用于治疗氧化应激的疾病和损伤的前药的制作方法

5个字母；p《0.05)和提高了rp患者(n＝30)的nac的房水浓度(campochiaro pa,iftikhar m,hafiz g,akhlaq a,tsai g,wehling d,lu l,wall gm,singh ms,kong x.oral n-acetylcysteine improves cone function in retinitis pigmentosa patients in phase i trial.j clin invest.2020.https://doi.org/10.1172/jci132990)。
15.naca用于色素性视网膜炎。第15/523,665号美国专利申请教导了naca用于治疗rp的用途。已显示naca比nac在更大程度上改善rp小鼠模型的视觉参数。
16.角膜内皮细胞存活。nac增加了细胞培养物和小鼠模型的角膜内皮存活(kim ec,meng h；jun as.n-acetylcysteine increases corneal endothelial cell survival in a mouse model of fuchs endothelial corneal dystrophy.exp eye res 2014；127:20-25.)。
17.白内障。nac已经显示出保护眼睛晶状体免受氧化诱导的白内障，预防玻璃体切除术后的白内障或抑制早期糖尿病性白内障的进展的活性(wang p,liu xc,yan h,li my.hyperoxia-induced lens damage in rabbit:protective effects of n-acetylcysteine.mol vis.2009；15:2945-52；liu xc,wang p,yan h.a rabbit model to study biochemical damage to the lens after vitrectomy:effects of n-acetylcysteine.exp eye res.2009；88(6):1165-70.doi:10.1016/j.exer.2009.01.001.；zhang s,chai fy,yan h,guo y,harding j,effects of n-acetylcysteine and glutathione ethyl ester drops on streptozotocin-induced diabetic cataract in rats.mol vis.2008；14:862-70.)。
18.naca已经显示出抑制亚硒酸钠-诱导的和l-丁硫氨酸-(s,r)-诱导的白内障(分别为maddirala et al.bmc ophthalmology(2017)17:54；and carey jw,pinarci ey,penugonda s,karacal h,ercal n.in vivo inhibition of i-buthionine-(s,r)-sulfoximine-induced cataracts by a novel antioxidant,n-acetylcysteine amide.free radical biol med.2011；15；50(6):722-9.doi:10.1016/j.free rad biol med.2010.12.017)。
19.据称，专利公开文献wo2013/163545a1教导了使用治疗有效量的naca治疗白内障的方法。然而，wo2013/163545a1没有描述naca用于预防或延迟白内障形成的用途。此外，wo2013/163545a1没有描述使用dinaca作为前药将naca递送至眼睛用于治疗或预防白内障的用途。
20.专利公开文献us20200281944a1、pct/ib2018/058979和ca3078680涉及用羊毛甾醇或25-羟基胆甾醇酯化的nac用于治疗晶状体障碍的用途，以及羊毛甾醇或25-羟基胆甾醇衍生物与nac或naca组合使用用于治疗晶状体障碍。然而，它们没有教导单独的nac或单独的naca用于预防或治疗白内障的用途，或dinaca作为前药将naca或nac递送至眼睛以预防或治疗白内障或任何其他适应症的用途。
21.老花眼。据称，专利公开文献us20200281944a1、pct/ib2018/058979和ca3078680教导了用羊毛甾醇或25-羟基胆甾醇酯化的nac用于治疗晶状体障碍的用途，羊毛甾醇或25-羟基胆甾醇衍生物与nac或naca组合使用用于治疗晶状体障碍。然而，它们没有教导单独的nac或单独的naca用于预防或治疗老花眼的用途，或dinaca作为前药将naca或nac递送至眼睛以预防或治疗老花眼或任何其他适应症的用途。
22.皮肤色素沉着过度或皮肤年轻化。黑色素是由黑素细胞分泌的皮肤色素沉着的主要成分，其保护皮肤免受有害的紫外线(uv)辐射，然而，黑色素色素在太阳损害的皮肤中的累积导致各种色素沉着过度障碍。抗氧化剂naca(“npi-001”)和dinaca(“npi-002”)抑制人黑素细胞中的黑色素产生并增加暴露于uv辐射的健康人皮肤外植体中的谷胱甘肽和nac。总之，这些发现支持了反应性氧物质参与重建的人上皮培养物中的黑素生成以及皮肤暴露于uv辐射的理论。谷胱甘肽(gsh)通过抑制酪氨酸酶的活性来抑制黑素生成，并且人口服gsh减少皮肤中的黑色素生成。实际上，采用naca和dinaca观察到酪氨酸酶活性以剂量响应方式的显著抑制。基于这些结果，naca和dinaca具有作为抗氧化剂的治疗效用，即用于皮肤的潜在治疗剂(neil j；wall gm；brown m.antioxidant effects of n-acetylcysteine amide and npi-002on human skin or equivalents.aaps pharmsci360,poster abstract,october 26-november 5,2020)。
23.脑震荡。据称，第8,993,627b2号美国专利教导了通过各种途径以各种形式和浓度递送的naca用于预防或治疗脑震荡的用途。然而，它没有使用或教导作为naca或nac的前药以任何形式或途径给予的dinaca用于预防或治疗脑震荡。
24.电离辐射。第8937099b2号美国专利保护通过各种途径以各种形式和浓度递送的naca用于预防或治疗暴露于电离辐射的用途。然而，它没有教导以任何形式或途径给予的dinaca作为naca或nac的前药用于预防或治疗暴露于电离辐射的用途。
25.高能冲击导致的创伤性脑损伤或脊髓损伤。据称，第8,354,449b2号美国专利教导了用于治疗由暴露于高能脉冲冲击导致的创伤性脑损伤或脊髓损伤的通过各种途径以各种形式和浓度递送的naca。然而，它没有教导以任何形式或途径给予的作为naca或nac的前药的dinaca用于治疗由暴露于高能脉冲冲击引起的创伤性脑损伤或脊髓损伤的用途。
26.黄斑变性。第15/943236号美国专利申请要求保护通过眼科途径以各种形式和浓度递送的naca用于治疗黄斑变性的用途。然而，它没有教导以任何形式或途径给予的dinaca作为naca或nac的前药用于治疗黄斑变性的用途。
27.用于眼科的其他抗氧化剂。用于老花眼的硫辛酸胆碱酯。老花眼是几种眼部变化的结果。晶状体随时间扩大，睫状体经历萎缩性变化，玻璃体变得较不粘，并且晶状体丧失其柔性。在我们的天然晶状体中被称为晶体蛋白的蛋白质随着年龄开始交联，导致晶状体的可塑性的丧失。最初，这表现为适应的丧失，从而降低了聚焦于近处物体的能力，最终是混浊或白内障。因此，老花眼和白内障被认为是随着我们变老，天然晶状体中进行的连续抗氧化过程。该过程可通过治疗剂(例如局部皮质类固醇滴眼剂)、手术(例如玻璃体切除术)或其他原因加速。抗氧化剂已经在老花眼和白内障的治疗中显示出一些功效。
