G699-0288在制备治疗和/或预防食管癌药物中的应用

g699-0288在制备治疗和/或预防食管癌药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，特别涉及g699-0288在制备治疗和/或预防食管癌药物中的应用。


背景技术：

2.食道癌是世界上最致命的癌症之一，其发病率和死亡率均位居中国前十，其中90％的死亡率是由肿瘤转移引起。肿瘤转移步骤复杂，难以研究，特别是关于食管鳞状细胞癌(escc)中转移的相关基因，几乎没有信息和功能验证。因此，对调节癌症转移的关键驱动因素和信号通路进行全面调查，将为癌症治疗提供新的线索。
3.手术、放疗、化疗和分子靶向药物是治疗食管癌的几大主要手段。其中手术和放疗为局部治疗，化疗和分子靶向药物治疗为全身治疗。然而临床常用的抗癌药物往往具有一定的毒副作用，且化疗过程中出现的耐受性导致了病人术后复发和较差的预后，治疗难度增加。小分子药物能够特异性地阻断肿瘤生长、增殖过程中所必需的信号传导通路，从而达到治疗的目的。小分子抑制剂具有如下优点：(1)口服生物利用度高；(2)生理屏障的渗透性好，可穿过细胞膜，作用于胞内靶点；(3)成本较低。因此发展小分子化合物作为癌症治疗的药物，在药效，价格上有很大的优势。
4.g699-0288是一种小分子化合物，目前尚未见有g699-0288在抑制癌细胞，尤其是抑制癌细胞侵袭转移中的应用。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供g699-0288在制备治疗和/或预防食管癌药物中的应用。
6.本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：
7.g699-0288在制备治疗和/或预防食管癌药物中的应用。
8.所述的g699-0288的结构式如式(ⅰ)所示：
[0009][0010]
所述的g699-0288的有效浓度优选为100～200nm。
[0011]
所述的治疗和/或预防食管癌药物为能够抑制食管癌细胞侵袭和/或转移的药物。
[0012]
所述的食管癌优选包括但不限于食管鳞癌。
[0013]
g699-0288通过靶向mest基因抑制食管癌的侵袭转移。
[0014]
一种用于治疗和/或预防食管癌的药物，包括g699-0288。
[0015]
所述的用于治疗和/或预防食管癌的药物还包含药学上可接受的辅料。
[0016]
所述的药学上可接受的辅料优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂中的至少一种。
[0017]
所述的用于治疗和/或预防食管癌的药物的给药方式包括但不限于口服给药。
[0018]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0019]
本发明首次发现小分子化合物g699-0288能够抑制食管癌的侵袭转移，具体通过靶向mest抑制食管癌的侵袭转移。
附图说明
[0020]
图1为g699-0288的结构式图。
[0021]
图2为mest基因对人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc和人食管鳞癌细胞kyse410的侵袭能力结果图。
[0022]
图3为mest基因对人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc肺转移能力结果图。
[0023]
图4为g699-0288与mest基因表面等离子体共振分析结果图。
[0024]
图5为不同浓度的g699-0288对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响结果图。
[0025]
图6为g699-0288对食管鳞癌细胞肺转移能力的荧光检测结果图。
[0026]
图7为g699-0288对小鼠肝肺肾功能的免疫组化结果图。
具体实施方式
[0027]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0028]
g699-0288由上海陶素生化科技有限公司合成，结构式如图1所示；人食管鳞癌细胞kyse150、人食管鳞癌细胞kyse410购于德国微生物及细胞培养物有限公司；lb培养基购自于生工生物工程(上海)股份有限公司、0.25％的胰酶购自于美国gibco。实验雌性小鼠(nod-scid)购于江苏集萃药康生物科技有限公司。
[0029]
人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc已记载在wen wen xu et al.direct targeting of creb1 with imperatorin inhibits tgfβ2-erk signaling to suppress esophageal cancer metastasis,advanced science,2020.doi：10.1002/advs.202000925中。
[0030]
kyse150-luc-lm5细胞构建方法：0.25％的胰酶将人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc消化成单细胞，将106个人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc重悬于100μl pbs缓冲液中，尾静脉注射到小鼠体内；饲养5至6周后，腹腔注射d-luciferin(购自goldbio公司)，进行活体荧光拍照；对发生肺转移的小鼠解剖，取出有kyse150-luc细胞转移的肺部；对肺部切碎至肉糜状，培养基重悬；静置一周后，psb缓冲液清洗两次，加入blasticidin(5μg/ml，购于上海碧云天生物技术有限公司)，筛选一周至无细胞死亡，此细
