一种小鹅瘟病毒的复合疫苗及卵黄抗体的制备方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小鹅瘟病毒的复合疫苗及卵黄抗体的制备方法。


背景技术：

2.小鹅瘟是由小鹅瘟病毒所引起的雏鹅的一种急性或亚急性的败血性传染病。造成鹅群的死亡率提升、生产性能下降，给养殖业造成巨大损失。抗病毒化学药物在鹅群上已全面禁用，中药则对小鹅瘟病毒病未见确实的临床效果，养鹅业急需一种疗效明确、成本低廉的小鹅瘟病毒预防、治疗制剂。
3.卵黄抗体是用特异性的抗原多次免疫接种健康蛋鹅，待蛋黄内抗体滴度达到一定高度后，收集其所产鹅蛋经过提取纯化制备而成，常作为特效药物用于疫病的紧急预防和治疗。卵黄抗体的制备工艺中，优选免疫原性突出的免疫抗原，使其最大化的刺激蛋鹅的细胞免疫与体液免疫水平，获得抗体滴度高、持续时间长的高免鹅蛋，对降低卵黄抗体的生产成本具有显著经济价值。
4.因此，需要提供一种鹅瘟病毒的复合疫苗及卵黄抗体的制备方法，以解决上述现有存在的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供一种鹅瘟病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法，该制备方法优选的小鹅瘟病毒复合疫苗免疫蛋鹅后可显著提高蛋黄中小鹅瘟病毒抗体效价，提取纯化制备的卵黄抗体性质稳定、纯度高，可大大降低小鹅瘟病毒卵黄抗体的生产成本，对小鹅瘟病毒的预防及治疗极具应用价值。
6.为解决上述技术问题，本发明提供一种小鹅瘟病毒的复合疫苗，包括水相与佐剂，所述水相中抗原为重组pvax1-orf c1质粒与改造的重组小鹅瘟病毒cap蛋白，所述重组pvax1-orf c1质粒，由小鹅瘟病毒的orf c1基因与真核表达载体pvax1通过酶切连接而成。
7.所述改造的重组小鹅瘟病毒cap蛋白是将小鹅瘟病毒hn株的cap蛋白中富含精氨酸的n端21-36位肽段用t细胞表位肽段takskkfpsytatyqf进行替换，并经大肠杆菌稀有密码子优化后与 载体相连、转hek293株制备而成，所述改造的重组小鹅瘟病毒cap蛋白的一种核苷酸序列为seq no.1。
8.所述重组pvax1-orf c1质粒的大量制备是将重组pvax1-orf c1质粒转化大肠杆菌dh5α后进行大肠杆菌高密度发酵、菌体裂解、质粒dna提取纯化。
9.所述水相中重组质粒终浓度是30～50μg/ml，重组小鹅瘟病毒cap蛋白终浓度为0.5～0.9mg/ml。
10.所述的复合疫苗水相中重组质粒终浓度是45μg/ml，重组cap蛋白终浓度为0.6mg/ml。
11.所述的佐剂为白油。
12.一种小鹅瘟病毒的卵黄抗体制备方法，以小鹅瘟病毒复合疫苗免疫蛋鹅，然后从高免鹅蛋的蛋黄中提取纯化得到抗小鹅瘟病毒的卵黄抗体，将高免蛋经过蛋黄分离、灭活、萃取、过滤、分装等步骤，制备卵黄抗体成品，终产品抗体琼扩效价达1:16。
13.本发明的上述技术方案至少包括以下有益效果：小鹅瘟病毒卵黄抗体制备方法，与常规制备方法相比将高免蛋抗体效价提高4倍以上，从而大大降低小鹅瘟病毒卵黄抗体的制作成本，极具推广与应用价值。制备的小鹅瘟病毒卵黄抗体用于小鹅瘟病毒的预防或治疗，均取得优异效果，注射抗体的鹅群获得完全保护。
具体实施方式
14.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.一种小鹅瘟病毒的复合疫苗，包括水相与佐剂，所述水相中抗原为重组pvax1-orf c1质粒与改造的重组小鹅瘟病毒cap蛋白，所述重组pvax1-orf c1质粒，由小鹅瘟病毒的orf c1基因与真核表达载体pvax1通过酶切连接而成。所述改造的重组小鹅瘟病毒cap蛋白是将小鹅瘟病毒hn株的cap蛋白中富含精氨酸的n端21-36位肽段用t细胞表位肽段takskkfpsytatyqf进行替换，并经大肠杆菌稀有密码子优化后与 载体相连、转hek293株制备而成，所述改造的重组小鹅瘟病毒cap蛋白的一种核苷酸序列为seq no.1所述重组pvax1-orf c1质粒的大量制备是将重组pvax1-orf c1质粒转化大肠杆菌dh5α后进行大肠杆菌高密度发酵、菌体裂解、质粒dna提取纯化。