28.最近的研究已经证明局部眼部抗氧化剂疗法可以治疗老花眼。ev06眼用溶液(硫辛酸胆碱酯，lace)1.5％滴眼液(encore vision)，其由novartis命名为unr844，是用于将硫辛酸递送至晶状体的前药(https://www.eyeworld.org/has-presbyopia-found-encore)。lace穿透角膜并代谢成胆碱和硫辛酸，两种天然存在的物质。晶状体纤维细胞内的酶将硫辛酸在化学上还原为活性形式的二氢硫辛酸(dhla)。据称dhla还原晶状体蛋白之间的二硫键，并通过增加晶状体的变形性和增加适应幅度来恢复晶状体微流体。
29.驱动lace开发的假设解决了晶状体柔性或其在老花眼中的缺失。随着晶状体蛋白随时间氧化，形成二硫键，使得它们在适应活动中更不能彼此相对移动。假设是局部应用抗
氧化剂lace可以破坏交联的二硫键，蛋白质将重获提高的柔性并实现晶状体更大范围的变形，从而转化成更大的适应动态范围。lace促进了dhla到晶状体的眼部递送。一旦在晶状体内，dhla据称还原了晶状体蛋白之间的二硫键并恢复了晶状体微流体。首先在体外用人尸体晶状体和在体内在兔眼中证实了概念证明，由此药物造成晶状体软化和晶状体变形性增加(https://www.eyeworld.org/has-presbyopia-found-encore)。
30.lace在老花眼中的小型首次人体临床试验显示，即使在停止给药方案后，该药物也是相对安全、稳健的和持久的，表明与安慰剂相比统计学上显著的近视敏度(距离矫正近视力(dcnva))改善。
31.临床研究是一项前瞻性、随机、双盲、安慰剂作对照的研究，包括来自四个美国场所的75名患有远视、近视或正视和诊断为老花眼的患者(45-55岁)。患者按2：1随机分配(ev06＝50：安慰剂＝25)。给予试验产品91天，并在7个月随访期期间监测患者。在基线处，研究患者的每只眼睛的dcnva低于20/40，每只眼睛的最佳矫正远视力(bcdva)为20/20或更好，显然屈光等效球镜度与睫状肌麻痹性屈光等效球镜度之差为≤0.50d。当受试者采用双侧视力时，视敏度改善是最显著的，84％达到20/40双侧视力或更好，而安慰剂组为52％。53％的研究参与者实现了双侧视力约0.2logmar的变化，而采用安慰剂实现了22％。无受试者中断，且无威胁视觉的不良事件或眼内压的变化。药物在设置时是舒适的，并且未引起最佳矫正远视力、显然屈光等效球度、睫状肌麻痹性屈光的变化或瞳孔直径的变化。在第91天停止ev06给药后，药物对近视力改善的作用在研究组中持续很长时间。在研究期结束后241天，报告了与安慰剂相比的显著效果，仅有少量的治疗退化。在3个月研究时间结束后七个月，与采用安慰剂的仅6％相比，39％经治疗的受试者的双侧近视力保持≥0.2logmar变化(www.eyeworld.org/has-presbyopia-found-encore)。
32.用于白内障的n-乙酰肌肽。研究已经证明局部眼部抗氧化剂疗法可以预防和/或治疗白内障。已经报道了自由基诱导的脂质氧化(lpo)作为白内障发展的机制(babizhayev ma,deyev ai,yermakova vn,remenshchikov vv,bours j.revival of the lens transparency with n-acetylcarnosine.current drug therapy,2006:1；91-116.)。白内障的初始阶段的特征在于初级(二烯共轭物，十六碳二烯(cetodiene))lpo产物的积累，而在后期阶段，普遍存在lpo荧光终产物。通过气相色谱分析显示晶状体脂质的脂肪酰基含量增加，产生脂肪酸氟取代的衍生物。晶状体不透明程度与晶状体中lpo荧光终产物积聚的水平相关，lpo荧光终产物积聚伴随着由于晶状体中还原型谷胱甘肽(gsh)浓度降低而引起的晶状体蛋白的硫醇(-sh)基团氧化。将lpo产品注射到玻璃体液中显示诱导白内障。晶状体纤维膜的过氧化物损伤可能是白内障形成的初始原因。babizhayev等人(2006)开发了适合非手术预防和治疗年龄相关的白内障的含n-乙酰肌肽的滴眼剂。n-乙酰肌肽滴眼液保护晶状体免受氧化应激诱导的损伤，并且在临床试验中产生了视力的长期改善。当局部给予眼睛时，n-乙酰肌肽滴眼剂将l-肌肽递送至房水。在患有白内障的患者和患有年龄相关的白内障的犬科动物中检查了n-乙酰肌肽滴眼液对晶状体混浊的影响。证明了对晶状体透明度和不透明区域的澄清改性的积极作用。这些结果表明通过局部抗氧化剂n-乙酰肌肽滴眼剂治疗(逆转和预防)年龄相关的白内障的积极效果(wo2004/028536a1)。
33.神经源性疾病(neuorogenerative diseases)和药物滥用。帕金森病(pd)。研究已经证明naca穿透脑并在总体上保护神经元，特别是在组织培养中针对各种产生氧化应激的
神经毒素保护多巴胺能细胞。在三种pd实验模型中，用naca处理显著降低了多巴胺能神经元的损伤。naca抑制了具有单侧6-ohda诱导的黑质病变的大鼠的苯丙胺诱导的旋转行为。它减弱了用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶处理的小鼠的纹状体多巴胺水平的降低。它还减少了大鼠慢性颈静脉内给予鱼藤酮后的多巴胺能神经元损失。因此，naca可有效减缓pd患者的黑质神经元变性和疾病进展(bahat-stroomza m,gilgun-sherki y,offen d,panet h,saada a,krool-galron n,barzilai a,atlas d,melamed e.a novel thiol antioxidant that crosses the blood brain barrier protects dopaminergic neurons in experimental models of parkinson’s disease.european journal of neuroscience,2005；21:637
–
646)。
34.hiv相关的痴呆和甲基苯丙胺。研究表明，在滥用甲基苯丙胺(meth)的患者中观察到hiv-1相关的痴呆(had)的风险增加。由于hiv病毒蛋白(gp120，tat)和meth都诱导氧化应激，因此滥用药物的患者具有更大的氧化应激诱导的损伤的风险。用naca/盐水预处理的cd-1小鼠接受gp120、tat、gp120+tat或盐水注射5天，随后在第五天注射三次meth/盐水，并在最终注射后24小时处死。测量各种氧化应激参数，发现用gp120+tat+meth处理的动物是受攻击最大的组，如它们的gsh和mda水平所示。用naca治疗明显拯救动物免于氧化应激。此外，与单独用gp120+tat+meth处理的组相比，naca处理的动物具有显著更高的tj蛋白表达和bbb渗透性，表明naca可以在gp120、tat和meth暴露的动物中保护bbb免受氧化应激诱导的损伤，并且因此可以是用于患有had的患者的可行的治疗选择(banerjee a,zhang x,manda kr,banks wa,ercal n.hiv proteins(gp120 and tat)and methamphetamine in oxidative stress-induced damage in the brain:potential role of the thiol antioxidant n-acetylcysteine amide.free radic biol med.2010may 15；48(10):1388
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1398.doi:10.1016/j.freeradbiomed.2010.02.023.)
