1.本发明涉及一种多功能肠道诊疗制剂制备方法及其产品，具体涉及含
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f-氟碳化合物、金纳米棒的m2型巨噬细胞探针及其制备方法。
背景技术：
2.肿瘤已经成为影响人类健康的重要因素，肿瘤转移更是导致肿瘤患者死亡的重要原因。据目前统计显示，我国新诊断的肿瘤患者中1年复发率为60%，死于肿瘤复发和转移的患者超过80%。“早发现、早诊断、早治疗”成为防止肿瘤发展、减少术后复发和转移的重要途径。因此，研究肿瘤的早发现、早诊断、早治疗的方法具有重要的意义和社会价值。
3.近年来，以肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, tam）为目标的肿瘤研究成为了热点。tam是浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞，是肿瘤微环境中最多的免疫细胞，可以分泌多种细胞因子，在肿瘤发生的初期，能够识别并清除肿瘤细胞，但随着肿瘤的发生发展，又对肿瘤的生长、侵袭、转移起着关键作用。由于tam来自于自体，且与肿瘤的发生、发展有密不可分的联系。因此，tam被认为是与肿瘤高度亲和的物质，其不仅能很好地杀灭肿瘤，还能向肿瘤高效地输送药物。在肿瘤的发生发展中tam发挥着“双刃剑”的作用，它们可以被分化为m1型或m2型巨噬细胞。其中，m1型具有抗肿瘤作用，该型巨噬细胞高表达白介素1（il-1）、白介素6（il-6）等细胞因子，这些细胞因子可协助行使抗肿瘤功能；但是m2型巨噬细胞则主要促进肿瘤细胞侵袭转移与周围炎症反应，参与肿瘤的侵袭、生长、血管发生、转移、免疫抑制等。因此，越来越多的研究利用m2 型巨噬细胞实现了对肿瘤的高效诊断和治疗。
4.壳聚糖是一种天然的多糖，具有良好的生物相容性和可降解性，无生物毒性，且富含氨基和羟基易于进行修饰和改性。因此壳聚糖纳米材料被广泛使用于纳米递药领域中，例如，cheng j., zhou x., zhou w., wu h., zhang x., lu q., a novel magnetic contrast agent for gastrointestinal mucosa-targeted imaging through oral administration. j biomed nanotechnol., 2019,15(6),1162-71，报道了一种新型的核磁共振造影剂，通过将gd负载于壳聚糖纳米颗粒中并通过口服给药实现了对肠道的多功能评估，其关键技术在于壳聚糖能有效地粘附与肠道粘膜表面，被肠道粘膜吸收。
5.金纳米棒是一种代表性的金纳米材料，具有近红外区高强度的光吸收特性，一直以来都是光声成像、光热治疗等领域的研究热点。例如，jokerst j., cole j., van de sompel d., gambhir s.s., gold nanorods for ovarian cancer detection with photoacoustic imaging and resection guidance via raman imaging in living mice. acs nano., 6(11), 10366-77，该研究制备不同长径比的金纳米棒，实现了对小鼠皮下卵巢癌的光声成像。
6.目前，精准的诊疗技术不断出现，而这些诊疗技术研究往往集中于高灵敏成像、高效率治疗和高精准靶向3个方面。其中，靶向技术是肿瘤诊疗的关键；肿瘤定位和成像是肿瘤诊断的核心；提高传统治疗手段的疗效是肿瘤临床治疗的重点。但是，现有技术通常很难
同时满足以上三个方面，由于肝脏首过效应等因素靶向效率仍有待提高。
技术实现要素：
7.为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明目的在于提出一种多功能肠道诊疗制剂的制备方法。
8.本发明的再一目的在于：提供上述方法制备的多功能肠道诊疗制剂。
9.本发明目的通过以下方案实现：本发明提供一种多功能肠道诊疗制剂的制备方法，包括以下步骤：（1）壳聚糖纳米粒的制备取30 mg 壳寡糖、17mg乙二酸四乙胺（edta）溶于10ml去离子水中，再加入2-5 mg金纳米棒，超声分散均匀；在磁力搅拌下逐滴添加无水乙醇直至体系颜色变为乳光色，加入30μl25%的戊二醛溶液交联4h，离心收集纳米球；取100μl靶向抗体溶于10ml去离子水中，加入12mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和8mg n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）于室温下活化抗体羧基2-4h；向反应体系加入10-15mg纳米球，搅拌4h后离心收集，使用去离子水清洗三次除去未反应的抗体，获得产物；（2）含氟载氧乳剂的制备在10毫升体积比为1:0.5-1:2的盐溶液/乙醇的溶剂中，加入质量浓度分别为1%-50%的氟碳化合物、
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f的1,2-二棕榈酸甘油酯（
