一种皮肤修护、抗衰的微生态组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及化妆品领域，具体是涉及一种皮肤修护、抗衰的微生态组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.皮肤屏障是抵御外界环境刺激的重要器官，在大多数的消费者认知中，皮肤屏障一般是指物理屏障。但实际上，皮肤屏障大体分为四层，由外至内，依次为微生物屏障、化学屏障、物理屏障和免疫屏障。其中，微生物屏障是皮肤屏障的最外层，由皮肤表层的微生物群落组成，维持皮肤微生态平衡，参与皮肤多项生理机能等。化学屏障包含着维持皮肤表面酸性ph值的因子和天然保湿因子(nmf)。物理屏障由皮脂膜、角质形成细胞以及细胞间脂质共同构成的“砖墙”结构，该结构主要起保持皮肤水分、防止体内水分蒸发、抵御外界异物侵入体内的作用。免疫屏障是皮肤屏障的最后部分，在表皮和真皮中有着各种免疫细胞，能进一步促进屏障的修复，与其他皮肤屏障高度相关联。
3.化妆品中对于受损皮肤屏障的修护多围绕砖墙结构展开，往往忽略了其他屏障的重要性、关联性。近年来，随着中国消费者对益生菌的认识越来越深入，护肤的观念越来越成熟，意识到微生态系统失衡，会导致益生菌数量减少甚至消失，进而引起菌群失衡；皮肤抵抗力降低，易发炎、感染；皮肤异常敏感，反复长痘；皮肤屏障作用降低，易干燥、紧绷、发痒等皮肤问题。目前针对微生态的护肤产品主要有两种：一种是直接利用益生菌代谢产物，另一种是将益生元(对益生菌生长有促进作用的成分)作为组分添加到产品中，从而促进皮肤原有益生菌生长。
4.乳酸菌作为人体必不可缺少的一类菌群，广泛应用于食品行业，随着化妆品中对于除砖墙结构外其他皮肤屏障的重要性、关联性的认识，乳酸菌在化妆品中的应用也受到人们的关注。乳酸菌能够经历长达数周在无氧环境中缓慢发酵，将碳水化合物和糖分转化成皮肤喜好的酶和氨基酸，使有效成分被分解和微化。但是皮肤作为人体屏障，益生菌透过皮肤屏障信息传达的效果甚微，直接涂抹乳酸菌或者代谢体，又容易诱发皮肤的拮抗作用，引发皮肤刺激问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供了一种皮肤修护、抗衰的微生态组合物及其制备方法和应用。本发明的组合物利用聚季铵盐-51自身结构特性，促进活性成分的深层渗透，可从皮肤内部改善肤色、减少皱纹生成；同时，组合物中的乳酸杆菌发酵溶胞产物采用高压均质法对乳酸菌体进行破壁处理，保留活性成分的同时，去除了细胞质中的致敏成分。
6.为达到本发明的目的，本发明的皮肤修护、抗衰的微生态组合物包含乳酸杆菌发酵溶胞产物、β-葡聚糖发酵液和聚季铵盐-51。
7.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述乳酸杆菌发酵溶胞产物为去除细胞
壁颗粒和细胞质蛋白成分的乳酸杆菌发酵溶胞产物。
8.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述乳酸杆菌发酵溶胞产物的制备方法为：取乳酸杆菌按照0.5-5％的接种量接种于mrs液体培养基，置于摇床35-45℃，100-200rpm培养1-3天，巴氏灭菌，离心，收集乳酸菌菌体，用灭菌蒸馏水洗涤，将菌体重悬于灭菌蒸馏水中，备用；取悬浮菌体液，利用高压均质机进行破壁处理，温度70-90℃，压力400-600bar，破壁，离心，收集上清液，4-6℃静置12-24h，过滤，收集滤液，即得乳酸杆菌发酵溶胞产物。
9.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述β-葡聚糖发酵液的制备中，在发酵后期利用发酵体系内源性β-1,3-葡聚糖酶进行多糖分子量酶解。
