系统性红斑狼疮的诊断标志物和诊断产品的制作方法

1.本技术涉及系统性红斑狼疮诊断技术领域，尤其是涉及系统性红斑狼疮的诊断标志物和诊断产品。


背景技术：

2.系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，sle)是一种以产生大量自身抗体，引发全身性炎症反应，引起多组织器官损伤甚至死亡的自身免疫性疾病。sle病情轻重交替，目前没有可以根治的药物，患者需要终身用药。因此，正确的临床诊断从而及早发现，并进行规范化治疗是缓解病情、控制疾病的重要手段。
3.然而，sle常累及全身多个组织器官，导致患者临床表现异质性很高，临床诊断困难。目前临床sle分类诊断标准(2019 eular/acr sle分类诊断标准)包括一项准入指标(entry criteria)、三项免疫学指标(immunological domains)和七项临床表型指标(clinical domains)。患者需要经过多项检查才能进行诊断，包括实验室检查(如血常规、尿常规、肝功能、补体、抗核抗体以及脑脊液检查等)、影像学检查(如超声检查心包积液、肺动脉高压；ct检查肺间质病变等)、查体(包括头部、胸部、腹部、皮肤、神经意识、肌肉骨骼等)以及特殊检查(如肾穿刺活检、腰椎穿刺等)等。但是，该诊断标准存在很多缺陷，在实际应用中对临床经验要求高，操作难度大、耗时长，而且其中涉及的多项侵入性检查也会给病人带来很大痛苦。
4.代谢组学主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物，以此获得基因组和蛋白质组学之外的信息。众所周知，任何疾病的发生和发展都会影响人体代谢，从而导致人体代谢物质发生显著变化。这提示研究人员可以通过比较机体生理与疾病状态、同一疾病的不同分型分期的代谢物差异，找到与疾病诊断等相关的标志物。在各类不同来源的代谢物中，血清代谢物相对较为稳定，并且容易量化，因此，通过血清代谢物进行无创诊断监测疾病具有较高的可行性。
5.近年来，对sle的基础研究有了较大的突破，发现了一些新的潜在的诊断标志物，但大多基于基因组学和蛋白组学的相关研究，而且这些标志物的特异性、灵敏度较低，临床转化意义不高。因此，有必要从代谢组学角度发现新的价值更高的sle诊断标志物。


技术实现要素：

6.本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本技术提出一种系统性红斑狼疮的诊断标志物。
7.本技术的第一方面，提供定量检测以下至少一种代谢物的试剂在制备用于系统性红斑狼疮的诊断产品中的应用：ltb4、9-oxoode、ara、5-oxoete、15-oxoede、9,10-dihome、ada、dha、18-hepe、12,13-dihome。
8.根据本技术实施例的应用，至少具有如下有益效果：
9.本技术通过代谢组学结合生物信息学分析方法来筛选出系统性红斑狼疮患者与
正常人中具有统计学意义的差异血清代谢物组分，利用这些代谢物作为系统性红斑狼疮的诊断标志物，弥补了现有系统性红斑狼疮相关指标的不足，具有较高的诊断价值。
10.其中，ltb4(cas：71160-24-2)是指白三烯酸b4(leukotriene b4)，是花生四烯酸通过5-脂氧合酶、5-脂氧合酶激活蛋白和白三烯a4水解酶的顺序活性产生的促炎症脂质介质。ltb4具有良好的生物学作用，包括通过与称为ltb4r1或ltb4r2的g蛋白偶联受体结合，促进白细胞趋化和调节促炎细胞因子。
11.9-oxoode(cas：54232-59-6)又称9-kode，为9-氧代-10e,12z-十八碳二烯酸(9-oxo-10e,12z-octadecadienoic acid)，属于亚油酸衍生物中的一种。
12.ara(cas：506-32-1)是指花生四烯酸(arachidonic acid，又称aa)，ara介导炎症和多器官及系统的功能。ara是合成一系列生物活性化合物(类二十烷酸)的底物，包括前列腺素、血栓素和白三烯。这些产物本身可以作为介质，也可以作为其他过程的调节器，如血小板聚集、凝血、平滑肌收缩、白细胞趋化性、炎性细胞因子产生和免疫功能。
13.5-oxoete(cas：106154-18-1)又称5-kete或5-keto-ete，为5-氧代己二辛酸四烯酸(5-oxo-eicosatetraenoic acid)，是一种长链脂肪酸，由特定的脱氢酶氧化5-hete得到。
