毛花苷C作为Beclin1的激活剂在制备抗肝癌药物中的应用的制作方法

毛花苷c作为beclin1的激活剂在制备抗肝癌药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及毛花苷c作为beclin1的激活剂在制备抗肝癌药物中的应用。


背景技术：

2.自噬是一种高度保守的依赖于溶酶体的真核细胞内物质分解代谢的途径，通过该过程细胞内的成分被循环利用或产生能量，维持体内平衡。自噬过程开始于自噬小体形成部位双层隔离膜的产生，然后膜边缘伸长和闭合形成自噬小体，最后自噬小体与包含多种酸性水解酶的溶酶体融合，形成自噬溶酶体，从而使内膜中包裹的内容物降解。其中，细胞内形成的泛素样复合物atg12-atg5-atg16行使泛素连接酶的功能，该复合物与atg8/lc3泛素样结合系统协调完成自噬小体的延伸和闭合过程，并促使lc3
‑ⅰ
与磷脂酰乙醇胺偶联转化为lc3
‑ⅱ
，后者作为自噬体中存在的完整膜蛋白，被认为是自噬可靠标志物。自噬小体的形成是自噬的关键环节，而beclin1是自噬小体形成的关键蛋白。哺乳动物自噬基因beclin1是酵母中atg6/液泡分选蛋白(vps)-30的一个同源基因，1998年由beth-levine小组通过酵母双杂交筛选获得。beclin1可作为支架蛋白与vps34及其调节单位vps15结合为vps34-vps15-beclin1复合体而形成催化核心区，促进磷脂酰肌醇-3-磷酸盐的生成，并以此调节自噬小体膜的合成与物质的转运。在40％-75％的乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中，beclin1基因是单等位基因缺失的，并且多数研究认为，在膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌等癌症中，beclin1的高表达或阳性表达可以发挥抑瘤作用。
3.毛花苷c是由毛花洋地黄中提取的一种速效强心苷，属于从植物中提取的类固醇衍生物，具有抑制细胞膜na
+
和k
+
交换的能力，广泛用于治疗抗心律失常和心力衰竭。20世纪80年代前后，研究者发现强心苷可以明显抑制肿瘤细胞增殖，具有广谱抗肿瘤活性，并对人源肿瘤表现出一定的选择性。研究表明，强心苷类药物能够通过诱导自噬起到对乳腺癌及肺癌等恶性肿瘤的抗癌作用，显示出毛花苷c在抗肿瘤治疗中的潜力。然而，目前毛花苷c是否能有效激活beclin1，并抑制肝癌huh-7细胞增殖尚不清楚。