35.可卡因滥用。研究表明naca阻断了嗅球切除的大鼠的毒瘾再犯(cocaine-seeking behavior)(j,frankowska m,filip m,atlas d.n-acetylcysteine amide(ad4)reduces cocaine-induced reinstatement.psychopharmacology 2016；33:3437
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3448doi 10.1007/s00213-016-4388-5.)。
36.酒精滥用。慢性酒精摄入导致神经炎症和细胞损伤，倾向于导致持续酒精摄入的改变和提示复发。研究显示脑氧化应激始终与酒精诱导的神经炎症相关，文献暗示氧化应激和神经炎症彼此持续。对嗜酒大鼠进行的一项研究表明，口服低剂量的抗氧化剂nac(40mg/kg/d)或抗炎阿司匹林(15mg)将慢性乙醇摄入量抑制了50％至55％，而两种药物的共同给予导致慢性酒精摄入量的70％至75％的抑制(p《.001)。在慢性酒精摄入、长期酒精剥夺和随后的酒精再获得后，重新饮酒导致60分钟内血液酒精水平为95至100mg/dl，这被nac或阿司匹林降低了60％，并且被两种药物的共同给予降低了85％(血液酒精：10至15mg/dl；*p《.001)。阿司匹林和nac共同给予显著抑制了慢性酒精摄入和阻断了酗酒复发(israel y,quintanilla me,ezquer f,morales p,santapau d,berr
í
os-c
á
rcamo p,ezquer m,olivares b,herrera-marschitz m.aspirin and n-acetylcysteine co-administration markedly inhibit chronic ethanol intake and block relapse binge drinking:role of neuroinflammation-oxidative stress self-perpetuation.addiction biology.2019；e12853.https://doi.org/10.1111/adb.12853)
37.血液障碍。一项研究显示，用naca对β-地中海贫血患者的血细胞进行体外处理升高了红细胞(rbc)、血小板和多形核(pmn)白细胞的降低的gsh含量，并降低了它们的反应性氧物质(ros)。这些作用导致地中海贫血rbc对溶血和巨噬细胞的吞噬作用的敏感性显著降低。向β-地中海贫血小鼠腹膜内注射naca(150mg/kg)显著降低了氧化应激的参数。naca在体外和体内降低地中海贫血细胞中的氧化应激标记物方面显示优于nac(amer j,atlas d,fibach e.n-acetylcysteine amide(ad4)attenuates oxidative stress in beta-thalassemia blood cells.biochimica et biophysica acta 1780(2008)249-255.)。
38.发明概述
39.根据一个实施方案，本发明提供使用dinaca作为naca和nac的前药的方法，naca和nac通过前药dinaca的代谢在体内产生。根据一个实施方案，本发明提供使用naca作为nac的前药的方法，nac通过前药naca的代谢在体内产生。nac也可以由前药dinaca通过代谢成naca，然后是nac而生成。因此，发现naca和dinaca均可作为前药在体内产生nac，因此在预防或治疗任何涉及氧化应激的疾病或障碍，包括但不限于：向哺乳动物给予治疗有效量的dinaca、naca、nac或其组合，以预防或治疗受试者的一种或多种氧化应激疾病或障碍中有效，所述氧化应激疾病或障碍选自aids、抗蛇毒素、β-地中海贫血、白内障、未患有糖尿病受试者的白内障、慢性阻塞性肺病、角膜内皮细胞损失、糖尿病和糖尿病诱导的溃疡、黄斑变性、造影剂诱导的肾病、哮喘、肺挫伤、黄斑变性、甲基苯丙胺诱导的氧化应激、多发性硬化、帕金森病、血小板凋亡、老花眼、迟发性运动障碍、阿尔茨海默病、hiv、hiv-1相关的痴呆、线粒体疾病、心肌肌病、神经退行性疾病、肺纤维化、色素性视网膜炎、usher综合征、stargardt综合征、年龄相关的黄斑变性、皮肤色素沉着、需要恢复活力的皮肤、呼吸系统中的粘液积聚或增厚、精子发生低下和男性不育症、β-地中海贫血、抗微生物感染、hiv相关的痴呆、甲基苯丙胺滥用、可卡因滥用、酒精滥用、皮肤色素沉着过度或弗里德赖希共济失调。根据一个实施方案，本发明提供了使用抗氧化剂n-乙酰半胱氨酸酰胺(naca)或(2r,2r’)-3,3
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二硫烷二基双(2-乙酰胺基丙酰胺)(dinaca)预防或治疗老花眼的方法。此外，根据一个实施方案，本发明提供了使用抗氧化剂n-乙酰半胱氨酸酰胺(naca)预防白内障和使用(2r,2r’)-3,3
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二硫烷二基双(2-乙酰胺基丙酰胺)(dinaca)预防或治疗白内障的方法。另一方面，患有白内障患者不患有糖尿病。
40.在一个非限制性实例中，预防或减少动物或人的与以下相关的氧化应激：aids、抗蛇毒素、β-地中海贫血、白内障、慢性阻塞性肺病、角膜内皮细胞损失、糖尿病和糖尿病诱导的溃疡、黄斑变性、造影剂诱导的肾病、哮喘、肺挫伤、甲基苯丙胺诱导的氧化应激、多发性硬化、帕金森病、血小板凋亡、老花眼、迟发性运动障碍、阿尔茨海默病、hiv、hiv-1相关的痴呆、线粒体疾病、心肌肌病、神经退行性疾病、肺纤维化、色素性视网膜炎、usher综合征、stargardt综合征、年龄相关的黄斑变性、皮肤色素沉着、需要恢复活力的皮肤、抗微生物感染和/或弗里德赖希共济失调，其包括向动物或人给予治疗有效量的naca或dinaca。一方面，naca或dinaca在药学上可接受的载体中或与药学上可接受的载体一起提供。另一方面，naca或dinaca经眼内、视网膜下、玻璃体内、口服、静脉内、肌内、局部、舌下、直肠，或通过注射、鼻喷雾或吸入给予。另一方面，以约0.5至150mg/kg的每日剂量给予naca或dinaca。另一方面，naca或dinaca每天给予两次或三次。另一方面，naca或dinaca与第二活性剂一起给予，所述第二活性剂选自抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、
抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(bha)、丁基化羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚、柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸或磷酸中的至少一种。另一方面，用于给予的剂量为每剂100、150、150、300、333、400、500、600、700、750、800、900、1000、2500、5000、7500或10000mg。另一方面，用于给予的剂量为每剂0.001-0.01、0.01-0.1、0.1-0.25、0.1-0.4、0.35-0.5、0.5-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-2.5、2.5-3.5、4-6、5-8、6-9、7-10克。另一方面，naca或dinaca经由小片、胶囊、片剂、泡腾剂、双重释放剂、混合释放剂、小药囊、粉剂或液体口服递送。另一方面，预防性给予naca或dinaca以预防或减少与以下相关的氧化应激：aids、抗蛇毒素、β-地中海贫血、白内障、慢性阻塞性肺病、角膜内皮细胞损失、糖尿病和糖尿病诱导的溃疡、黄斑变性、造影剂诱导的肾病、哮喘、肺挫伤、甲基苯丙胺诱导的氧化应激、多发性硬化、帕金森病、血小板凋亡、老花眼、迟发性运动障碍、阿尔茨海默病、hiv、hiv-1相关的痴呆、线粒体疾病、心肌肌病、神经退行性疾病、肺纤维化、色素性视网膜炎、usher综合征、stargardt综合征、年龄相关的黄斑变性、皮肤色素沉着、需要恢复活力的皮肤、抗微生物感染和/或弗里德赖希共济失调。另一方面，动物是人。另一方面，患有白内障的患者不患有糖尿病。
