乙醇胺在制备预防、缓解和/或治疗神经炎症相关疾病的产品中的应用的制作方法

1.本发明属于医药领域，涉及乙醇胺的新用途，具体涉及乙醇胺在制备预防、缓解和/或治疗神经炎症相关疾病的产品中的应用。


背景技术：

2.炎症反应失调会导致组织器官损伤，从而促使疾病发生发展。神经系统的炎症反应，即“神经炎症”，具有其独特的特征，存在于中枢神经系统疾病的神经退行性疾病中，包括多发性硬化症(ms)、帕金森氏病(pd)、肌萎缩性侧索硬化症(als)、亨廷顿氏病(hd)等，以及眼科疾病，如视神经损伤、糖尿病视网膜病变(dr)和青光眼等。在相关疾病中，尽管发病原因各异，例如中风、缺氧、遗传因素、感染、神经毒素、异常蛋白质的聚集、创伤或免疫介导等，但这些疾病均以进行性神经元功能障碍为特征且具有共同的慢性免疫反应过程。
3.炎症反应介导的神经退行性病变主要是由小胶质细胞的活化继而导致炎症因子如no、ros、tnf-α、il-1β等过量释放所引起的。小胶质细胞是中枢神经系统(central nervous system，cns)中神经胶质细胞的主要类型之一，发挥着巨噬细胞的功能，参与cns的免疫反应。静息状态下，小胶质细胞呈分枝状，时刻监视着其周围微环境的各种病理变化，在各种损伤因素的刺激下，小胶质细胞立即激活，并改变其形态进而向病变区域迁移，发挥着保护和损伤组织的双重作用:一方面，小胶质细胞通过吞噬异己成分、分泌神经营养因子等促进神经细胞存活和组织再生，而另一方面，小胶质细胞的过度活化也可能通过分泌细胞毒性物质，例如白介素(interleukin，il)－1、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，tnf)－α等诱导神经元凋亡，进而加重组织损伤。
4.以糖尿病视网膜病变为例，其最常见的治疗方法包括各种抗vegf注射(如雷珠单抗、康柏西普等)、激素(如缓释地塞米松注射、曲安奈德、氟轻松等)、激光光凝及玻璃体切割术等，但临床仍存在一些患者对上述治疗措施的效果不能达到理想预期。
5.有研究发现，抑制神经炎症反应能减弱受损脑区的神经元病变或者推迟神经退行性疾病的进程。因此，寻找和研究脑内神经炎症抑制剂，对于开发具有治疗多种急慢性神经退行性疾病的新型药物具有重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明针对背景技术中存在的问题，提供了乙醇胺的新用途，即乙醇胺在制备预防、缓解和/或治疗神经炎症相关疾病的产品中的应用，为临床改善或治疗神经炎症相关疾病提供新的药物。
7.为了达到上述目的，本发明首先提供了乙醇胺在制备预防、缓解和/或治疗神经炎症相关疾病的产品中的应用。
8.本发明另一方面提供了乙醇胺在制备抑制神经炎症的产品中的应用。
9.优选地，所述的神经炎症为由小胶质细胞过度活化所导致的神经炎症。
10.优选地，所述的产品包括药物和/或保健品。
11.优选地，所述的药物还包括药学上可接受的载体或辅料。
12.进一步地，所述的载体或辅料包括稀释剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、赋形剂中的任意一种或几种。
13.进一步地，所述的药物的剂型包含油剂、颗粒剂、片剂、散剂、胶囊、丸剂、粉剂、口服液、溶胶剂、喷剂、雾化剂任意一种或任意两种以上的组合。
14.优选地，所述的神经炎症相关疾病包括眼科疾病、中枢神经系统疾病。
15.进一步地，所述的眼科疾病包括但不限于视神经损伤、糖尿病视网膜病变、青光眼；所述的中枢神经系统疾病包括但不限于多发性硬化症、亨廷顿氏病、帕金森氏病。
16.所述的乙醇胺用于抑制小胶质细胞的过度活化，降低炎症因子的表达。
17.相对于现有技术，本发明的有益效果是：
18.本发明通过一系列实验评价了乙醇胺对小胶质细胞活化的抑制效果，结果发现，乙醇胺可通过抑制nf-κb通路显著减轻小胶质细胞的活化及炎症因子的表达，从而降低视网膜炎症水平。因此将乙醇胺用于制药或保健品等用途，能够得到适用于预防、缓解和治疗神经炎症相关疾病的产品。
附图说明
19.图1为乙醇胺处理对低氧诱导的bv2炎症因子表达的影响；其中：
20.a为对照组和乙醇胺处理组细胞中炎症因子il-1β和cd11b的蛋白表达对比；
21.b为对照组和乙醇胺处理组细胞中炎症因子il-1β的mrna水平对比。