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f-dp）和甘露糖修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（man-dspe），另外再加入乳化剂和其他助剂（质量浓度分别为0%-10%），在室温下采用匀浆机以一定的速率进行间歇性搅拌，冷却后离心，取上清液即可得到含氟载氧乳剂；（3）巨噬细胞包载壳聚糖纳米粒和含氟载氧乳剂将肠道m2型巨噬细胞（细胞密度为5000个/孔板）与所制备的纳米颗粒和含氟载氧乳剂共孵育12-72小时，得到巨噬细胞包载的壳聚糖纳米粒和含氟载氧乳剂，实现多功能肠道诊疗制剂。
10.所述的金纳米棒的直径为40-100 nm，长径比为2-5。
11.所述的靶向抗体为5-羟色胺受体3抗体(anti-5-ht3r)、血管内皮生长因子抗体（anti-vegf）、组胺受体h1抗体（anti-hrh1）、类胰蛋白酶多克隆抗体（polyclonal antibody to tryptase）中的一种。
12.所述的氟碳化合物为全氟环醚、全氟萘烷、全氟甲基环已基哌啶、全氟溴辛烷、1-溴十五氟庚烷、1-溴十三氟己烷中的一种。
13.所述的盐溶液为生理盐水、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、三强甲氨基甲烷缓冲液、巴比妥缓冲液、甲酸钠缓冲液、醋酸-锂盐缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钾缓冲液等无机盐溶液的一种。
14.所述的乳化剂为磷脂，包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆寇酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆寇酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱或二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、儿肉豆莲酰磷脂酰乙二醇胺、二棕榈酰
磷脂耽乙二醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻县磷脂酰丝氨酸、儿棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂中的至少一种。
15.所述的助剂为tu-80（聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯），6501（椰油脂肪酸二乙醇酰胺），aeo-9（脂肪醇聚氧乙烯醚），brij-35（月桂醇聚氧乙烯醚）或triton x-100（聚乙二醇辛基苯基醚）的一种或几种混合物。
16.所述的间歇性搅拌为搅拌1分钟，终止1分钟，搅拌时间为2-4小时。
17.本发明还提供了上述方法制备的一种多功能肠道诊疗制剂，具有正电子发射断层扫描（pet）、超声成像和光热治疗的多功能探针，可以同时满足肿瘤精准定位、高灵敏长周期成像，提高了探针对肿瘤的靶向成像效率。
18.一种多功能肠道诊疗制剂，其特征在于共同具有pet成像、超声成像和光热治疗的多功能探针，可以同时满足肿瘤精准定位、高灵敏长周期成像，提高了探针对肿瘤的靶向成像效率。
19.本发明的优点在于：采用巨噬细胞作为药物载体“蓄水池”，通过巨噬细胞转运作用，增强载体在肿瘤部位富集，而壳聚糖能有效地吸附在肠道粘膜表面；
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f类核素作为pet的显像剂，通过pet成像确定肿瘤位置和转移灶，实现全身肿瘤的精准定位；氟碳化合物作为超声造影剂。通过超声成像，提高局部肿瘤的诊断能力。金纳米棒具有光热作用，具有对肿瘤部位进行光热治疗的应用前景。
具体实施方式
20.以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
21.实施例1一种多功能肠道诊疗制剂，按下述步骤制备：（1）壳聚糖纳米粒的制备取30 mg 壳寡糖、17mg乙二酸四乙胺（edta）溶于10ml去离子水中，再加入2mg金纳米棒，超声分散均匀；在磁力搅拌下逐滴添加无水乙醇直至体系颜色变为乳光色，加入30μl25%的戊二醛溶液交联4h，离心收集纳米球；取100μl靶向抗体anti-5-ht3r溶于10ml去离子水中，加入12mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和8mg n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）于室温下活化抗体5-羟色胺受体3羧基2-4h；向反应体系加入10-15mg纳米球，搅拌4h后离心收集，使用去离子水清洗三次除去未反应的抗体，获得壳聚糖纳米粒产物；（2）含氟载氧乳剂的制备在10毫升体积比为1:1的盐溶液生理盐水/乙醇的溶剂中，加入质量浓度分别为10%的氟碳化合物全氟环醚、10%
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f的1,2-二棕榈酸甘油酯
