氯法齐明在制备预防、治疗蓝耳病以及抗PRRSV的药物中的应用

氯法齐明在制备预防、治疗蓝耳病以及抗prrsv的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及兽药领域，特别涉及氯法齐明在制备预防、治疗蓝耳病以及抗prrsv的药物中的应用。


背景技术：

2.蓝耳病又称为猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs)，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，prrsv)引起。
3.蓝耳病最早于1987年在美国爆发，随后蔓延到欧洲，我国于1996年分离到prrsv。目前，根据基因组序列和抗原性差异，将prrsv分为两种基因型，一种是以lelystad virus(lv)毒株为代表的欧洲型，也称为prrsv1型，另一种是以atcc vr-2332毒株为代表的美洲型，也称为prrsv 2型。在我国，prrsv主要以美洲型为主，由于prrsv具有免疫抑制性、抗体依赖增强性、持续性感染、潜伏时间以及维持时间长等特点，因此难以防控。
4.prrsv的主要靶细胞包括猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，pams)、肺泡的二型肺细胞(pneumocytes type ii)、外周单核细胞、生精小管(seminiferous tubules)的上皮生殖细胞(epithelial germ cells)和间质内的巨噬细胞，卵巢卵泡中的巨噬细胞。其中猪肺泡巨噬细胞最为敏感，猪肺泡巨噬细胞被prrsv感染后，会导致猪只的免疫系统遭到破坏。
5.蓝耳病还是一种高度接触性病毒性传染病，呈地方流行性。对于不同品种、不同年龄的猪，prrsv均可感染。其传播途径广泛，可通过接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。
6.目前prrs防控主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，但均存在一定的缺点，导致防控效果有限。其中灭活疫苗有如下缺点：需要大剂量接种或应用浓缩抗原，除了免疫期短，常需强化接种，还导致疫苗接种费用高；灭活疫苗细胞免疫的作用弱，此外，产生完全免疫力需要2～3周，不利于紧急预防接种；还存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险。
7.可见，现有技术还有待改进和提高。