41.根据另一个实施方案，本发明包括治疗氧化应激的方法，所述氧化应激与以下相关：aids、抗蛇毒素、β-地中海贫血、白内障、慢性阻塞性肺病、角膜内皮细胞损失、糖尿病和糖尿病诱导的溃疡、黄斑变性、造影剂诱导的肾病、哮喘、肺挫伤、甲基苯丙胺诱导的氧化应激、多发性硬化、帕金森病、血小板凋亡、老花眼、迟发性运动障碍、阿尔茨海默病、hiv、hiv-1相关的痴呆、线粒体疾病、心肌肌病、神经退行性疾病、肺纤维化、色素性视网膜炎、usher综合征、stargardt综合征、年龄相关的黄斑变性、皮肤色素沉着、需要恢复活力的皮肤、抗微生物感染和/或弗里德赖希共济失调：识别需要治疗与以下相关的氧化应激的人：aids、抗蛇毒素、β-地中海贫血、白内障、慢性阻塞性肺病、角膜内皮细胞损失、糖尿病和糖尿病诱导的溃疡、黄斑变性、造影剂诱导的肾病、哮喘、肺挫伤、甲基苯丙胺诱导的氧化应激、多发性硬化、帕金森病、血小板凋亡、老花眼、迟发性运动障碍、阿尔茨海默病、hiv、hiv-1相关的痴呆、线粒体疾病、心肌肌病、神经退行性疾病、肺纤维化、色素性视网膜炎、usher综合征、stargardt综合征、年龄相关的黄斑变性、皮肤色素沉着、需要恢复活力的皮肤、抗微生物感染和/或弗里德赖希共济失调；以及向人给予治疗有效量的n-乙酰半胱氨酸酰胺(naca)或(2r,2r’)-3,3
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二硫烷二基双(2-乙酰胺基丙酰胺)(dinaca)，其足以治疗与以下相关的氧化应激：aids、抗蛇毒素、β-地中海贫血、白内障、慢性阻塞性肺病、角膜内皮细胞损失、糖尿病和糖尿病诱导的溃疡、黄斑变性、造影剂诱导的肾病、哮喘、肺挫伤、甲基苯丙胺诱导的氧化应激、多发性硬化、帕金森病、血小板凋亡、老花眼、迟发性运动障碍、阿尔茨海默病、hiv、hiv-1相关的痴呆、线粒体疾病、心肌肌病、神经退行性疾病、肺纤维化、色素性视网膜炎、usher综合征、stargardt综合征、年龄相关的黄斑变性、皮肤色素沉着、需要恢复活力的皮肤、抗微生物感染和/或弗里德赖希共济失调。在一个非限制性实例中，预防或减少角膜内皮细胞损失是在白内障手术后的患者中。一方面，naca或dinaca在药学上可接受的载体中或与药学上可接受的载体一起提供。另一方面，naca经眼内、视网膜下、玻璃体内、口服、静脉内、肌内、局部、舌下或直肠给予。另一方面，以约0.005至150mg/kg的每日剂量给予naca或dinaca。另一方面，naca或dinaca每天给予两次或三次。另一方面，naca或dinaca与第二活性剂一起给予，所述第二活性剂选自抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢
钠、亚硫酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(bha)、丁基化羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚、柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸或磷酸中的至少一种。另一方面，用于给予的剂量为每剂0.01、0.1、1、10、100、150、150、300、333、400、500、600、700、750、800、900、1000、2500、5000、7500或10000mg。另一方面，用于给予的剂量为每剂0.01-0.1、0.1-0.25、0.1-0.4、0.35-0.5、0.5-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-2.5、2.5-3.5、4-6、5-8、6-9、7-10克。另一方面，naca或dinaca经由小片、胶囊、片剂、泡腾剂、双重释放剂、混合释放剂、小药囊、粉剂、液体、眼插入物、注射剂或植入物口服递送。另一方面，预防性给予naca或dinaca以预防或减少与角膜内皮细胞损失相关的氧化应激。另一方面，患有白内障的患者不患有糖尿病。
42.附图简述
43.为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在参考本发明的详细描述以及附图，其中：
44.图1显示基于与对照(“白内障模型”)的比较，naca和dinaca抑制分离的大鼠晶状体中白内障(混浊)的氧化形成。
45.图2显示nac、naca和dinaca可剂量依赖性地预防分离的猪晶状体中h2o2诱导的白内障。naca和dinaca表现出比nac更大的功效。
46.图3是显示nac、naca和dinaca预处理24小时，随后tbhp处理和孵育4小时的效果的图。
47.图4是显示nac、naca和dinaca预处理48小时，随后tbhp处理和孵育4小时的效果的图(与仅tbhp相比，***p《0.0001(保护)；与仅tbhp相比，#p《0.05；与仅tbhp相比，###p《0.001)。
48.图5显示在大鼠中口服给予后dinaca是生物可利用的，并且口服给予dinaca在大鼠血浆中产生显著水平的dinaca、naca和nac。
49.图6显示在植入dinaca玻璃体内植入物后7天的dinaca、naca和nac水平。
50.图7显示ivt给予后作为前药dinaca的代谢物的naca和nac的产生。
51.发明详细说明
52.虽然下面详细讨论了本发明的各个实施方案的形成和使用，但是应当理解，本发明提供可以在很多具体上下文中体现的许多可应用的发明构思。本文所讨论的具体实施方案仅仅是对形成和使用本发明的具体方式的说明，并不限制本发明的范围。
53.为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本文定义的术语具有本发明相关领域中的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”的术语并不旨在仅指单数实体，而是包括可用具体实例进行说明的大类。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但它们的使用不限制本发明，除非如权利要求中所概述的。
54.本发明总体上涉及(2r,2r')-3,3'-二硫烷二基双(2-乙酰胺基丙酰胺)(dinaca)作为naca和nac的前药用于预防和/或治疗涉及氧化应激的各种疾病和/或障碍的用途。本发明还总体上涉及naca作为nac的前药用于预防和/或治疗各种涉及氧化应激的疾病和/或障碍的用途。涉及氧化应激的疾病或障碍包括但不限于aids、酒精或药物滥用、抗蛇毒素、β-地中海贫血、癌症、白内障、慢性阻塞性肺病、角膜内皮细胞损失、covid-19、胱氨酸病、糖尿病和糖尿病诱导的溃疡、黄斑变性、造影剂诱导的肾病、哮喘、肺挫伤、甲基苯丙胺诱导的
ey,penugonda s,karacal h,ercal n.in vivo inhibition of l-buthionine-(s,r)-sulfoximine-induced cataracts by a novel antioxidant,n-acetylcysteine amide.free radical biol med.2011；15；50(6):722-9.doi:10.1016/j.free rad biol med.2010.12.017.)。
62.(2r,2r’)-3,3
’‑
二硫烷二基双(2-乙酰胺基丙酰胺)(dinaca，npi-002)，具有以下化学结构：
[0063][0064]
(2r,2r’)-3,3
’‑