14.15-oxoede(cas：105835-44-7)又称15-kede，为15-氧代-11z,13e-二十碳二烯酸(15-oxo-11z,13e-eicosadienoic acid)，是一种长链脂肪酸。
15.9,10-dihome(cas：263399-34-4)又称9,10-dhome，为9,10-二羟基-12z-十八烷烯酸(9,10-dihydroxy-12z-octadecenoic acid)，是亚油酸二醇的衍生物，作为一种天然存在的增殖物激活受体(ppar)的γ2配体，其刺激脂肪细胞并抑制成骨细胞分化。另外，其显示出嗜中性粒细胞趋化活性，能够通过与呼吸突发抑制剂抑制中性粒细胞激活的多个方面。
16.ada(cas：28874-58-0)为肾上腺酸(adrenic acid)，可在血液和人类髓鞘组织中发现。肾上腺酸参与α-亚麻酸和亚油酸代谢。这种不饱和脂肪酸同时也能够被细胞代谢成生物活性产物。肾上腺酸是一种前列环素抑制剂，可能是一种潜在的血栓前因子。
17.dha(cas：6217-54-5)为二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid)，是ω-3必需脂肪酸。dha最常在鱼油中发现，膳食dha可以减少人类血甘油三酯水平，降低心脏病的风险。
18.18-hepe(cas：141110-17-0)为(+/-)-18-羟基-5z,8z,11z,14z,16e-醇辛烯酸((+/-)-18-hydroxy-5z,8z,11z,14z,16e-eicosapentaenoic acid)，具有作为人类异黄代谢物的作用，是18-hepe(1-)的共轭酸。
19.12,13-dihome(cas：263399-35-5)为(9z)-12,13-二羟基乙基-9-烯酸((9z)-12,13-dihydroxyoctadec-9-enoic acid)，其产生源于细菌环氧化物水解酶(eh)。
20.在本技术的一些实施方式中，试剂定量检测代谢物ltb4、9-oxoode、ara、5-oxoete、15-oxoede、9,10-dihome、ada、dha、18-hepe、12,13-dihome中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或全部十种。
21.在本技术的一些实施方式中，试剂定量检测的代谢物中排除单独的9,10-dihome、18-hepe或12,13-dihome作为标志物。
22.在本技术的一些实施方式中，试剂定量检测以下任一种代谢物：ltb4、9-oxoode、ara、5-oxoete、15-oxoede、ada、dha。
oxoete、15-oxoede、9,10-dihome、ada、dha、18-hepe、12,13-dihome中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或全部十种。
31.在本技术的一些实施方式中，试剂定量检测的代谢物中排除单独的9,10-dihome、18-hepe或12,13-dihome作为标志物。
32.在本技术的一些实施方式中，试剂定量检测以下任一种代谢物：ltb4、9-oxoode、ara、5-oxoete、15-oxoede、ada、dha。
33.在本技术的一些实施方式中，试剂定量检测代谢物ltb4、9-oxoode、ara、5-oxoete、15-oxoede、ada、dha中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或全部七种。
34.在本技术的一些实施方式中，试剂通过液相色谱-质谱的方法检测代谢物。
35.本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
附图说明
36.图1是本技术的实施例1中系统性红斑狼疮患者与正常人的氧化脂质的差异表达和所属代谢通路，其中，a是sle组和对照组中氧化脂质差异表达的欧式距离分析结果，b和c分别是亚麻酸代谢通路和亚油酸代谢通路中发生显著上调或下调的氧化脂质，红色(深色，sle组的相对水平的数值大于1)表示框线内的氧化脂质在sle组中显著上调，绿色(浅色，sle组的相对水平的数值小于1)表示框线内的氧化脂质在sle组中显著下调，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。
