管放入液氮中10分钟，使样本快速结冰；
132.(3)用夹子取出离心管，置于37℃恒温摇床上解冻：200rpm/min，震荡10分钟，使冰 块完全融化；
133.(4)重复(2)和(3)，重复2次。
134.(四)裂解液裂解细胞：上述处理的平滑绒毛膜组织，加入裂解液，37℃恒温摇床上裂 解细胞30min；
135.所述裂解液，选自1％的triton x-100溶液。
136.(五)超声法进一步脱细胞：上述处理的平滑绒毛膜组织，进行超声处理；用生理盐水 清洗残留的裂解液和脱落的组织，重复清洗3遍；
137.所述超声处理的具体参数为：水温40℃，超声处理2分钟后，停止，晃动离心管，再继 续超声2分钟。
138.(六)酶消化去除细胞碎片：上述处理的平滑绒毛膜组织，沥干水分，置入50ml离心管 中，加入混合酶溶液，定容到40ml，37℃恒温摇床200rpm/min的速率，消化50min；
139.所述混合酶溶液，是由以下浓度的酶组成的：0.1％的胶原酶ⅰ(质量体积分数，g/ml)，0.25％的胰蛋白酶(质量体积分数，g/ml)，中性脂肪酶8u/ml，dnase 100u/ml，rnase 100 μg/ml，溶剂为水。
140.(七)洗涤组织去除酶残留：上述处理的平滑绒毛膜组织，置于带底座的100目不锈钢 筛网上，用生理盐水冲洗，正反面各冲洗3遍；将平滑绒毛膜组织置于50ml离心管中，加 20％的甘油溶液(体积百分数)至40ml，盖紧盖子封口，颠倒混匀，1000rpm/min瞬时离心， 上清液做微生物检测；弃去多余的上清液。
141.(八)保存：上述处理的平滑绒毛膜组织，即为脱细胞外基质生物材料，如图3所示， 可以新鲜使用；若需要长期保存，则加入适量的40％甘油溶液(体积百分数)，封口保存，标 记样本信息，置于-80℃深低温冰箱或者液氮罐中长期保存。
142.b.制备脂肪干细胞：取脂肪组织(美容院提供的女性大腿部脂肪组织，供体健康无传染 性疾病，签署知情同意书)，经过机械处理，酶消化和贴壁培养制备获取脂肪干细胞，具体步 骤如下：
143.(一)脂肪样本的清洗：
144.(1)将脂肪组织从储运瓶中取出，置于直径15cm的一次性细胞培养皿中，用生理盐水 浸润脂肪组织，用灭菌的不锈钢手术镊和手术剪刀将组织剪成小薄片状，用镊子轻轻刮压组 织，血管中残留的血液和凝块被挤出组织，初步去除血液和凝块等杂质；
145.(2)用含有青霉素和链霉素的双抗的生理盐水，反复清洗组织，直到洗液颜色变清澈。
146.(二)脂肪样本的预处理：
147.将脂肪组织置于50ml离心管中，用灭菌的不锈钢手术剪剪成乳糜状，组织颗粒的直径在 1～3mm。
148.(三)离心去除脂肪：采用离心的方式去除脂肪，采用细胞筛收集脂肪细胞，具体操作 方式如下：
149.(1)上述处理的脂肪组织，生理盐水补齐至40ml，颠倒混匀，350g离心力瞬时离心， 用移液管吸去界面层上方的油脂和漂浮组织；
150.(2)用生理盐水定容到40ml，重复步骤(1)一遍，进一步去除脂肪；
151.(3)向离心管中加入dmem培养基，定容到40ml，350g离心力，瞬时离心，用移液管吸 去界面上的液体；
152.(4)取离心管，管口放置一个100μm细胞筛，用移液管吸取上述处理的脂肪组织，过 细胞筛，当细胞筛即将装满时，换另外一个细胞筛。
153.(四)组织贴瓶：上述细胞筛收集的脂肪细胞，置于培养瓶中贴壁培养，具体操作方式 如下：
154.(1)用细胞刮刀将细胞筛上的收集的组织转移到t175培养瓶中，按照1cm
×
1cm的间 距接种，每个接种点组织块绿豆大小；