10.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述β-葡聚糖发酵液的制备方法为：
11.a.取裂褶菌菌株培养，斜面种子25-30℃培养6-8天，从斜面试管中用接种环取菌丝，转入装液量100-150ml的种子瓶中，培养温度为25-30℃，转速为100-200r/min，培养2.5-3.5天后，将一级种子培养液以5-10％的接种量转入二级种子培养瓶中，继续培养6-8天，即得二级种子培养液；
12.b.取二级种子培养液以2-5％的接种量转入发酵罐中，调节罐内压保持在0.02-0.04mpa，通气量的控制依据为料液体积：空气体积在1：0.5-1.2之间，搅拌转速为100-200r/min，温度为25-30℃，培养3.5-4.5天，离心除去菌体，利用发酵体系内源性β-1,3-葡聚糖酶进行多糖分子量酶解，温度为37-43℃，ph为5.3-5.8，酶解时间为18-30h，过滤，收集滤液，得β-葡聚糖发酵液。
13.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述β-葡聚糖发酵液的多糖含量为0.4-1.2％。
14.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述聚季铵盐-51为质量浓度2-6％的聚季铵盐-51水溶液。
15.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述乳酸杆菌发酵溶胞产物：β-葡聚糖发酵液：聚季铵盐-51的质量比为1-5：0.5-2：1-3。
16.优选地，在本发明的一些实施方式中，所述乳酸杆菌发酵溶胞产物：β-葡聚糖发酵液：聚季铵盐-51的质量比为2.5-3.5：0.8-2：1-3。
17.另一方面，本发明还提供了一种前述皮肤修护、抗衰的微生态组合物的制备方法，所述方法包含以下步骤：
18.(1)取裂褶菌菌株培养，斜面种子25-30℃培养6-8天，从斜面试管中用接种环取菌丝，转入装液量100-150ml的种子瓶中，培养温度为25-30℃，转速为100-200r/min，培养2.5-3.5天后，将一级种子培养液以5-10％的接种量转入二级种子培养瓶中，继续培养6-8天，即得二级种子培养液；
19.(2)取二级种子培养液以2-5％的接种量转入发酵罐中，调节罐内压保持在0.02-0.04mpa，通气量的控制依据为料液体积：空气体积在1：0.5-1.2之间，搅拌转速为100-200r/min，温度为25-30℃，培养3.5-4.5天，离心除去菌体，利用发酵体系内源性β-1,3-葡聚糖酶进行多糖分子量酶解，温度为37-43℃，ph为5.3-5.8，酶解时间为18-30h，过滤，收集滤液，得β-葡聚糖发酵液，备用；
20.(3)取乳酸杆菌按照0.5-5％的接种量接种于mrs液体培养基，置于摇床35-45℃，
100-200rpm培养1-3天，巴氏灭菌，离心，收集乳酸菌菌体，用灭菌蒸馏水洗涤，将菌体重悬于灭菌蒸馏水中，备用；
21.(4)取悬浮菌体液，利用高压均质机进行破壁处理，温度70-90℃，压力400-600bar，破壁，离心，收集上清液，4-6℃静置12-24h，过滤，收集滤液，即得乳酸杆菌发酵溶胞产物，备用；
22.(5)按比例将乳酸杆菌发酵溶胞产物、β-葡聚糖发酵液、聚季铵盐-51水溶液混合均匀，即得皮肤修护、抗衰的微生态组合物。
23.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述步骤(1)中菌株培养的培养基组成为葡萄糖25-35g/l，酵母浸膏2-4g/l，kh2po
4 0.8-1.2g/l，mgso4·
7h2o 0.4-0.6g/l，ph为4-5，加1.5-2.5％琼脂。