37.图2是本技术的实施例1中系统性红斑狼疮患者的诊断标志物的筛选结果，其中，a为标志物的筛选流程图，b是对发现集进行随机森林建模得到的不同标志物组合下的roc曲线，c是对10个标志物的重要性排序结果，d～f是在验证集中分别对筛选出的10个代谢物中的3、5、10个代谢物的组合进行验证的roc曲线，g是d～f中对应的灵敏度和特异性的结果。
具体实施方式
38.以下将结合实施例对本技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本技术保护的范围。
39.下面详细描述本技术的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
40.在本技术的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
41.本技术的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示
意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
42.实施例1
43.1.研究对象
44.收集sle患者和健康对照志愿者的血清样本，sle组中排除患有其他自身免疫性疾病的患者(如类风湿关节炎患者)、患有系统性代谢疾病的患者(如高血压、糖尿病患者)以及不符合2019eular/acr sle诊断标准的患者。其中，sle组为121例，对照组为106例。
45.2.实验方法
46.2.1氧化脂质提取
47.移取200μl样品(血清)至ep管中，加入400μl甲醇(-40度预冷，含同位素内标1μg/ml)，涡旋混匀30s，超声5min(冰水浴)；-20℃静置1h后，将样品4℃，12000rpm离心15min；取上清400μl，加入267μl超纯水，混匀。spe柱纯化样品(solid-phase extraction)：采用prime hlb 1cc(30mg)固相萃取柱(waters corporation)纯化样品。首先加入1ml甲醇和1ml纯水，过柱；然后将样品加入柱子，过柱；然后用1ml 5％的甲醇清洗柱子；最后用1ml甲醇洗脱，得到用于质谱分析的样本。氮气吹干，加入80μl 30％的乙腈复溶。4℃，12000rpm离心15min，取上清进行质谱分析。
48.2.2标准曲线
49.每个物质均有其对应的标准品。准确移取一定量的标准品于ep管中，分别配制成1μg/ml的标准品储备液。取相应量的标准品储备液于ep管中，配制成混合标准溶液。依次稀释该混合标准溶液得一系列校准溶液(含与样品中最终浓度一致的同位素标记内标混合物)。经过质谱分析后，得到每个物质的标准曲线。
50.进行uhplc-ms/ms分析之前，将目标化合物标准溶液引入质谱中。针对每个目标化合物，选取信号强度最高的数个母离子-子离子对(transition)，对其mrm参数进行优化，并选取其中响应最好的离子对用于定量分析，其它离子对用于目标化合物定性分析。
51.2.3质谱分析
52.本项目使用exionlc system(sciex)超高效液相色谱仪，通过waters acquity uplc beh c18(150
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2.1mm,1.7μm,waters)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱a相为含0.01％甲酸水溶液，b相为含0.01％甲酸的乙腈。柱温箱温度为50℃，样品盘设为4℃，进样体积为10μl。
53.本项目使用装备iondrive turbo v esi离子源的sciex 6500qtrap+三重四极杆质谱仪，以多反应监测(mrm)模式进行质谱分析。离子源参数如下：curtain gas＝40psi，ionspray voltage＝-4500v，temperature＝500℃，ion source gas 1＝30psi，ion source gas 2＝30psi。
54.2.4数据分析
55.所有质谱数据采集及目标化合物定量分析工作，均通过sciex analyst work station software(version 1.6.3)和multiquant 3.03software(version 20.2)来完成。根据提前设定好的母离子-子离子对，软件自动对每个物质进行定性分析。最后通过标准曲线，对每个物质进行绝对定量分析。