技术实现要素：

4.本发明旨在解决上述技术问题，提供毛花苷c作为beclin1的激活剂在制备抗肝癌药物中的应用。
5.本发明的技术方案为：
6.毛花苷c作为beclin1的激活剂在制备抗肝癌药物中的应用。
7.所述毛花苷c通过上调beclin1蛋白的表达，促进lc3ⅰ向lc3ⅱ的转化，促进细胞自噬小体的形成，并抑制肝癌huh-7细胞的增殖。
8.作为本发明优选的技术方案，本发明提供了毛花苷c在制备促进肝癌细胞自噬的药物中的应用。
9.作为本发明优选的技术方案，本发明提供了毛花苷c在制备上调肝癌细胞自噬相
关蛋白表达量的药物中的应用，所述细胞自噬相关蛋白为beclin1或/和lc3ⅱ。
10.作为本发明优选的技术方案，本发明提供了毛花苷c在制备抑制肝癌huh-7细胞增殖的药物中的应用。
11.作为本发明优选的技术方案，本发明提供了毛花苷c在制备抑制肝癌huh-7细胞克隆形成的药物中的应用。
12.本发明还提供了一种产品，其活性成分为毛花苷c，所述产品的用途为如下(1)-(5)中的至少一种：
13.(1)激活beclin1；
14.(2)促进肝癌细胞自噬小体形成；
15.(3)上调肝癌细胞自噬相关蛋白表达量；
16.(4)抑制肝癌huh-7细胞增殖；
17.(5)抑制肝癌huh-7细胞克隆形成。
18.由于采用上述技术方案，本发明的有益效果如下：
19.本发明通过研究，发现毛花苷c对肝癌huh-7细胞具有增殖抑制作用，并呈剂量效应相关性；且毛花苷c促进lc3-i向lc3-ii转化，并上调beclin1蛋白的表达；同时，明显地诱导huh-7细胞自噬小体形成。本发明为研制新的以beclin1为靶向的抗肝癌候选药物提供了科学依据，对肝癌患者的治疗具有重要意义。
附图说明
20.图1是毛花苷c的化学结构式；
21.图2是ic50实验结果图；
22.图3是毛花苷c对肝癌huh-7细胞增殖的抑制作用图；
23.图4是毛花苷c对肝癌huh-7细胞克隆形成的抑制作用图；其中，图a为结晶紫染色结果图；图b为结晶紫染色图像对应的560nm处od值结果分析图；
24.图5是毛花苷c对肝癌huh-7细胞自噬相关蛋白的表达影响图；其中，图a为毛花苷c对细胞自噬相关蛋白表达的免疫印迹实验结果图；图b为beclin1、lc3ⅱ/ⅰ的量化灰度值结果图；
25.图6是毛花苷c对肝癌huh-7细胞自噬小体形成的影响图；其中，图a为激光共聚焦显微镜观测结果图；图b为gfp-lc3荧光分析结果图。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
27.本发明通过细胞增殖实验、细胞克隆形成实验、western blot实验、激光共聚焦检测研究毛花苷c对肝癌huh-7细胞增殖、自噬相关蛋白及自噬小体形成的影响。
28.本发明使用的毛花苷c购自sigma公司；人肝癌huh-7细胞株，购自中科院上海生物科学研究所细胞资源中心。
29.实施例1、药物ic50实验
30.(1)胰酶室温常规消化细胞后，用含fbs的dmem培养基吹打成分布均匀的单细胞悬
液，以每孔4000个细胞的密度接种于96孔板中，继续培养于37℃、5％co2培养箱中；
31.(2)细胞贴壁生长24h后，加入毛花苷c使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/ml，对照组给予等体积的dmso(即用溶解20μg/ml毛花苷c的dmso剂量)，培养细胞1d；
32.(3)弃细胞培养液，每孔加入cck-8溶液10μl，继续培养2h；
33.(4)应用酶标仪测定450nm处吸光值，比较不同剂量干预后对细胞增殖抑制的影响，细胞增殖抑制率计算公式：增殖抑制率(％)＝(1－药物组d450nm值/对照组d450nm值)
×
100％。
34.检测结果如图2所示，药物ic50实验结果显示，与对照组相比，毛花苷c对肝癌细胞huh-7的增殖具有明显的抑制作用，其ic50-24h为(0.95
±
0.08)μg/ml。
35.实施例2、细胞增殖实验(cck-8)检测不同浓度的毛花苷c在不同时间下对肝癌huh-7细胞增殖的抑制作用
36.(1)胰酶室温常规消化细胞后，用含fbs的dmem培养基吹打成分布均匀的单细胞悬液，以每孔2000个细胞的密度接种于96孔板中，继续培养于37℃、5％co2培养箱中；
37.(2)细胞贴壁生长24h后，加入毛花苷c使其终浓度为0.078、0.156、0.312、0.625、1.25μg/ml，对照组给予等体积的dmso(即用溶解1.25μg/ml毛花苷c的dmso剂量)，培养细胞2h，1d、2d、3d、4d、5d；
38.(3)弃细胞培养液，每孔加入cck-8溶液10ul，继续培养2h；
39.(4)应用酶标仪测定450nm处吸光值，比较不同剂量干预后对细胞活力抑制的影响，细胞增殖抑制率计算公式：增殖抑制率(％)＝(1－药物组d450nm值/对照组d450nm值)
×
100％。
40.结果检测如图3所示，cck-8检测结果显示，与对照组相比，可发现毛花苷c对huh-7细胞增殖的抑制作用随着毛花苷c浓度的增加而明显。加药2d时，0.078、0.156、0.312、0.625、1.25μg/ml毛花苷c对huh-7细胞生长抑制率分别为(22.71
±
1.78)％、(29.15
±
3.03)％、(42.79
±
1.13)％、(58.46
±
0.98)％、(68.07
±
1.57)％。
41.实施例3、细胞克隆形成实验检测毛花苷c对肝癌huh-7细胞克隆形成的影响