24.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述步骤(2)中发酵罐培养基组成为葡萄糖25-35g/l，酵母浸膏2-4g/l，kh2po
4 0.8-1.2g/l，mgso4·
7h2o 0.4-0.6g/l，消泡剂0.04-0.06％，ph为4-5。
25.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述破壁是破壁4-6min，间隙4-6min，反复3-5次。
26.再一方面，本发明还提供了一种前述皮肤修护、抗衰的微生态组合物的应用，所述应用是将所述组合物制备成化妆品或是用作化妆品助剂、添加剂。
27.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述化妆品包括但不限于水剂、精华、乳液、膏霜等。
28.与现有技术相比，本发明的优点如下：
29.(1)本发明组合物中的乳酸杆菌发酵溶胞产物，利用高压均质法进行乳酸菌体的破壁处理，释放细胞内活性物质，通过冷却及过滤去除细胞质中大分子蛋白质成分，使得乳酸菌作用皮肤时致敏成分的影响最小化；
30.(2)本发明组合物中的β-葡聚糖发酵液发酵后期利用内源性的β-1,3-葡聚糖内切酶对产物多糖进行降解，使发酵和降解一体化，简化了制备工艺，降低了生产成本；
31.(3)本发明组合物中的聚季铵盐-51利用自身纳米胶束的仿细胞膜结构特性，将乳酸杆菌破壁后的活性物质以及β-葡聚糖降解后的小分子多糖进行包封，有效提升了活性物质的渗透性，作用于真皮层。
附图说明
32.图1是本发明角质细胞基因表达试验结果示意图；
33.图2是本发明皮肤光泽度改善率实验结果；
34.图3是本发明眼角皱纹总体尺寸减小率实验结果。
具体实施方式
35.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
36.本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
37.当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
38.此外，下面所描述的术语“一个实施例”、“一些实施方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。而且，本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
39.实施例1-7
40.一种皮肤修护、抗衰的微生态组合物，采用以下工艺制备：
41.s1，取裂褶菌菌株培养，斜面种子25℃培养7天，从斜面试管中用接种环取两环菌丝，转入装液量120ml的250ml一级种子瓶中，培养温度为25℃，转速为180r/min，培养3天后，将一级种子培养液以5％的接种量转入250ml二级种子培养瓶中，继续培养7天，即得二级种子培养液；
42.s2，取二级种子培养液以3％的接种量转入发酵罐中，调节罐内压保持在0.04mpa，通气量在1:1(料液体积：空气体积)，搅拌转速为180r/min，温度为25℃，培养4天，高速管式离心除去菌体，利用发酵体系内源性β-1,3-葡聚糖酶进行多糖分子量酶解，温度为40℃，ph为5.5，酶解时间为24h，过滤，收集滤液，得β-葡聚糖发酵液，备用；
43.s3，取乳酸杆菌按照2％的接种量接种于mrs液体培养基，置于摇床37℃，180rpm培养3天，巴氏灭菌30min，离心(5000rpm，15min)收集乳酸菌菌体，用灭菌蒸馏水洗涤3次，将菌体重悬于5倍灭菌蒸馏水中，备用；
44.s4，取悬浮菌体液，利用高压均质机进行破壁处理，温度80℃、压力500bar，破壁时间20min(破壁5min，间隙5min，反复4次)，离心，收集上清液，4℃静置24h，过滤，收集滤液，即得乳酸杆菌发酵溶胞产物，备用；