155.(2)将培养瓶置于37℃，5％浓度二氧化碳培养箱中，贴壁1h，组织贴附在培养面上； 从非培养面加入25ml添加血清替代物的无血清培养基。
156.(五)传代和换液：培养至组织块上爬出的细胞80％～90％愈合，进行传代培养；培养过 程中定期换液，具体操作方式如下：
157.(1)二氧化碳培养箱中培养4天，全量换液，加完全培养基继续培养，直到组织块上爬 出的细胞80％～90％愈合，如图4所示，进行传代；
158.(2)传代每瓶用3.5ml胰蛋白酶室温消化3分钟，然后用旧培养基10ml终止胰酶反应；
159.(3)1500rpm离心5分钟，去上清，用完全培养基重悬合并到一管，取样计数，细胞 表型流式检测，其它细胞备用。
160.所述脂肪组织，在收集时应满足以下条件：
161.(1)样本收集之前必须和捐献者签订知情同意书和协议；
162.(2)脂肪组织收集之前要提供者的健康状况，凡是有乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、巨噬细 胞细胞病毒等传染性疾病的样本不得收集；
163.(3)脂肪组织外观检查应该是未受到杂质污染的；
164.(4)随样本应该有捐献者外周血一管，用于病毒检测。
165.c.接种脂肪干细胞：将脂肪干细胞接种到上述制备的胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质上面， 待细胞生长融合度到80％时，收取组织，进行移植或长期冻存；具体步骤如下：
166.(一)脱细胞外基质接种脂肪干细胞：向步骤a制得的脱细胞外基质上接种脂肪干细胞， 具体操作方式如下：
167.(1)脱细胞外基质的包被：将制备的脱细胞外基质从保护液中取出，用生理盐水冲洗三 遍；用灭菌的医用纱布吸干组织表面的水份；将吸干水份的脱细胞外基质浸泡在纤连蛋白溶 液中，37℃处理8～12h；将脱细胞外基质取出，沥干液体，放在大培养皿中晾一个小时， 备用；
168.所述纤连蛋白溶液，浓度为10μg/ml(纤连蛋白从sigma公司购买，包装规格1mg，用 pbs缓冲液配制成浓度为10μg/ml的溶液)；
169.(2)制得的脱细胞外基质置于直径15cm的一次性培养皿上，平整的摊开，按照2
×
104/ml 细胞密度，接种上述b制备的脂肪干细胞中，一个培养面接种25ml。
170.(二)脂肪干细胞接种后培养：待细胞生长融合度到80％时，收取组织，具体操作方式 如下：
171.(1)将培养皿置于二氧化碳培养箱中培养，每三天进行半量换液或者全量换液；
172.(2)倒置显微镜观察培养皿内细胞长势，待到组织边缘上的细胞长到80％愈合时，收取 组织。
173.(三)获取培养物：收取组织前，吸干培养皿中的培养基，做微生物检测，用生理盐水 润洗组织三遍，借用镊子和细胞刮刀，轻轻将组织从培养皿中分离下来，即为接种脂肪干细 胞的脱细胞外基质材料，如图5所示。
174.(四)出库或冻存：根据实际需求培养物新鲜出库或者冻存，组织出库时，用含dmem
的 储运瓶保存，应该在8h内送到医生手上，储运温度应该在4～25℃；如果最终成品需要长期 保存则应该执行冻存操作，将长满细胞的组织转入到50ml离心管中，加入40％的甘油溶液， 2～8℃冰箱放置30min，转入-80℃深低温冰箱过夜，然后转入液氮中。
175.给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方 案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权 利要求的范围内。