二硫烷二基双(2-乙酰胺基丙酰胺)(dinaca)，即n-乙酰半胱氨酸酰胺的二聚体形式，是naca的合成前体(au2018365900b2)。dinaca是naca和nac的前药，naca和nac是dinaca的代谢物。因此，可以用nac或naca治疗的与氧化应激相关的任何疾病或障碍很可能适于用dinaca治疗，包括但不限于aids、抗蛇毒素、β-地中海贫血、白内障、慢性阻塞性肺病、角膜内皮细胞损失、糖尿病和糖尿病诱导的溃疡、黄斑变性、造影剂诱导的肾病、哮喘、肺挫伤、甲基苯丙胺诱导的氧化应激、多发性硬化、帕金森病、血小板凋亡、老花眼、迟发性运动障碍、阿尔茨海默病、hiv、hiv-1相关的痴呆、线粒体疾病、心肌肌病、神经退行性疾病、肺纤维化、色素性视网膜炎、usher综合征、stargardt综合征、年龄相关的黄斑变性、皮肤色素沉着、需要恢复活力的皮肤、抗微生物感染和/或弗里德赖希共济失调。在另一个实例中，患有白内障的患者不患有糖尿病。
[0065]
本发明可用于药物组合物，所述药物组合物用于治疗人疾病和障碍，如上述那些。通常，这样的组合物还包含药学上可接受的(即惰性的)载体，如已知的和可接受的药学实践所要求的，参见例如remington’s pharmaceutical sciences,16th ed,(1980),mack publishing co。这样的载体的实例包括无菌载体，诸如盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲的盐水、水性或非水性溶液、具有诸如三水乙酸钠的合适的缓冲剂至诸如5至8范围内的ph的药学上可接受的ph的缓冲溶液。用于注射(例如，通过口服、静脉内、腹膜内、皮内、皮下、肌内、门静脉内，或通过局部或眼周应用到眼睛或玻璃体内注射到眼睛中而局部递送到眼睛)或连续输注的药物组合物适宜不含可见的颗粒物质并且可以单独地或以如本文教导的组合包含dinaca、nac、naca。此外，用于治疗人疾病和障碍，诸如上文概述的那些的药物组合物还可包含生物溶蚀性或非生物溶蚀性聚合载体(vehicle)，诸如插入物或植入物，当置于组织附近或组织中时前药从其洗脱。
[0066]
谷胱甘肽(gsh)是在所有哺乳动物组织中存在的三肽，c-l-谷氨酰基-l-半胱氨酰基-甘氨酸。它具有几种重要的功能，包括对亲电体的解毒、清除ros、维持蛋白质的硫醇状态和维生素c和e的还原形式的再生。gsh是哺乳动物细胞中的主要非蛋白硫醇；因此，其在维持细胞内氧化还原平衡和蛋白质的必要硫醇状态中是必要的。而且，其对于一些抗氧化酶诸如谷胱甘肽过氧化物酶的功能是必需的。
[0067]
用于抑制分离的大鼠晶状体的氧化的方案。将三周龄wistar大鼠眼睛去核，并在
dulbecco's改良eagle培养基(低葡萄糖)(dmem-f12)中显微解剖晶状体。仅使用定制的玻璃环处理晶状体以避免透明度的变化，并将其置于含有1％青霉素/链霉素/新霉素的1ml dmem中。将晶状体置于设定为37℃/5％co2的培养箱中一小时。然后在暗视野和明视野(网格)下对晶状体进行成像，以确保在添加溶媒(h2o)、10mm naca(溶液)或10mm dinaca(悬浮液)之前它们仍然是透明的。然后将晶状体在6小时的时间段成像以确保保持透明，然后再孵育18小时，然后再次成像(总共孵育24小时)。收集培养基并向孔中加入新鲜培养基。加入0.5mm h2o2(在37℃下温热)，并放置再孵育24小时。对晶状体成像，收集培养基，将晶状体称重并在配衡小瓶中快速冷冻并提交用于进一步分析。
[0068]
图1显示基于与对照(“白内障模型”)的比较，naca和dinaca抑制分离的大鼠晶状体中白内障(混浊)的氧化形成。
[0069]
抑制分离的猪晶状体的氧化的方案。猪的新鲜眼睛来自sierra for medical science。首先将晶状体在12孔板中的培养基199(sigma-aldrich，st.louis，mo，美国)和1％猪血清中孵育两小时。在孵育结束时，将晶状体在暗视野显微镜下成像，并且仅将清晰、透明的晶状体用于进一步的实验。然后将晶状体与nac、naca或dinaca一起预孵育24小时。预处理后，将晶状体转移到含有600μm h2o2的培养基中，所述培养基补充有葡萄糖氧化酶(go)以在进一步孵育6小时期间维持恒定的h2o2水平[wang gm,raghavachari n,lou mf.relationship of protein-glutathione mixed disulfide and thioltransferase in h2o2-induced cataract in cultured pig lens.exp eye res.1997may；64(5):693-700.doi:10.1006/exer.1996.0251.pmid:9245898.]。在6小时孵育结束时，在暗视野显微镜下对晶状体成像。
[0070]
图2显示nac、naca和dinaca剂量依赖性地抑制分离的猪晶状体中h2o2诱导的白内障。naca和dinaca表现出比nac更大的功效。
[0071]
角膜内皮细胞保护方案。采用四唑盐wst-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2h-四唑，单钠盐)通过比色细胞活力试剂盒(cayman，ann arbor，michigan)测量细胞活力，所述四唑盐通过活细胞中存在的脱氢酶被生物还原成水溶性橙色甲臜染料。产生的甲臜的量与活细胞的数量成正比。在96孔测定中，以6000个细胞/孔(100μl总体积/孔)的密度接种细胞。将细胞(n＝8)与或不与不同浓度的nac、naca和dinaca(2、20和40mm)一起孵育48小时，然后用500μm叔丁基过氧化氢(tbhp)再处理4小时。处理后，将10μl的wst-8溶液加入到培养板的每个孔中并在培养箱中孵育4小时。使用酶标仪(biotek，winooski，vt)在450nm下评价吸收。
[0072]
图3是显示nac、naca和dinaca预处理24小时，随后tbhp处理和孵育4小时的效果的图。图4是显示nac、naca和dinaca预处理48小时，随后tbhp处理和孵育4小时的效果的图(与仅tbhp相比，***p《0.0001(保护)；与仅tbhp相比，#p《0.05；与仅tbhp相比，###p《0.001)。图4与图3中的细胞活力测定结果的比较显示，用抗氧化剂预处理越久，细胞针对氧化的保护越大。
[0073]
细胞内gsh水平由产生和损失之间的平衡决定。由从头合成和通过gssg还原酶由gssg再生gsh导致产生。通常，在gssg还原酶系统中有足够的将所有细胞内gsh维持在还原状态的能力，因此通过提升该途径几乎不可能有收获。细胞内gsh损失的主要来源是转运出细胞。细胞内gsh水平范围为1-8mm，而细胞外水平仅为几μm；这种大的浓度梯度基本上阻止
gsh转运到细胞中，并且一旦它被转运出细胞，它就被γ-谷氨酰转肽酶快速降解。gsh转运蛋白的抑制理论上可升高细胞内gsh水平，但可能存在问题，因为转运蛋白不是特异性针对gsh的，并且其抑制可导致其他氨基酸和肽的不平衡。因此，细胞内gsh水平主要受合成变化的调节。
[0074]
在几乎所有细胞的细胞溶质中通过两个需要atp的酶促步骤合成gsh：l-谷氨酸+l-半胱氨酸+atp[
→
]γ-谷氨酰基-l-半胱氨酸+adp+25pi和γ-谷氨酰基-l-半胱氨酸+l-甘氨酸+atp[
→
]gsh+adp+pi。第一个反应是限速的并且由谷氨酸半胱氨酸连接酶(gcl，ec6.3.2.2)催化。gcl由73kd重催化亚基(gclc)和30kd修饰亚基(gclm)组成，它们由不同基因编码。通过对gsh的非变构竞争性抑制(ki＝2.3mm)和通过l-半胱氨酸的可用性来调节gccl。glc对谷氨酸的表观km为1.8mm，胞内谷氨酸浓度约高出10倍，因此谷氨酸不是限制性的，但对半胱氨酸的km为0.1-0.3mm，这接近其胞内浓度。第二个反应由gsh合酶(gs，ec6.3.2.3)催化，其为118kd并且由两个相同的亚基组成。虽然在正常条件下gs不被认为在gsh合成的调节中是重要的，但它可能在应激条件下发挥作用，因为响应于手术创伤，gsh水平和gs活性降低，而gcl活性不变。此外，与单独增加的gclc的表达相比，增加gclc和gs两者的表达导致更高水平的gsh。为了使增加合成酶的作用最大化，必须提供升高水平的半胱氨酸。在培养的神经元中，90％的半胱氨酸摄取通过钠依赖性兴奋性氨基酸转运蛋白(eaat)系统发生。存在五种eaat，神经元对半胱氨酸的摄取主要通过eaat3发生，eaat3更通常被称为兴奋性氨基酸载体-1(eaac1)。在正常情况下，大多数eaac1在er中并且仅在被活化时易位至质膜。这种易位通过谷氨酸转运蛋白相关蛋白3-18(gtrap3-18)负调节，并且抑制gtrap3-18提高了神经元中的gsh水平。因此，半胱氨酸的内化给gsh合成提供了路障，但幸运的是它可以被n-乙酰半胱氨酸(nac)绕过，n-乙酰半胱氨酸甚至在不存在活化的eaac1情况下也容易进入细胞。全身性给予的nac能够进入cns，提高gsh水平，并在其中氧化应激是发病机理的重要部分的神经退行性障碍中提供益处。