45.s5，按比例将乳酸杆菌发酵溶胞产物、β-葡聚糖发酵液、聚季铵盐-51水溶液混合均匀，即得一种皮肤修护、抗衰的微生态组合物。
46.对比例1
47.一种皮肤修护、抗衰的微生态组合物，采用以下工艺制备：
48.s1，取裂褶菌菌株培养，斜面种子25℃培养7天，从斜面试管中用接种环取两环菌丝，转入装液量120ml的250ml一级种子瓶中，培养温度为25℃，转速为180r/min，培养3天后，将一级种子培养液以5％的接种量转入250ml二级种子培养瓶中，继续培养7天，高速管式离心除去菌体，收集滤液，得β-葡聚糖发酵液，备用；
49.s2，取乳酸杆菌按照2％的接种量接种于mrs液体培养基，置于摇床37℃，180rpm培养3天，巴氏灭菌30min，离心(5000rpm，15min)收集乳酸菌菌体，用灭菌蒸馏水洗涤3次，将菌体重悬于5倍灭菌蒸馏水中，备用；
50.s3，取悬浮菌体液，利用高压均质机进行破壁处理，温度80℃、压力500bar，破壁时间20min(破壁5min，间隙5min，反复4次)，离心，收集上清液，4℃静置24h，过滤，收集滤液，即得乳酸杆菌发酵溶胞产物，备用；
51.s4，按比例将乳酸杆菌发酵溶胞产物、β-葡聚糖发酵液、聚季铵盐-51水溶液混合均匀，即得一种皮肤修护、抗衰的微生态组合物。
52.对比例2
53.一种皮肤修护、抗衰的微生态组合物，采用以下工艺制备：
54.s1，取裂褶菌菌株培养，斜面种子25℃培养7天，从斜面试管中用接种环取两环菌丝，转入装液量120ml的250ml一级种子瓶中，培养温度为25℃，转速为180r/min，培养3天后，将一级种子培养液以5％的接种量转入250ml二级种子培养瓶中，继续培养7天，即得二级种子培养液；
55.s2，取二级种子培养液以3％的接种量转入发酵罐中，调节罐内压保持在0.04mpa，通气量在1:1(料液体积：空气体积)，搅拌转速为180r/min，温度为25℃，培养4天，高速管式离心除去菌体，利用发酵体系内源性β-1,3-葡聚糖酶进行多糖分子量酶解，温度为40℃，ph为5.5，酶解时间为24h，过滤，收集滤液，得β-葡聚糖发酵液，备用；
56.s3，取乳酸杆菌按照2％的接种量接种于mrs液体培养基，置于摇床37℃，180rpm培养3天，巴氏灭菌30min，离心(5000rpm，15min)收集乳酸菌菌体，用灭菌蒸馏水洗涤3次，将菌体重悬于5倍灭菌蒸馏水中，备用；
57.s4，取悬浮菌体液，利用超声波进行破壁处理，温度80℃，常压，破壁时间20min(破壁5min，间隙5min，反复4次)，离心，收集上清液，4℃静置24h，过滤，收集滤液，即得乳酸杆菌发酵溶胞产物，备用；
58.s5，按比例将乳酸杆菌发酵溶胞产物、β-葡聚糖发酵液、聚季铵盐-51水溶液混合均匀，即得一种皮肤修护、抗衰的微生态组合物。
59.对比例3
60.一种皮肤修护、抗衰的微生态组合物，采用以下工艺制备：
61.s1，取裂褶菌菌株培养，斜面种子25℃培养7天，从斜面试管中用接种环取两环菌丝，转入装液量120ml的250ml一级种子瓶中，培养温度为25℃，转速为180r/min，培养3天后，将一级种子培养液以5％的接种量转入250ml二级种子培养瓶中，继续培养7天，即得二级种子培养液；
62.s2，取二级种子培养液以3％的接种量转入发酵罐中，调节罐内压保持在0.04mpa，通气量在1:1(料液体积：空气体积)，搅拌转速为180r/min，温度为25℃，培养4天，高速管式离心除去菌体，利用发酵体系内源性β-1,3-葡聚糖酶进行多糖分子量酶解，温度为40℃，ph为5.5，酶解时间为24h，过滤，收集滤液，得β-葡聚糖发酵液，备用；
63.s3，取乳酸杆菌按照2％的接种量接种于mrs液体培养基，置于摇床37℃，180rpm培养3天，巴氏灭菌30min，离心(5000rpm，15min)收集乳酸菌菌体，用灭菌蒸馏水洗涤3次，将菌体重悬于5倍灭菌蒸馏水中，备用；