42.(1)胰酶室温常规消化细胞后，用含fbs的dmem培养基吹打成分布均匀的单细胞悬液，以每孔2000个细胞的密度接种于6孔板中，继续培养于37℃、5％co2培养箱中；
43.(2)培养9d后，添加毛花苷c进行干预，使其终浓度为0.625μg/ml，对照组给予等体积的dmso(即用溶解0.625μg/ml毛花苷c的dmso剂量处理细胞)，继续培养7d；
44.(3)弃上层培养液，pbs液洗板2次；
45.(4)用4％多聚甲醛固定细胞15min，弃多聚甲醛液；
46.(5)结晶紫溶液染色15min，清水常规浸洗，室温晾干；
47.(6)采集染色的图像并保存；
48.(7)每孔加入2ml10％的冰醋酸溶液溶解结晶紫；
49.(8)每孔取100μl置于96孔板中，使用酶标仪检测测定560nm波长处吸光值，细胞克隆抑制率公式：克隆抑制率(％)＝(1－药物组d560nm值/对照组d560nm值)
×
100％。
50.结果检测如图4所示。与对照组相比，毛花苷c(0.625μg/ml)干预后，结晶紫阳性染色明显减少，且560nm处od值检测结果与对照组比较显著降低。huh-7细胞的克隆形成率显
著降低，克隆形成的抑制率结果为(95.46
±
0.45)％，体现出毛花苷c具有良好的体外抗肿瘤效应。
51.实施例4、western blot实验检测毛花苷c对肝癌huh-7细胞自噬相关蛋白的改变
52.(1)将huh-7细胞室温消化后接种于培养皿中，24h贴壁后，加入毛花苷c干预，使其终浓度为0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5μg/ml，作用1d后收集细胞；
53.(2)加入ripa细胞裂解液于冰盒上4℃静置30min，收集细胞裂解液；
54.(3)取2μl上清液用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度；
55.(4)在蛋白样品中加入上样缓冲液混匀后，95℃金属浴10min，冰上放置10min后，保存于-20℃冰箱备用；
56.(5)电泳：取出蛋白样品，采用sds-page凝胶电泳方法分离总蛋白样品。
57.(6)采用半干转将蛋白转移至pvdf膜；
58.(7)封闭、孵育一抗：用5％脱脂奶粉(1
×
tbst配制)于室温摇床封闭1h，4℃孵育一抗过夜；
59.(8)tbst洗膜5次，每次10min；
60.(9)封闭、孵育二抗：用5％脱脂奶粉(1
×
tbst配制)于室温摇床封闭0.5h，室温孵育二抗1.5h，tbst洗膜5次，每次10min；
61.(10)tbst洗膜5次，每次10min；
62.(11)ecl发光液反应2-3min后，x线片曝光、显影、定影；
63.(12)采用gel-proanalyzer图像分析系统计算分析x线片吸光度值。
64.结果检测如图5所示，huh-7细胞在0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5μg/ml的毛花苷c干预24h后，蛋白免疫印迹实验证实，与对照组相比，毛花苷c促进i型微管相关蛋白轻链3(lc3-i)向ii型微管相关蛋白轻链3(lc3-ii)的转化(量化灰度值：lc3
‑ⅰ
：con：0.44
±
0.05；lan-0.078：0.84
±
0.04；lc3
‑ⅱ
：con：0.11
±
0.01；lan-0.078：0.68
±
0.06；lc3
‑ⅱ
/lc3
‑ⅰ
：con：0.25
±
0.01；lan-0.078：0.82
±
0.03)，上调beclin1蛋白的表达(量化灰度值：con：0.44
±
0.02；lan-0.078：0.52
±
0.02)。
65.实施例5、激光共聚焦显微镜观测毛花苷c对肝癌huh-7细胞自噬小体形成的影响
66.(1)胰酶室温常规消化稳定过表达gfp-lc3b的huh-7细胞后，用含fbs的dmem高糖培养基吹打成分布均匀的单细胞悬液，按每孔1
×
105个细胞的密度接种于35mm激光共聚焦观测培养皿中，继续培养于恒温培养箱中；
67.(2)细胞贴壁24h后，加入毛花苷c使其终浓度为0.625μg/ml，对照组给予等体积的dmso(即用溶解0.625μg/ml毛花苷c的dmso剂量处理细胞)，再继续培养1d；
68.(3)使用-20℃预冷的无水甲醇进行细胞固定，pbs漂洗3次，每次5min；
69.(4)dapi染色，pbs漂洗3次，每次5min；
70.(5)使用荧光抗淬灭剂进行封片，通过激光共聚焦显微镜采集图像，gfp检测波长为510-550nm，dapi检测波长为450-470nm。
71.结果检测如图6所示，对gfp-lc3稳定表达的huh-7细胞进行毛花苷c(0.625μg/ml)干预，24h后使用激光共聚焦显微镜进行观测。结果显示，与对照组相比，毛花苷c可以促进gfp-lc3的聚集，在细胞内形成的绿色荧光富集区(荧光读数：con：2.64
±
0.60；lana：7.44
±
0.73)，提示毛花苷c可以促进自噬小体形成。
72.以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容。对于本发明所述技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，进行多样的变更以及修改，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。