[0075]
必须保护所有细胞区室免受氧化损伤，包括细胞质、线粒体和细胞核。本发明人先前已经进行了解毒反应性氧物质的酶的基因转移，但是该方法需要在细胞质中表达两种酶和在线粒体中表达两种酶。相反，由于gsh在整个细胞中扩散，本发明采用在细胞溶质胶仅表达两种酶来提供对所有细胞区室的保护。
[0076]
nac用于治疗对乙酰氨基酚过量，以140mg/kg的剂量作为负荷剂量，接着每4小时70mg/kg，17剂，从负荷剂量后4小时开始。在临床研究中，nac已经每天一次口服给予400至1000mg，每天三次口服给予200至600mg。然而，人口服600mg剂量后，nac被快速吸收，然后被快速清除。已报道nac的血浆半衰期为2.5小时，且在给予后10-12小时检测不到nac。在吸收过程中，nac快速代谢为半胱氨酸，它是谷胱甘肽的直接前体。根据一个实施方案，本发明提供了预防、改善或治疗受试者的与氧化应激相关的疾病或障碍的方法，其包括给予治疗有效量的naca或dinaca以增加nac的量，因此增加受试者的组织中表达的谷胱甘肽的量。
[0077]
dinaca作为naca和nac的前药。实施例1：大鼠的口服给药研究。iacuc(机构动物管理和使用委员会，institutional animal care and use committee)-批准的研究评价了在雄性sprague-dawley大鼠中经由口服灌胃给药的dinaca。将dinaca称重，放到单个管中。将管加盖并在室温下储存过夜。将大鼠称重。将适当量的磷酸盐缓冲的ph7.0盐水加到每个管中以获得作为悬浮液的所需的dinaca浓度。在指定的时间点从尾静脉收集血液样本并处
理以产生血浆。使用经过验证的液相色谱质谱方法分析血浆样本(king b；vance j；wall gm；shoup r.quantitation of free and total n-acetylcysteine amide and its metabolite n-acetylcysteine in human plasma using derivatization and electrospray lc-ms/ms.j chrom b2019；1109:25-36.)。图5显示了大鼠以每千克200毫克经口服灌胃dinaca后，大鼠血浆中达到的dinaca、naca和nac水平。该研究证明dinaca用作naca和nac的前药。
[0078]
实施例2：兔的局部眼部研究。iacuc批准的研究评价了在兔中的dinaca或naca局部眼部给药。开发了含有1％dinaca或1％naca的眼用制剂，其用于对荷兰带兔(dutch belted rabbit)重复局部眼部滴注。在第1-6天的约上午8:00、上午11:00、下午2:00和下午4:00对动物一天给药4次，并在第7天的约上午8:00给药1次，通过双侧局部给予。通过对结膜水肿、分泌物和充血进行评分(draize评分)，评估在基线处和首次每日给药之前的眼耐受性。在尸检时(第7天)收获眼组织。开发了合格的分析型lc-ms方法并用于定量房水(ah)中的naca水平。局部眼部给药后未观察到严重不良结果。表i显示在给药1％dinaca或1％之后在房水中达到的naca水平。ah中dinaca的存在表明在局部眼部给药后dinaca穿透眼睛。ah中naca的存在表明dinaca用作前药以将naca递送至ah。
[0079]
表i在兔中1％dinaca或1％naca的局部给药后房水中获得的naca水平(blq：低于定量限)。
[0080][0081]
实施例3：兔的玻璃体内给药研究。iacuc批准的研究评价了在兔中玻璃体内(ivt)给药的dinaca。制备含有dinaca的标准无菌玻璃体内植入物。以0.8mg/眼的剂量ivt给予雌性新西兰白兔di-naca植入物。一组动物接受没有任何测试物品的ivt安慰剂植入物。在基线处和给药后第8和23天进行临床眼科检查。每天进行总体健康观察。在基线处和处死前记录体重。在第8、15或23天对动物实施安乐死，收集组织并提交用于生物分析。ivt di-naca递送与给药当天的最小眼部发现相关。结膜膨胀、分泌物和最小出血的观察结果被确定为与注射过程相关，并且在给药后当天在大多数眼中得到解决。通过临床眼科检查在第8天观察到的轻度至中度结膜充血、肿胀和分泌物在第23天得到解决，表明这些发现与使用22号
针用于ivt注射过程有关。未观察到给予测试物品对整体非眼部健康或对体重的严重不良反应。总之，ivt di-naca的递送通常是良好耐受的。图6显示dinaca ivt植入物植入后7天时的dinaca、naca和nac水平。图7显示ivt给予后naca和nac作为前药dinaca的代谢物的产生。玻璃体液(vh)中存在dinaca表明dinaca从ivt植入物洗脱到vh中。在vh中存在naca和显著浓度的nac表明dinaca用作naca和nac的前药。
[0082]
如本文所用的，“活性氧物质”或“反应性氧物质”理解为一个或两个电子的转移产生超氧化物，o
2”形式的阴离子或具有式o2‑”的过氧化物阴离子或含有o-o单键的化合物，例如过氧化氢和脂质过氧化物。这样的超氧化物和过氧化物是高度反应性，并可以引起对细胞组分，包括蛋白质、核酸和脂质的损害。
[0083]
如本文所用的，术语“药剂”是指治疗活性化合物或潜在治疗活性化合物，例如抗氧化剂。药剂可以是先前已知或未知的化合物。如本文所用的，药剂通常是非基于细胞的化合物，然而，药剂可包括生物治疗剂，例如肽或核酸治疗剂，例如sirna、shrna、细胞因子、抗体等。
[0084]
氧化是将电子从物质转移到氧化剂的化学反应。这样的反应可由超氧化物阴离子或过氧化物促进或产生超氧化物阴离子或过氧化物。氧化反应可产生自由基，其启动损害细胞的链反应。抗氧化剂通过除去自由基中间体终止这些链反应，并通过自身氧化抑制其他氧化反应。因此，抗氧化剂通常是还原剂，例如硫醇、抗坏血酸或多酚。抗氧化剂包括但不限于α-生育酚，抗坏血酸、mn(iii)四(4-苯甲酸)卟啉、α-硫辛酸和n-乙酰半胱氨酸。
[0085]
如本文所用的，术语“有效量”或“有效剂量”是指产生预期药理学、治疗性或预防性结果的药剂的量。药理学有效量导致疾病或病症的一种或多种体征或症状、或疾病或病症的进展的改善，或引起疾病或病症的消退。例如，治疗有效量优选是指在限定的时间段内，例如2周、1个月、2个月、3个月、6个月、一年、2年、5年或更长，与未治疗的对照受试者相比，使视力丧失、整体视敏度丧失、视野丧失减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的治疗剂的量。可能需要多于一个的剂量来提供有效剂量。
[0086]
如本文所用的，术语“有效的”和“有效性”包括药理学有效性和生理学安全性。药理学有效性是指治疗在患者中产生所需生物学效果的能力。生理安全性是指由给予治疗导致的毒性，或其他细胞、器官和/或生物体水平的不良生理作用(通常称为副作用)的水平。另一方面，术语“无效的”表示至少在未分层的群体中，治疗未提供足够的药理学作用以在治疗上是有用的，即使在没有有害作用的情况下(如治疗在可通过表达谱或多种表达谱识别的亚群中可能是无效的)。“较不有效”意指治疗导致治疗上显著较低水平的药理学有效性和/或治疗上较高水平的不良生理作用，例如较大的肝毒性。
[0087]
因此，关于药物的给予，“有效对抗”疾病或病症的药物表明以临床上合适的方式给予导致对至少统计学上显著部分的患者的有益效果，如症状的改善、治愈、疾病体征或症状的减少、生命的延长、生活质量的改善，或熟悉治疗特定类型的疾病或病症的医生通常认为是阳性的其他效果。
[0088]
如本文所用的，术语“过氧化物酶”或“过氧化物代谢酶”是指通常催化以下形式的反应的一大类酶：
[0089]
roor1+电子供体(2e-)+2h+
→