胞为kyse150-luc-lm1。之后0.25％的胰酶将人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc-lm1消化成单细胞，将106个人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc-lm1重悬于100μlpbs缓冲液中，尾静脉注射到小鼠体内；饲养5至6周后，腹腔注射d-luciferin(购自goldbio公司)，进行活体荧光拍照；对发生肺转移的小鼠解剖，取出有kyse150-luc-lm1细胞转移的肺部；对肺部进行切碎至肉糜状，培养基重悬；静置一周后，psb缓冲液清洗两次，加入blasticidin(5μg/ml，购于上海碧云天生物技术有限公司)，筛选一周至无细胞死亡，此细胞为kyse150-luc-lm2。如此循环五次，即得kyse150-luc-lm5细胞。
[0031]
kyse410-i6细胞已记载在hui-fang hu,et al.identification of mir-515-3p and its targets,vimentin and mmp3,as a key regulatory mechanism in esophageal cancer metastasis:functional and clinical significance,signal transduction and targeted therapy,2020,01:206-218.中。
[0032]
mest基因稳定过表达的人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc(即kyse150-luc-mest细胞)和mest基因稳定过表达的人食管鳞癌细胞kyse410(即kyse410-mest细胞)构建方法：
[0033]
mest基因构建在ptsb-cmv-mcs-sbp-3flag-copgfp-f2a-puror表达载体上，得到mest真核表达质粒(委托上海权阳生物科技有限公司构建)。构建好的质粒转化入293t细胞中，将生长状态良好的293t细胞经消化后铺于6孔板。待细胞长至50％-60％时进行mest真核表达质粒转染。之后24小时，48小时后对细胞进行换液，收集上清。上清进行离心，并用0.45μm的滤膜进行过滤。上清分别加入kyse150-luc细胞和人食管癌kyse410细胞中，感染48小时后细胞从六孔板转移至小瓶内，贴壁后加入工作浓度为1μg/ml的嘌呤霉素(购于sigma-aldrich公司)进行筛选，1-2周后，细胞不再发生死亡时停止加药，即得mest基因稳定过表达的人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc(即kyse150-luc-mest细胞)和mest基因稳定过表达的人食管鳞癌细胞kyse410(即kyse410-mest细胞)，经western blot鉴定该细胞能够过表达mest。
[0034]
实施例1：mest基因能够提高人食管鳞癌细胞的转移侵袭能力。
[0035]
1.对食管鳞癌细胞进行mest稳定过表达，然后通过invasion实验以及小鼠体内实验检测细胞侵袭能力。
[0036]
(1)invasion实验
[0037]
1)小室处理：干净的侵袭小室加入100μl 5％基质胶，置于37℃培养箱30分钟。
[0038]
2)铺细胞：分别将mest基因(genbank:d78611.1)稳定过表达的人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc(即kyse150-luc-mest细胞)和mest基因稳定过表达的人食管鳞癌细胞kyse410(即kyse410-mest细胞)用0.25％的胰蛋白酶消化成悬浮的单细胞，计数后分别按照每个小室50万kyse150-luc-mest细胞和20万kyse410-mest细胞加入小室上层，下层加入500μl完全培养基，在37℃、5％co2条件下培养24h。同时以人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc、人食管鳞癌细胞kyse410作为对照进行上述实验。
[0039]
3)结晶紫染色：拿出小室，pbs缓冲液(ph7.4，购于sigma-aldrich公司；下同)洗两次，加500μl甲醇于下室，固定10min，吸去甲醇，加入0.2％结晶紫染色10min，吸掉结晶紫后清水洗去残余结晶紫，晾干后拍照。
[0040]
(2)体内实验
[0041]
选取12只6周龄、雌性小鼠(nod-scid)，对照组6只和实验组6只，构建肿瘤转移模型。
[0042]
(1)0.25％的胰酶分别将人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc和kyse150-luc-mest细胞消化成单细胞。分别将106个人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc和kyse150-luc-mest食管鳞癌细胞重悬于100μl pbs缓冲液中。
[0043]
(2)在动物进行尾静脉实验前对小鼠进行麻醉，通过无痛及有痛刺激来评估麻醉程度，确定小鼠处于麻醉状态；
[0044]
(3)用25g针头的微注射器重悬细胞对小鼠进行尾静脉注射，一共12只。
[0045]
饲养5至6周后，腹腔注射d-luciferin(购自goldbio公司)，进行活体荧光拍照，观察癌细胞肺转移情况。
[0046]