16.所述水相中重组质粒终浓度是30～50μg/ml，重组小鹅瘟病毒cap蛋白终浓度为0.5～0.9mg/ml。所述的佐剂为白油。
17.一种小鹅瘟病毒的卵黄抗体制备方法，以小鹅瘟病毒复合疫苗免疫蛋鹅，然后从高免鹅蛋的蛋黄中提取纯化得到抗小鹅瘟病毒的卵黄抗体，将高免蛋经过蛋黄分离、灭活、萃取、过滤、分装等步骤，制备卵黄抗体成品，终产品抗体琼扩效价达1:16实施例1：重组pvax1-orf c1质粒的构建与制备1、重组pvax1-orf c1质粒的载体构建1.1、根据小鹅瘟病毒hn株的orf c1基因序列，将其两端分别加上kpn i和xho i酶切位点后进行全基因合成。
18.1.2、合成的小鹅瘟病毒orf c1基因用kpn i和xho i双酶切后连入pvax1载体相应的酶切位点，cacl2法转化大肠杆菌dh5α，提取质粒进行kpn i和xho i双酶切鉴定，正确后送华大基因测序，测序结果表明小鹅瘟病毒orf c1基因成功连入pvax1载体相应酶切位点。
19.2、重组pvax1-orf c1质粒的体外表达与鉴定2.1、选取生长良好的pk-15细胞接种6孔细胞培养板，37℃、5％二氧化碳培养箱培养至细胞85％～90％汇合度时，进行重组pvax1-orf c1质粒转染。
20.2.2、细胞转染操作按lipofectaminetm2000试剂盒说明书进行，步骤如下：
2.2.1、取4μg重组pvax1-orf c1质粒dna，用无血清细胞培养基稀释至250μl，轻轻混匀。
21.2.2.2、取10μl的lipo2000，用无血清细胞培养基稀释至250μl，轻轻混匀，室温静置5min。
22.2.2.3、将dna悬液和lipo2000悬液混合后轻轻混匀，室温静置20min。
23.2.2.4、将pk-15细胞已长好的6孔板中培养液弃掉，无血清细胞培养液洗2次，吸弃培养液，加入上述混合液，轻轻混匀后，补加1ml无血清细胞培养基，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
24.2.2.5、转染6h后，弃掉6孔板细胞液，每孔加入2ml含10％新生牛血清的dmem培养基。
25.2.2.6、设转染pvax1空载体的pk-15细胞做为阴性对照。
26.2.3、转染48小时后，用ph7 .2的pbs液洗涤接毒后细胞板1遍，注意动作轻缓，防止细胞脱落，预冷的甲醇4℃固定细胞15～20min，pbs洗3遍，加入鼠抗小鹅瘟病毒阳性血清100μl，37℃孵育1h，pbs洗3遍，加入100倍稀释的fitc标记羊抗鼠二抗100μl，37℃避光孵育45min，pbs洗3遍，荧光显微镜观察结果。结果重组pvax1-orf c1质粒转染pk-15细胞后可观察到明显的荧光信号，而对照组无明显荧光信号，证明构建的重组pvax1-orf c1质粒可正确表达小鹅瘟病毒cap蛋白。
27.3、重组pvax1-orf c1质粒的大量制备3.1、重组菌的高密度发酵与菌体裂解含重组pvax1-orf c1质粒dna的大肠杆菌dh5α经50l发酵罐高密度发酵培养后，5000r/min离心10min收集菌体，按每克湿菌重5ml的比例加入solution i，再按1:2:1 .5的比例分别加入solution ii和solution iii，室温孵育15min后，10000r/min室温离心10min，收集上清，加入0 .7倍体积异丙醇，-20℃沉淀30min，10000r/min室温离心10min，弃上清，沉淀溶解于10mmol/l te缓冲液。