roh+r1oh。对于许多这些酶，最佳的底物是过氧化氢，其中每个r是h，但其他对有机氢过氧化物，如脂质过氧化物的活性更大。过氧化物酶可在其活性位点含有血红素辅因子、或氧化还原活性半胱氨酸或硒代半胱氨酸残基。
[0090]
如本文所用的，术语短语“药学上可接受的载体”是本领域公知的，并且包括适合向哺乳动物给予本发明化合物的药学上可接受的材料、组合物或溶媒。载体包括液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与将对象试剂从身体的一个器官或部分携载或运输到身体的另一个器官或部分。在与制剂的其他成分相容且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。例如，用于给予细胞的药学上可接受的载体通常是对于通过注射递送是可接受的载体，并且不包括诸如去污剂或可能损害待递送的细胞的其他化合物的试剂。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；以及在药物制剂中使用的其他无毒相容物质，特别是优选用于眼内递送的磷酸盐缓冲的盐水溶液。
[0091]
润湿剂、乳化剂和润滑剂，诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。
[0092]
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(bha)、丁基化羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
[0093]
本发明的制剂包括适合口服、鼻、局部、经皮、颊、舌下、肌内、腹膜内、眼内、玻璃体内、视网膜下和/或其他肠胃外给予途径的那些。具体的给予途径尤其取决于待靶向的具体细胞。制剂可以方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。
[0094]
如本文所用的，“多”应理解为意指多于一。例如，多是指至少两、三、四、五或更多。
[0095]
如本文所用的，术语“多肽”或“肽”理解为通过共价键(例如肽键)连接的两个或更多个独立选择的天然或非天然氨基酸。肽可包括通过肽键连接的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个天然或非天然氨基酸。本文所述的多肽包括全长蛋白质(例如，完全加工的蛋白质)以及较短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白质的片段或合成的多肽片段)。
[0096]
如本文所用的，术语“小分子”是指分子量不超过约1500da、1000da、750da或500da的化合物，通常为有机化合物。在一个实施方案中，小分子不包括仅包含天然氨基酸和/或核苷酸的多肽或核酸。
[0097]
如本文所用的，术语“受试者”是指活的有机体，特别是人。在某些实施方案中，活的有机体是动物，在某些优选的实施方案中，受试者是哺乳动物，在某些实施方案中，受试者是驯养的哺乳动物或灵长类动物，包括非人灵长类动物。受试者的实例包括人、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、山羊和绵羊。人受试者也可称为受试者或患者。
[0098]
如本文所用的，“超氧化物歧化酶”理解为将超氧化物歧化为氧和过氧化氢的酶。实例包括但不限于sod1、sod2和sod3。sod1和sod3是存在于哺乳动物中含cu-zn的超氧化物歧化酶的两种同工型。cu-zn-sod或sod1存在于细胞内空间，而细胞外sod(ecsod或sod3)主要存在于大多数组织的细胞外基质中。
[0099]
如本文所用的，术语“治疗有效量”是指在向细胞或受试者单个或多个剂量给予后，在延长患有这样的障碍的患者的生存能力、减少障碍的一种或多种体征或症状、预防或延迟等方面是有效的，超过在缺乏这样的治疗的情况下所预期的情况的药剂的量。
[0100]
药剂或其他治疗干预可以单独或与一种或多种另外的治疗剂或干预组合作为与常规赋形剂，例如药学上可接受的载体混合的药物组合物或治疗性治疗给予受试者。
[0101]
药剂可以方便地以单位剂型给予，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备，例如，如remington’s pharmaceutical sciences(mack pub.co.,easton,pa,1985)中所述的。用于肠胃外给予的制剂可以含有常规赋形剂，如无菌水或盐水、诸如聚乙二醇的聚亚烷基二醇、植物来源的油、氢化萘等。特别地，生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可能是控制某些药剂释放的有用的赋形剂。
[0102]
本发明涉及naca和/或dinaca治疗、预防或减少包括角膜内皮细胞损失在内的多种氧化应激疾病或病症的用途。在一个实施方案中，本发明包括使用naca和/或dinaca用于预防患者的角膜内皮细胞损失的方法，例如人白内障手术后，所述方法包括向人给予治疗有效量的naca和/或dinaca。在一些实施方案中，在药学上可接受的载体中或与药学上可接受的载体一起提供naca和/或dinaca。在其他实施方案中，眼内、视网膜下、玻璃体内、口服、静脉内、肌内、局部、舌下、直肠、经眼(滴眼剂、插入物、注射剂或植入物)给予naca和/或dinaca。
[0103]
应当理解，用于给定疗法的活性化合物的实际优选量将根据例如所使用的具体化合物，所配制的特定组合物，给予模式和受试者的特征，例如受试者的物种、性别、体重、总体健康和年龄而变化。对于给定的给予方案的最佳给予速率可由本领域技术人员使用根据前述指导原则进行的常规剂量确定测试容易地确定。本文提供的范围应理解为所述范围内的所有值的简写。
[0104]
如本文所用的，本发明的实施方案被定义为包括其药学上可接受的衍生物。“药学上可接受的衍生物”是指本发明化合物的任何药学上的盐、酯、酯的盐或其他衍生物，其给予接受者后能够提供(直接或间接)本发明的化合物。特别有利的衍生物是当向哺乳动物给予本发明的化合物时提高这样的化合物的生物利用度(例如，通过使得口服给予的化合物更容易吸收到血液中，以增加血清稳定性或降低化合物的清除率)或相对于母体物质增强母体化合物向生物隔室(例如，脑或淋巴系统)的递送的那些。衍生物包括其中将增强水溶性或通过肠膜的主动转运的基团添加至本文所述式的结构的衍生物。
[0105]
本发明的实施方案可以通过添加适当的功能来改进，以增强选择性生物学性质。这样的修饰是本领域已知的并且包括增加进入给定生物区室(例如，血液、淋巴系统、中枢神经系统)的生物渗透、提高口服利用度、增加溶解度以实现通过注射给予、改变代谢和改变排泄速率的那些。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自药学上可接受的无机和有机酸和碱的那些。合适的酸盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、甲酸盐、富马酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸
盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐(palmoate)、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐(undeconaoate)。衍生自适当碱的盐包括碱金属(例如钠)、碱土金属(例如镁)、铵和n-(烷基)4+盐。
[0106]
本发明还设想本文公开的化合物的任何碱性含氮基团的季铵化。水或油溶性或可分散的产物可通过这样的季铵化获得。
[0107]
本发明的实施方案可以例如通过注射、眼内、玻璃体内、视网膜下、静脉内、动脉内、真皮下、肌内或皮下；或口服、经颊、经鼻、经粘膜、通过导管直接至患病器官、局部或以眼用制剂给予，剂量范围为约0.001至约100mg/kg体重，或根据具体药物的需要，更优选0.5-10mg/kg体重。应当理解，当将化合物直接递送至眼睛时，考虑因素诸如体重对剂量的影响较小。
[0108]