22.图2为对照组和乙醇胺处理组细胞中nfκb分布的免疫荧光染色结果；
23.control为正常培养对照组；hypoxia为缺氧培养对照组；hypoxia+ethanolamine为缺氧培养+乙醇胺处理组。
24.图3为对照组和乙醇胺处理组大鼠视网膜内小胶质细胞活化水平的免疫荧光染色结果。
具体实施方式
25.以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
26.乙醇胺(ethanolamine)是磷脂的第二丰富的头部基团，生物膜的主要结构成分。磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl-ethanolamine，pe)存在于所有活细胞中，占所有磷脂的25％，本发明提供了一种ethanolamine的新用途，即ethanolamine在制备预防、缓解和/或治疗神经炎症相关疾病的产品中的应用，以及ethanolamine在制备抑制神经炎症的产品中的应用。
27.优选地，本发明所述的神经炎症为由小胶质细胞过度活化所导致的神经炎症；所述的神经炎症相关疾病包括眼科疾病、中枢神经系统疾病，进一步地，所述的眼科疾病包括但不限于视神经损伤、糖尿病视网膜病变、青光眼；所述的中枢神经系统疾病包括但不限于多发性硬化症、亨廷顿氏病、帕金森氏病。
28.优选地，所述的产品包括药物和/或保健品。
29.本发明所述的ethanolamine在制备抑制神经炎症的药物或预防、缓解和/或治疗
神经炎症相关疾病的药物时，可单独使用；也可以药物组合物的形式使用。所述的药物除含有治疗有效量的ethanolamine外，还包括药学上可接受的载体或辅料，所述的载体或辅料包括稀释剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、赋形剂中的任意一种或几种。进一步地，所述的药物的剂型包含油剂、颗粒剂、片剂、散剂、胶囊、丸剂、粉剂、口服液、溶胶剂、喷剂、雾化剂等。在使用时，是将安全有效量的乙醇胺施用于哺乳动物(如人)。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
30.本发明所述产品中的活性成分乙醇胺用于抑制小胶质细胞的过度活化，降低炎症因子的表达。
31.本发明通过细胞和动物实验评价了乙醇胺对小胶质细胞活化的抑制效果，结果发现，乙醇胺可通过抑制nf-κb通路来显著减轻小胶质细胞的活化及炎症因子的表达，从而降低视网膜炎症水平。证明了乙醇胺对糖尿病视网膜病变的治疗作用，可用于制备治疗糖尿病视网膜病变的药物、保健品等产品。
32.下面对本发明的实验过程及实验结果进行详细说明。
33.实施例1乙醇胺抑制缺氧诱导的小胶质细胞的炎症反应
34.1.实验方法
35.本实验使用缺氧诱导的bv2细胞作为体外模型，通过检测炎症因子的表达，来验证乙醇胺对小胶质细胞的作用。具体实验过程为：
36.于6孔板中接种bv2细胞，加入含10％fbs和青霉素/链霉素双抗的高糖(含4.5g/l葡萄糖)dmem培养液(目录号10-013-cv；corning)常规培养；细胞长到70％左右时，缺氧条件下加入不同浓度的乙醇胺((目录号：s6210；sellck))继续培养，同时保留一组不加乙醇胺但常规条件培养的作对照；24h后收集细胞并提取rna，用qrt-pcr、western blot检测相关炎症因子的表达。
37.2.实验结果
38.结果如图1所示：与对照组相比，低氧条件下，小胶质细胞bv2炎症因子il-1β和cd11b的蛋白表达显著增加，但乙醇胺处理后，可降低il-1β和cd11b的蛋白表达，且随着浓度的增加，降低效果越显著(图1的a)；另外，pcr检测结果同样显示：乙醇胺处理可显著降低炎症因子il-1β的mrna水平(图1的b)。表明乙醇胺能有效减轻小胶质细胞的活化和炎症因子的表达，从而抑制由小胶质细胞过度活化导致的神经炎症，进而达到预防、缓解和治疗神经炎症相关疾病的作用。
39.实施例2乙醇胺抑制缺氧诱导的小胶质细胞中的nf-κb核易位
40.1.实验方法
41.nf-κb在dr炎症反应中起着关键作用。bv2细胞缺氧刺激后通过nf-κb通路激活促进炎症反应，为了进一步表征ethanolamine抑制炎症反应的分子机制，我们检测了nf-κbp65的易位，它是nf-κb激活的标志物。具体实验过程为：