64.s4，取悬浮菌体液，利用高压均质机进行破壁处理，温度80℃、压力500bar，破壁时间20min(破壁5min，间隙5min，反复4次)，离心，收集上清液，4℃静置24h，过滤，收集滤液，即得乳酸杆菌发酵溶胞产物，备用；
65.s5，按比例将乳酸杆菌发酵溶胞产物、β-葡聚糖发酵液混合均匀，即得一种皮肤修护、抗衰的微生态组合物。
66.实施例1-7和对比例1-3的组合物采用上述方法制备获得，所述制备方法中各成分质量比如表1所示，其中，所述聚季铵盐-51水溶液的质量浓度为4％。
67.表1各实施例及对比例各成分组成质量比
[0068][0069][0070]
性能测试1：角质细胞基因表达试验
[0071]
caspase14(casp14，天冬胺酶蛋白水解酶)是参与表皮细胞终末分化及皮肤屏障形成的关键酶，可作为评价皮肤屏障功能状态的指标。
[0072]
采用实时荧光定量pcr法检测组合物对靶标基因表达量的调节。
[0073]
阴性对照(不含组合物nt)；阳性对照(含0.01％质量浓度的透明质ha)；实施例1-7和对比例1-3的培养基中，各组质量浓度为0.1％。
[0074]
hacat细胞以3*105/孔接种至6孔板上，培养24h，细胞贴壁生长。将样品配制成1x、共2个浓度的梯度稀释剂量点，每孔2ml加入细胞板，于37℃5％co2恒温培养箱继续孵育24h之后，收集细胞，应用purelink mini rna抽提试剂盒对细胞总rna进行提取，核酸浓度定量，每管200-800ng rna作为模板，taqman一步法反应(逆转录+real time-pcr)进行实时定量荧光pcr检测各个基因的相对表达量(20μl体系)。
[0075]
计算公式：
[0076]
fold change＝2-δδct
；
[0077]-δδct＝[(ct靶标基因
–
ct内参基因)待测组-(ct靶标基因
–
ct内参基因)对照组]。
[0078]
此试验中，靶标基因为casp14，内参基因1个，为gapdh。
[0079]
测试结果如附图1所示：
[0080]
1)实施例1-3组合物的casp14基因表达活性随乳酸杆菌发酵溶胞产物的增加而升高，具有一定量效关系；
[0081]
2)实施例2、4、5组合物的casp14基因表达随β-葡聚糖发酵液的增加而升高，具有一定量效关系；
[0082]
3)实施例4、6、7组合物的casp14基因表达随聚季铵盐-51水溶液的增加，先上升后下降，推测是因聚季铵盐-51的促渗作用，含量超过一定量时，加速活性成分通过表皮层，到达真皮层；
[0083]
4)实施例6的casp14基因表达显著优于对比例1，说明发酵后期利用内源性的β-1,3-葡聚糖内切酶进行酶解对casp14基因表达有正向促进作用；
[0084]
5)实施例6的casp14基因表达优于对比例2，说明高压均质法可有效促进乳酸菌溶胞产物内的活性物质的释放，有益于casp14基因表达；
[0085]
6)实施例6的casp14基因表达优于对比例3，说明聚季铵盐-51对casp14基因表达有一定的促进作用。
[0086]
综上所述，实施例6的皮肤修护、抗衰的微生态组合物为优选。
[0087]
性能测试2：皮肤光泽度、皮肤皱纹改善试验
[0088]
筛选健康志愿者30名，年龄在25-40岁。使用含实施例6皮肤修护、抗衰的微生态组合物的乳液(分别含组合物1％、3％)，全脸使用，早晚各1次，每次约3-4粒黄豆大小，连续使用4周，利用skinglossmeter测量皮肤光泽度，利用antera 3d测量皮肤皱纹，结果如附图2-3所示。
[0089]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。