56.3.实验结果
57.3.1靶向代谢组学研究结果
58.对128种氧化脂质(oxylipin)进行绝对定量分析(得到的结果为血清中的绝对浓度)，其中92个实现了绝对定量，用于后续分析。
59.根据所有92个定量到的氧化脂质进行欧式距离分析，结果如图1的a所示，从图中可以看出，发现sle组(s)与对照组(c)的欧式距离最大，表明两组样本在氧化脂质的表达上差异很大。
60.通过差异分析(student’s t test)，从中得到46个发生显著变化的差异氧化脂质(p《0.05)，对这些氧化脂质进一步分析发现，其主要是亚油酸亚麻酸代谢产物，这两个代谢通路中的差异表达脂质分别如图1的b和c所示。其它像ada(fc(s/c)＝0.61，p《0.001)、15-oxoede(fc(s/c)＝0.36，p《0.001)等下调或上调的氧化脂质独立于上述两个代谢通路。
61.3.2随机森林模型鉴定标志物结果
62.为了鉴定sle诊断的可能生物标志物，基于92个差异表达的血清代谢物构建随机森林(random forest)机器学习模型筛选标志物，方法如图2的a所示：将sle组和对照组分为发现集(84sle，63对照)和验证集(37sle，43对照)，利用发现集基于92个定量氧化脂质构建随机森林模型，筛选出候选标志物，将候选标志物代入验证集中进行验证，得到最终的标志物或标志物的组合。最终筛选出的10个代谢标志物如下：ltb4、9-oxoode、ara(aa)、5-oxoete、15-oxoede、9,10-dihome、ada、dha、18-hepe、12,13-dihome。
63.其中，在发现集中对上述92个差异表达的氧化脂质进行随机森林建模得到的roc曲线如图2的b所示，从图中可以看到，3种代谢物组合的auc可达到0.884，5种代谢物组合的auc可达到0.923，10种代谢物组合的auc可达到0.942。
64.参考图2的c，最终训练出的代谢物诊断模型中，10个差异代谢物被鉴定为潜在的标志物，依照其在模型中的重要性从大到小排序依次为ltb4、9-oxoode、ara、5-oxoete、15-oxoede、9,10-dihome、ada、dha、18-hepe、12,13-dihome。
65.参考图2的d～f，在验证集中分别对图2的c中排名前3(ltb4、9-oxoode、aa)、前5(ltb4、9-oxoode、aa、5-oxoete和15-oxoede)和全部10个标志物的组合进行验证，依照其中3种、5种和全部10种代谢物构建诊断模型均取得了很好的效果，auc分别为0.866、0.868和0.871。比较d～f中对应的灵敏度和特异性，结果如图2的g所示，可以看出，3种、5种或10种代谢物构建的诊断模型的特异性差别不大，大致在76％～79％，但灵敏度在10种代谢物的情况下最好，可以达到81％。从上述结果可以看出，从上述10种代谢物的组合中选择多个或全部10种代谢物构建诊断模型都能够达到很高的诊断效率。
66.在所有样本(包括发现集和验证集的全部样本)中按照上述方法对10种代谢物分别建立单独的诊断模型进行单变量roc曲线分析，评估单个代谢物在sle诊断中的应用前景，结果如表1所示。
67.表1. 10种代谢物的单独诊断价值
[0068][0069]
从表中结果可以看出，ltb4、9-oxoode、ara、5-oxoete、15-oxoede、ada、dha的auc值可以达到0.7以上，即便作为单独的标志物使用也能够达到良好的诊断效用。
[0070]
综合上述结果，本技术实施例所提供的ltb4、9-oxoode、ara、5-oxoete、15-oxoede、9,10-dihome、ada、dha、18-hepe、12,13-dihome的代谢物的组可以从中选择一种或多种代谢物作为标志物构建相应的诊断模型应用到系统性红斑狼疮的诊断，为了达到更好的诊断效果，可以从上述的代谢物的组中选择3个、5个或更多个的代谢物组合作为标志物。当然，为了降低检测的复杂性同时保证检测的准确性，也可以从中选择ltb4、9-oxoode、ara、5-oxoete、15-oxoede、ada、dha这些代谢物作为单一标志物进行诊断。
[0071]
上面结合实施例对本技术作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。