技术实现要素：

8.鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供氯法齐明在制备预防、治疗蓝耳病以及抗prrsv的药物中的应用，旨在解决现有技术中防治蓝耳病的药物效果不佳的问题。
9.为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
10.氯法齐明在制备预防蓝耳病的药物中的应用。
11.氯法齐明在制备治疗蓝耳病的药物中的应用。
12.氯法齐明在制备抗prrsv的药物中的应用。
13.有益效果：
14.本发明公开了氯法齐明对prrsv具有显著的抗病毒作用，具体的，本发明通过western blot和qrt-pcr等技术在多个层面上证明了氯法齐明能够显著抑制prrsv感染和复制，具有显著的抗prrsv作用，可以应用于制备预防或治疗蓝耳病的药物，以及用于制备抗prrsv的药物。
附图说明
15.图1为不同浓度的氯法齐明的细胞毒性结果。
16.图2为氯法齐明、prrsv共处理实验中，通过western blot检测细胞中prrsv n蛋白表达量的结果。
17.图3为氯法齐明、prrsv共处理实验中，通过qrt-pcr检测细胞中prrsv n基因表达量的结果。
18.图4为氯法齐明前处理、prrsv后感染实验中，通过western blot检测细胞中prrsv n蛋白表达量的结果。
19.图5为氯法齐明前处理、prrsv后感染实验中，通过qrt-pcr检测细胞中prrsv n基因表达量的结果。
20.图6为prrsv先感染、氯法齐明后添加实验中，通过western blot检测细胞中prrsv n蛋白表达量的结果。
21.图7为prrsv先感染、氯法齐明后添加实验中，通过qrt-pcr检测细胞中prrsv n基因表达量的结果。
具体实施方式
22.为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
23.氯法齐明(cfz)目前主要作为治疗人体瘤型麻风的选用药，以及用于与其他药物搭配治疗肺结核，其适应症较窄，属于二线药物。
24.目前，未有报道公开将氯法齐明用于治疗猪只的蓝耳病，而本发明的技术方案在于：氯法齐明在制备预防、治疗蓝耳病以及抗prrsv药物中的应用。
25.以下实施例为验证氯法齐明安全性及药效的实验，实验结果通过统计学方法进行检验，所有试验均进行至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和t检测分析。所有统计分析均采用以p《0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为spss 16.0和graphpad prism 5。
26.实施例1
27.氯法齐明的细胞毒性实验
28.1.实验材料
29.氯法齐明(clofazimine，cfz):纯度为99.23％,由mce公司提供。
30.cck-8：购自glpbio公司，作为活细胞代谢指示剂，在线粒体酶促还原反应下会产
生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。
31.2.试验方法
32.用含10％胎牛血清的dmem培养液培养marc-145细胞至细胞汇合度为60～70％，弃去培养液，分别加入含氯法齐明倍比稀释的营养液作用48h，以pbs作为对照组，然后加入10％(v/v)的cck-8继续培养3h，使用多功能酶标仪读取450nm吸光度。
33.数据处理：以pbs对照组细胞活性作为100％，倍比稀释的氯法齐明处理的细胞的吸光度比上pbs对照组吸光度，即为在不同浓度氯法齐明下的相对细胞活性，结果如图1所示。
34.3.结果
35.由图1可知，当氯法齐明浓度为1μm及以下时，其对marc-145细胞没有毒性，细胞活性100％。
36.实施例2
37.实验一：氯法齐明、prrsv共处理对细胞抗prrsv的影响
38.以prrsv 2型毒株chr6病毒为例研究氯法齐明的抗prrsv作用。
39.(1)在含10％胎牛血清的dmem培养液的12孔板中培养marc-145细胞至细胞汇合度达70％时，弃去培养液，pbs洗3次，然后用moi＝1的prrsv感染marc-145细胞，同时加入氯法齐明(终浓度为0.5μm和1μm)进行培养，并设不加氯法齐明对照组。培养24h后，弃去培养液，pbs洗3次，然后用0.25％胰酶消化，裂解细胞，测定细胞蛋白浓度，并通过western blot测定细胞中prrsv n蛋白的表达量，结果如图2所示。图中，cfz为氯法齐明。
40.从图2的结果可以看出，氯法齐明能够明显抑制prrsv n蛋白表达，且抑制作用呈剂量依赖性。表明氯法齐明能够明显抑制病毒蛋白表达。
41.(2)在含10％胎牛血清的dmem培养液的12孔板中培养marc-145细胞至细胞汇合度达70％时，弃去培养液，pbs洗3次，然后用moi＝1的prrsv感染marc-145细胞，同时加入氯法齐明(终浓度为0.5μm和1μm)进行培养，并设不加氯法齐明对照组。培养24h后，弃去培养液，pbs洗3次，然后用0.25％胰酶消化，裂解细胞，提取细胞总rna，然后进行反转录，通过qrt-pcr测定细胞中prrsv-n基因/gadph基因的相对表达量，结果如图3所示。
42.从图3的结果可以看出，氯法齐明能够明显抑制prrsv n基因表达，且抑制作用呈剂量依赖性。表明氯法齐明能够明显抑制病毒基因表达。
43.实施例3
44.实验二：氯法齐明前处理、prrsv后感染对细胞抗prrsv的影响
45.(1)在含10％胎牛血清的dmem培养基的12孔板中培养marc-145细胞至细胞汇合度70％时，弃去培养液，pbs洗3次，在不同组别中分别加入不同浓度的氯法齐明(0μm、0.5μm、1μm)，培养4h，然后用moi＝1的prrsv感染marc-145细胞，在含2％胎牛血清的dmem培养液中37℃继续培养24h，培养结束后，弃去培养液，用pbs洗3次，然后用0.25％胰酶消化，裂解细胞，测定细胞蛋白浓度，并通过western blot测定细胞中prrsv n蛋白的表达量，结果如图4所示。
46.从图4的结果可以看出，氯法齐明能够明显抑制prrsv n蛋白表达，且抑制作用呈剂量依赖性。表明先加氯法齐明后接毒能够明显抑制病毒蛋白表达。
47.(2)在含10％胎牛血清的dmem培养基的12孔板中培养marc-145细胞至细胞汇合度
70％时，弃去培养液，pbs洗3次，在不同组别中分别加入不同浓度的氯法齐明(0μm、0.5μm、1μm)，培养4h，然后用moi＝1的prrsv感染marc-145细胞，在含2％胎牛血清的dmem培养液中37℃继续培养24h，培养结束后，弃去培养液，用pbs洗3次，然后用0.25％胰酶消化，裂解细胞，提取细胞总rna，然后进行反转录，通过qrt-pcr测定细胞中prrsv-n基因/gadph基因的相对表达量，结果如图5所示。
48.从图5的结果可以看出，氯法齐明能够明显抑制prrsv n基因表达，且抑制作用呈剂量依赖性。表明先加氯法齐明后接毒能够明显抑制病毒基因表达。
49.实施例4
50.实验三：prrsv先感染、氯法齐明后添加对细胞抗prrsv的影响
51.(1)在含10％胎牛血清的dmem培养基的12孔板中培养marc-145细胞至细胞汇合度70％时，弃去培养液，pbs洗3次，以感染复数moi＝1接毒prrsv培养4h，然后在不同组别中分别加入不同浓度的氯法齐明(0μm、0.5μm、1μm)，在含2％胎牛血清的dmem培养液中37℃继续培养24h，培养结束后，弃去培养液，pbs洗3次，然后用0.25％胰酶消化，裂解细胞，测定细胞蛋白浓度，并通过western blot测定细胞中prrsv n蛋白的表达量，结果如图6所示。
52.从图6的结果可以看出，氯法齐明能够明显抑制prrsv n蛋白表达，且抑制作用呈剂量依赖性。表明先接毒后加氯法齐明能够明显抑制病毒蛋白表达。
53.(2)在含10％胎牛血清的dmem培养基的12孔板中培养marc-145细胞至细胞汇合度70％时，弃去培养液，pbs洗3次，以感染复数moi＝1接毒prrsv培养4h，然后在不同组别中分别加入不同浓度的氯法齐明(0μm、0.5μm、1μm)，在含2％胎牛血清的dmem培养液中37℃继续培养24h，培养结束后，弃去培养液，pbs洗3次，然后用0.25％胰酶消化，裂解细胞，提取细胞总rna，然后进行反转录，通过qrt-pcr测定细胞中prrsv-n基因/gadph基因的相对表达量，结果如图7所示。
54.从图7的结果可以看出，氯法齐明能够明显抑制prrsv n基因表达，且抑制作用呈剂量依赖性。表明先接毒后加氯法齐明能够明显抑制病毒基因表达。
55.本发明通过上述实施例在细胞实验水平上证明了，氯法齐明在不同时期添加，均具有抑制病毒基因和蛋白表达的能力，能够应用于制备预防或治疗蓝耳病以及抗prrsv的药物。
56.可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。