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f-dp和5%甘露糖修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺man-dspe，另外，再加入质量浓度为5%的乳化剂大豆卵磷脂，在室温下采用匀浆机进行间歇性搅拌，即搅拌1分钟、终止1分钟，搅拌时间为2小时，冷却后离心，取上清液即可得到含氟载氧乳剂；（3）巨噬细胞包载壳聚糖纳米粒和/或含氟载氧乳剂将细胞密度为5000个/孔板肠道m2型巨噬细胞与所述的壳聚糖纳米粒和/或所述
的含氟载氧乳剂共孵育24小时，得到巨噬细胞包载的壳聚糖纳米粒和含氟载氧乳剂，得到具有靶向功能的pet/超声多功能肠道造影剂。
22.制备的多功能肠道诊疗制剂粒径为430纳米，溶氧量为15%。在808nm的激光照射下，200 μg/ml的产物在1 min内升温到45℃。
23.实施例2一种多功能肠道诊疗制剂，与实施例1步骤近似，按下述步骤制备：（1）壳聚糖纳米粒的制备取30 mg 壳寡糖、10mg乙二酸四乙胺（edta）溶于10ml去离子水中，再加入5mg金纳米棒，超声分散均匀；在磁力搅拌下逐滴添加无水乙醇直至体系颜色变为乳光色，加入30μl25%的戊二醛溶液交联4h，离心收集纳米球；取100μl靶向抗体anti-hrh1溶于10ml去离子水中，加入12mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和8mg n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）于室温下活化抗体组胺受体h1羧基2-4h；向反应体系加入10mg纳米球，搅拌4h后离心收集，使用去离子水清洗三次除去未反应的抗体，获得壳聚糖纳米粒产物；（2）含氟载氧乳剂的制备在10毫升体积比为1: 2的盐溶液甲酸钠缓冲液/乙醇的溶剂中，加入质量浓度分别为50%的氟碳化合物全氟萘烷、20%
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f的1,2-二棕榈酸甘油酯
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f-dp和10%甘露糖修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺man-dspe，另外，再加入质量浓度为10%的二油酰磷脂酰胆碱和2% tu-80，在室温下采用匀浆机进行间歇性搅拌，即搅拌1分钟、终止1分钟，搅拌时间为4小时，冷却后离心，取上清液即可得到含氟载氧乳剂；（3）巨噬细胞包载壳聚糖纳米粒和/或含氟载氧乳剂将细胞密度为5000个/孔板肠道m2型巨噬细胞与所述的壳聚糖纳米粒和/或所述的含氟载氧乳剂共孵育48小时，得到巨噬细胞包载的壳聚糖纳米粒和含氟载氧乳剂，即得到具有靶向功能的pet/超声多功能肠道造影剂。
24.制备的多功能肠道诊疗制剂粒径为310纳米，溶氧量为35%。在808nm的激光照射下，200 μg/ml的产物在1 min内升温到48℃。
25.实施例3一种多功能肠道诊疗制剂，与实施例1步骤近似，按下述步骤制备：（1）壳聚糖纳米粒的制备取30 mg 壳寡糖、17mg乙二酸四乙胺（edta）溶于10ml去离子水中，再加入10mg金纳米棒，超声分散均匀；在磁力搅拌下逐滴添加无水乙醇直至体系颜色变为乳光色，加入30μl25%的戊二醛溶液交联4h，离心收集纳米球；取100μl靶向抗体anti-vegf溶于10ml去离子水中，加入12mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和8mg n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）于室温下活化抗体血管内皮生长因子羧基2-4h；向反应体系加入15mg纳米球，搅拌4h后离心收集，使用去离子水清洗三次除去未反应的抗体，获得壳聚糖纳米粒产物；（2）含氟载氧乳剂的制备在10毫升体积比为1: 2的盐溶液醋酸-醋酸钠缓冲液/乙醇的溶剂中，加入质量浓度分别为50%的氟碳化合物全氟溴辛烷、30%
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f的1,2-二棕榈酸甘油酯
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f-dp和20%甘露糖修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺man-dspe，另外，再加入质量浓度为10%的二肉豆酰磷脂酰甘油和5% brij-35，在室温下采用匀浆机进行间歇性搅拌，即搅拌1分钟、终止1分钟，搅拌
时间为4小时，冷却后离心，取上清液即可得到含氟载氧乳剂；（3）巨噬细胞包载壳聚糖纳米粒和/或含氟载氧乳剂将细胞密度为5000个/孔板肠道m2型巨噬细胞与所述的壳聚糖纳米粒和/或所述的含氟载氧乳剂共孵育72小时，得到巨噬细胞包载的壳聚糖纳米粒和含氟载氧乳剂，即得到具有靶向功能的pet/超声多功能肠道造影剂。
26.制备的造影剂粒径为460纳米，溶氧量为50%。在808nm的激光照射下，200 μg/ml的产物在1 min内升温到52℃。