28.3.2、内毒素的去除将纯化的质粒dna溶液加入10％的tritonx-114，使其终浓度为 1％，混匀后冰浴10min，然后42℃继续孵育10min，10000r/min室温离心10min，小心吸取上清液至无热原容器中，必要时重复操作1次。
29.3 .3、定量分装用10mmol/l te缓冲液稀释至500μg/ml，定量分装，即为重组pvax1
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orf c1质粒。
30.3.4、重组pvax1-orf c1质粒的检测3.4.1、重组pvax1-orf c1质粒的浓度测定超微量核酸分析仪检测质粒浓度，应不低于500μg/ml。
31.3.4.2、酶切鉴定将纯化的重组pvax1-orf c1质粒用kpn i和xho i双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果应看到约2000bp与865bp大小的两条带。
32.3.4.3、宿主蛋白检测按照bca蛋白检测试剂盒说明书，以已知浓度的bsa制备标准曲线。用无菌水将纯化的重组pvax1-orf c1质粒进行梯度稀释，在同样条件下对纯化质粒dna中的菌体蛋白进行定量检测，重组质粒的菌体蛋白含量应低于10μg/mg。
33.3.4.4、内毒素检测按鲎试剂方法进行内毒素检测，内毒素含量应低于1000eu/mg。
34.实施例2小鹅瘟病毒复合疫苗的制备与检验
1、重组小鹅瘟病毒cap蛋白的制备1 .1、生产菌株重组小鹅瘟病毒cap蛋白生产细胞株hek293，是将小鹅瘟病毒hn株的cap蛋白中富含精氨酸的n端21-36位肽段用t细胞表位肽段 (takskkfpsytatyqf)进行替换，并经大肠杆菌稀有密码子优化后与载体相连、转染hek293细胞株制备而成。
35.1 .2、重组小鹅瘟病毒cap蛋白的制备将重组小鹅瘟病毒cap蛋白生产细胞株hek293高密度悬浮培养、瞬时表达、凝胶柱纯化、甲醛灭活，最后用无菌生理盐水将蛋白液稀释至终浓度2.0mg/ml，无菌过滤，待用。
36.2、小鹅瘟病毒复合疫苗的制备2.1、半成品制备将实施例1的3 .3中制备的重组pvax1-orf c1质粒dna与实施例2的1 .2中制备的小鹅瘟病毒cap蛋白适当稀释，使质粒dna终含量为50μg/ml，cap蛋白终含量为 0.5mg/ml，充分混匀，即为半成品。
37.2.2、疫苗制备2.2.1、油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份。在油相罐中混合均匀，加热融化至半透明状，再加司本-80 6份，至温度达到125～130℃时维持30分钟，冷却至室温备用。
38.2.2.2、水相制备取灭菌的吐温-80 4份，加检验合格的半成品96份，充分搅拌至吐温-80完全溶解。
39.2.2.3、乳化取油相2份置于高速剪切机内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1 份，再以3600r/min乳化40分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，终浓度达到0.01％。乳化后，取样10ml加入离心管，以3000r/min离心15分钟，管底应无水相析出。
40.2.2.4、分装定量分装，密封瓶口。
41.3、小鹅瘟病毒复合疫苗的检验3.1、物理性状外观为乳白色乳剂。
42.剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。
43.稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15分钟，管底应无水相析出。
44.黏度：按现行《中国兽药典》进行，符合规定。
45.装量检查：按现行《中国兽药典》进行，符合规定。
46.3.2、无菌检验：按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。