结果如图2和3所示，从图2的体外实验结果可知，mest基因能够提高人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc和人食管鳞癌细胞kyse410细胞的抗侵袭能力。从图3的体内实验结果可知，mest基因可以促进小鼠中人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc肺转移。
[0047]
2.表面等离子体共振分析mest与化合物g699-0288的结合。
[0048]
(1)mest蛋白表达纯化
[0049]
mest基因构建在pet-32a原核表达载体，且带his标签，得到mest原核表达质粒(委托上海权阳生物科技有限公司完成)。构建好的质粒转化入bl21感受态细胞中，涂板后挑取表达mest的菌体于10ml lb培养基中，37℃，250rpm，过夜，得到菌液；转接1％上述菌液于1l lb培养基中，37℃，250rpm，摇3小时，当od值为0.6-0.8时，加入iptg(工作浓度为0.5mm)，诱导表达4小时；离心收集1l表达mest的菌体，100ml缓冲液进行重悬，冰浴超声(300w，超声10秒，间隔10秒，30次)，离心后分别收集上清，并上样于平衡好的nta纯化柱；上样完成后，使用缓冲液对柱子进行洗杂；10mm，20mm，50mm，200mm，500mm的咪唑缓冲液对柱子进行洗脱，收集洗脱液；western blot对各组洗脱液进行鉴定，最终将含有目的蛋白的组分混合一起进行超滤浓缩。蛋白液-80℃保存备用。
[0050]
(2)表面等离子体共振(spr)实验
[0051]
选择新的cm7芯片，待芯片锁定后，更换0.4％(v/v)p20的pbs缓冲液(ph 7.4，购于sigma-aldrich公司)，对芯片表面进行平衡；将mest稀释于不同ph(ph分别为4，4.5，5，5.5)、3m的醋酸钠缓冲液(购于sigma aldrich)中，流经空白的芯片表面，测试静电吸附的效果；选择合适的ph的环境对芯片进行偶联，手动模式对偶联量以及时间进行尝试，以达到一个好的效果；电泳缓冲液对g699-0288进行多浓度的稀释(稀释后g699-0288的浓度分别为3.125nm、6.25nm、12.5nm、25nm、50nm、100nm)，但要确保与电泳缓冲液中dmso含量一致；手动上样，测试不同浓度的g699-0288相应值；根据响应值选择g699-0288的合适浓度进行亲和力测定；最后利用biacore软件进行分析，最终得到g699-0288与mest的解离常数。
[0052]
图4的表面等离子体共振结果显示，g699-0288可以与mest蛋白结合。
[0053]
实施例2：g699-0288功能验证
[0054]
(1)invasion实验
[0055]
用不同浓度的g699-0288处理食管鳞癌细胞，然后进行食管鳞癌细胞侵袭能力的检测，研究不同浓度的g699-0288对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响。
[0056]
(1)小室处理：干净的侵袭小室加入100μl 5％基质胶，置于37℃培养箱30分钟。
[0057]
(2)铺细胞：将具有高侵袭性的人食管鳞癌细胞kyse150-luc-lm5和kyse410-i6细胞用0.25％的胰蛋白酶消化成悬浮的单细胞，计数后按照每个小室50万kyse150-luc-lm5细胞以及20万kyse 410-i6细胞加入小室上层，并加入不同浓度的g699-0288(终浓度分别为0，100nm，200nm)；下层加入500μl完全培养基，在37℃、5％co2条件下培养24h。
[0058]
(3)结晶紫染色：拿出小室，pbs缓冲液洗两次，加500μl甲醇于下室，固定10min，吸去甲醇，加入0.2％结晶紫染色10min，吸掉结晶紫后清水洗去残余结晶紫，晾干后拍照。
[0059]
由图5的体外试验结果可知，食管鳞癌细胞的侵袭能力随着g699-0288浓度的增加而减弱。
[0060]
(2)体内实验
[0061]
选取12只6周龄、雌性小鼠(nod-scid)对照组6只和实验组6只，构建肿瘤转移模型。
[0062]
(1)0.25％的胰酶将人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc-lm5细胞消化成单细胞；将106个人食管鳞癌荧光素酶标记细胞kyse150-luc-lm5食管鳞癌细胞重悬于100μlpbs缓冲液中。
[0063]
(2)在实验之前对小鼠进行麻醉，通过无痛及有痛刺激来评估麻醉程度，确定小鼠处于麻醉状态；
[0064]
(3)用25g针头的微注射器重悬细胞对小鼠进行尾静脉注射，一共12只。
[0065]
(4)g699-0288处理：尾静脉注射食管鳞癌细胞kyse150-luc-lm5一周后，用灌胃的方式对小鼠进行给药。g699-0288溶解于pbs缓冲液中，对每组小鼠进行给药处理，药的浓度分别为0mg/kg(即对照组)，5mg/kg(即实验组)，各6只，一周一次。5至6周后，腹腔注射d-luciferin(购自goldbio)，进行活体荧光拍照，观察癌细胞转移情况。
[0066]
结果如图6和7所示，从图6的体内实验结果可知，g699-0288处理后的小鼠肺部的生物荧光减少。生物荧光由食管鳞癌kyse150-luc-lm5细胞中的luciferase与体液中的d-luciferin发生酶促反应，荧光的强度反映了kyse150-luc-lm5细胞的密度。因此，g699-0288处理组(即实验组)中，食管癌细胞肺转移的数量显著比对照组少。
[0067]
将g699-0288处理后(5mg/kg)的小鼠取出肝肺肾进行免疫组化，结果显示(如图7)g699-0288对小鼠肝肺肾功能无影响。
[0068]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。