42.bv2细胞缺氧诱导完成后弃去培养液，加入4％多聚甲醛室温固定15分钟，在室温下用0.1％triton x-100透化10分钟；细胞在室温下用5％山羊血清封闭1小时，然后在4℃
下与兔抗nf-κbp65抗体孵育过夜；用pbs洗涤3次后，与alexa 488偶联的抗兔二级igg(1：500；thermo fisher scientific，a-11008)在室温下孵育1小时；再用pbs洗涤3次后，用dapi(sigma-aldrich)复染5分钟；完成后，在共聚焦荧光显微镜(lsm 510，carl zeiss，gottingen germany)下对盖玻片进行可视化和拍照。
43.2.实验结果
44.结果如图2所示，免疫荧光图像显示：在正常对照组中，nf-κbp65主要分布在细胞质中，而缺氧诱导组(hypoxia组)中，nf-κbp65发生从细胞质向细胞核的明显移位，表明了炎症因子的转录活性；而ethanolamine处理可以在很大程度上降低了缺氧诱导的nf-κbp65从细胞质中的核易位。以上结果表明，ethanolamine可通过抑制缺氧或低氧诱导的nf-κb通路激活来减轻小胶质细胞炎症因子表达。
45.实施例3乙醇胺减轻糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞活化
46.1.实验方法
47.所有动物实验均按照arvo关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明进行，并遵守中国上海交通大学医学院上海总医院伦理委员会要求的准则。
48.(1)糖尿病大鼠造模处理
49.体重120-160g的雄性sprague dawley大鼠被随机分配为糖尿病组、对照组。糖尿病组大鼠：禁食24小时后腹腔注射链脲佐菌素(stz，溶剂为柠檬酸缓冲液，60mg/kg体重)；对照组大鼠：注射相同体积的柠檬酸缓冲液。stz造模组动物血糖超过13.9mmol/l(250mg/dl)连续3天时被确认为糖尿病。
50.(2)乙醇胺给药处理
51.确认造模成功后，糖尿病组大鼠每天重复灌胃给药乙醇胺(60mg/kg体重)(简称dm+etha组)，糖尿病组大鼠对照组每天重复灌胃等体积ddh2o(简称dm组)，未处理的年龄匹配的正常大鼠作为对照(简称con组)。在糖尿病发作后4周处死大鼠，取材进行相关检测。
52.(3)免疫荧光染色观察小胶质细胞活化水平
53.4℃下，眼睛用4％多聚甲醛固定1小时，去除包括角膜、虹膜和晶状体在内的前段；用蔗糖梯度脱水后，将眼杯嵌入包埋剂中(sakura finetek，东京，日本)，并在-80℃下储存直至切片；切片时，在低温切片机(leica，wetzlar，germany)上进行连续切片(15微米厚)；冷冻切片室温贴片后，用含1％bsa和0.1％triton x-100的pbs溶液在室温下封闭透化1小时；将切片在4℃下与兔抗iba-1抗体(1：500，目录号019-19741；wako，大阪，日本)孵育过夜；用pbs洗涤3次(每次10分钟)后；将切片与驴抗兔igg h&l(alexa fluor 555，1：500；目录号ab150074；abcam，美国)在室温下孵育1小时；再用pbs洗涤3次，每次10分钟，将切片用dapi复染5分钟并封片固定，在共聚焦荧光显微镜(lsm 510，carl zeiss，gottingen germany)下观察。
54.2.实验结果
55.结果如图3所示，与正常对照组相比，糖尿病大鼠视网膜中的小胶质细胞被激活，其数量增加，而腹腔注射ethanolamine可以在很大程度上降低小胶质细胞的活化水平。以上结果表明ethanolamine可对小胶质细胞活化起抑制作用，证明了ethanolamine对糖尿病视网膜病变的预防、缓解和治疗作用。
56.综上所述，乙醇胺(ethanolamine)能有效减轻视网膜小胶质细胞的活化水平，减
少炎症因子的表达，能够用于制备抑制神经炎症的产品，也可用于制备预防、缓解和/或治疗神经炎症相关疾病的药物、保健品等。
57.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。