47.3.3、安全检验：将7日龄健康易感鹅20只平均分为两组，每组10只。第一组腿部肌肉注射本发明制备的疫苗，1.0ml/只，第二组腿部肌肉注射同体积生理盐水。免疫后21日观察鹅群，结果两组雏鹅均全部健活，无任何不良反应。
48.3.4、甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》进行，均符合规定。
49.4、小鹅瘟病毒复合疫苗对蛋鹅免疫程序研究选取120日龄蛋鹅80只，平均分为4组，每组20只。dna疫苗组免疫实施例1制备的重组pvax1-orf c1质粒，10μg/只；亚单位疫苗组免疫重组小鹅瘟病毒亚单位疫苗，由实施例2制备的重组小鹅瘟病毒cap蛋白与白油佐剂按1:2比例乳化制成，其中水相中cap蛋白的终
浓度为0 .5mg/ml；复合疫苗组免疫实施例3制备的小鹅瘟病毒复合疫苗；不免疫对照组注射同等体积的生理盐水。各组蛋鹅分别进行相应疫苗免疫，皮下注射，0 .5ml/只，免疫间隔14日，共三次免疫。分别于免疫前，三免前(二免后14日)，三免后7、14、21、28日收集鹅蛋测定卵黄抗体效价，之后每30日收集高免蛋鹅蛋测定卵黄抗体效价，确定蛋鹅的卵黄抗体产生。
50.结果：制备的小鹅瘟病毒复合疫苗免疫蛋鹅后，三免后7日即可达到收蛋要求(不低于1:64) (见表1)，最高可达1:512，且三免后4个月进行检测，卵黄抗体效价仍符合要求 (见表2)。结果表明不论是卵黄抗体产生时间、抗体产生高度还是抗体持续期，复合疫苗组 均远优于dna疫苗组与亚单位疫苗组，显示了良好的应用前景。
51.表1各疫苗组免疫后蛋鹅的卵黄抗体产生期。
52.表2各疫苗组免疫后蛋鹅的卵黄抗体持续期。
53.实施例3小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备与检验 1、小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备按实施例2中3部分的方法将小鹅瘟病毒复合疫苗免疫蛋鹅制备高免蛋，收集合格的高免蛋(抗体效价不低于1:64)，蛋壳消毒后进行卵黄分离、萃取、灭活、过滤除菌、稀释分装等方法，终产品抗体效价应不低于1:16。
54.2、小鹅瘟病毒卵黄抗体的安全性实验将7日龄健康易感鸭20只平均分为两组，每组10只。第一组腿部肌肉注射本发明制备的卵黄抗体，1 .0ml/只，第二组腿部肌肉注射同体积生理盐水。免疫后21日观察鹅群，应全部健活，无任何不良反应。
55.3、小鹅瘟病毒卵黄抗体的效力试验将28日龄健康易感鸭90只平均分为三组，每组30只。第一组为卵黄抗体治疗组，腿部肌肉注射小鹅瘟hn株0 .2ml(含10
4.0
id50)，24h后肌肉注射本发明制备的小鹅瘟病毒卵黄抗体，0 .5ml/只。第二组为卵黄抗体预防组，肌肉注射本发明制备的小鹅瘟病毒卵黄抗体，0 .5ml/只，24h后腿部肌肉注射小鹅瘟hn株，0.2ml(含10
4 .0
id50)。第三组为生理盐水对照组，腿部肌小鹅瘟hn株0.2ml (含10
4.0
id50)，24h后肌肉注射无菌生理盐水，0.5ml/只。
56.攻毒14天后统计治疗效果。其中发病标准：1、羽毛营养失调，羽轴出血、毛刺、逐渐消瘦；2、死亡。以上两者出现之一即判为发病。
57.结果：卵黄抗体治疗组与预防组在小鹅瘟病毒攻毒后鹅群获得100％保护，生理盐水对照组的鹅群则100％发病。证明本发明制备的小鹅瘟病毒卵黄抗体对感染小鹅瘟病毒的鹅群具有良好的保护效果，可进行推广和应用。
58.表3小鹅瘟病毒卵黄抗体治疗效果试验。
59.。
60.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
61.以上是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。