给药频率将取决于所给予的药剂、受试者疾病或病症的进展以及本领域技术人员已知的其他考虑因素。例如，对于递送至眼或甚至眼内隔室的组合物的药代动力学和药效学考虑因素是不同的，例如视网膜下空间中的清除率非常低。因此，给药可以不常进行，如每月一次、每三个月一次、每六个月一次、每年一次、每五年一次或更少。如果抗氧化剂的全身给予是要与将表达构建体给予至视网膜下空间结合进行，则预期抗氧化剂的给药频率将高于表达构建体，例如每天一次或多次、每周一次或多次。
[0109]
可结合监测疾病的一种或多种体征或症状，例如视敏度、视野、夜间视力等来确定剂量。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和特定给予模式而变化。典型的制剂将含有约1％至约95％活性化合物(w/w)。供选择地，这样的制剂含有约20％至约80％的活性化合物。可能需要比上述剂量更低或更高的剂量。任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性，年龄，体重，总体健康状况，性别，饮食，给予时间，排泄速率，药物组合，疾病、病症或症状的严重程度和过程，患者对疾病、病症或症状的处置和治疗医师的判断。
[0110]
药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，如无菌可注射水性或油性悬浮液。该混悬液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂(例如80)和悬浮剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的溶媒和溶剂包括甘露醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油常规用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，如天然的药学上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙烯化形式那样。这些油溶液或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或类似分散剂，其通常用于配制药学上可接受的剂型，诸如乳液和/或悬浮液。其他常用的表面活性剂，如或和/或其他常用于制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型的类似乳化剂或生物利用度增强剂也可用于制剂目的。
[0111]
在一个或多个实施方案中，以约0.5至150mg/kg的每日剂量给予naca或dinaca。在其他实施方案中，每天两次或三次给予naca或dinaca。另一方面，naca或dinaca与选自抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(bha)、丁基化羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生
育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等的第二活性剂一起给予。
[0112]
在一些实施方案中，用于给予的naca或dinaca的剂量为每剂100、150、150、300、333、400、500、600、700、750、800、900、1000、2500、5000、7500或10000mg。另一方面，用于给予的剂量为每剂0.001-0.01、0.01-0.1、0.1-0.25、0.1-0.4、0.35-0.5、0.5-1、102、1-3、1-4、1-5、1-2.5、2.5-3.5、4-6、5-8、6-9、7-10克。
[0113]
另一方面，naca或dinaca经由小片、胶囊、片剂、泡腾剂、双重释放剂、混合释放剂、小药囊、粉剂或液体口服递送。另一方面，预防性给予naca或dinaca以预防或减少角膜内皮细胞损失。在另一个实施方案中，本发明包括治疗角膜内皮细胞损失的方法，其包括：识别需要治疗角膜内皮细胞损失的人；以及向人给予足以预防或减少角膜内皮细胞损失的治疗有效量的naca或dinaca。应当理解，与采用上述其他实施方案一样，以约0.5至150mg/kg的每日剂量给予naca或dinaca。另一方面，每天两次或三次给予naca或dinaca。另一方面，与上文公开的第二活性剂一起给予naca或dinaca。
[0114]
另一方面，用于给予的naca或dinaca的剂量为每剂100、150、150、300、333、400、500、600、700、750、800、900、1000、2500、5000、7500或10000mg。另一方面，用于给予的剂量为每剂0.001-0.01、0.01-0.1、0.1-0.25、0.1-0.4、0.35-0.5、0.5-1、102、1-3、1-4、1-5、1-2.5、2.5-3.5、4-6、5-8、6-9、7-10克。
[0115]
另一方面，经由小片、胶囊、片剂、泡腾剂、双重释放剂、混合释放剂、小药囊、粉剂或液体口服递送naca。另一方面，预防性给予naca或dinaca以预防或减少角膜内皮细胞损失。
[0116]
如本文所用的，“对特定疾病或病症等敏感”、或“倾向于”或“易患”特定疾病或病症等是指基于遗传、环境、健康和/或其他风险因素比一般群体更可能发展疾病或病症的个体。发展疾病的可能性增加可以是约10％、20％、50％、100％、150％、200％或更多的增加。
[0117]
另一方面，用于预防人受试者的角膜内皮细胞损失的方法包括以下，基本上由以下组成或由以下组成：识别需要治疗角膜内皮细胞损失的人患者；以及向人患者给予足以预防或减少角膜内皮细胞损失的治疗有效量的n-乙酰半胱氨酸酰胺(naca)或(2r,2r’)-3,3
’‑
二硫烷二基双(2-乙酰胺基丙酰胺)(dinaca)。
[0118]
用于预防或减少人受试者的角膜内皮细胞损失的方法包括以下，基本上由以下组成或由以下组成：识别需要治疗角膜内皮细胞损失的人；以及向人给予足以预防或减少角膜内皮细胞损失的治疗有效量的n-乙酰半胱氨酸酰胺(naca)或(2r,2r’)-3,3
’‑
二硫烷二基双(2-乙酰胺基丙酰胺)(dinaca)。
[0119]
naca和/或dinaca的临床试验
[0120]
可进行临床试验以证明一起或分开给予的naca和dinaca治疗老花眼、aids、抗蛇毒素、β-地中海贫血、白内障、慢性阻塞性肺病、角膜内皮细胞损失、糖尿病和糖尿病诱导的溃疡、黄斑变性、造影剂诱导的肾病、哮喘、肺挫伤、黄斑变性、甲基苯丙胺诱导的氧化应激、多发性硬化、帕金森病、血小板凋亡、老花眼、迟发性运动障碍、阿尔茨海默病、hiv、hiv-1相关的痴呆、线粒体疾病、心肌肌病、神经退行性疾病、肺纤维化、色素性视网膜炎、usher综合征、stargardt综合征、年龄相关的黄斑变性、皮肤色素沉着、需要恢复活力的皮肤、抗微生物感染和/或弗里德赖希共济失调的能力。选择用于aids、抗蛇毒素、β-地中海贫血、白内
障、慢性阻塞性肺病、角膜内皮细胞损失、糖尿病和糖尿病诱导的溃疡、黄斑变性、造影剂诱导的肾病、哮喘、肺挫伤、黄斑变性、甲基苯丙胺诱导的氧化应激、多发性硬化、帕金森病、血小板凋亡、老花眼、迟发性运动障碍、阿尔茨海默病、hiv、hiv-1相关的痴呆、线粒体疾病、心肌肌病、神经退行性疾病、肺纤维化、色素性视网膜炎、usher综合征、stargardt综合征、年龄相关的黄斑变性、皮肤色素沉着、需要恢复活力的皮肤、抗微生物感染和/或弗里德赖希共济失调的适当模型系统，可将dinaca、nac、naca或其组合分开或一起提供，并与安慰剂对照隔开。
[0121]
例如，一个模型将类似于用于证明ev06的抗老花眼活性的模型(www.eyeworld.org/has-presbyopia-found-encore)。对于老花眼，对于每种药物，临床研究将是在一个或多个临床场所的前瞻性、随机、双盲、安慰剂作对照的研究，包括约75名患有远视、近视或正视和诊断为老花眼的患者(45-55岁)。患者大概地以2：1的比例随机分配(例如，活性＝50：安慰剂＝25)。将给予研究产品90天，并在3个月随访期期间监测患者。在基线处，对研究患者进行dcnva监测以及随后的访视。安全性将基于活性组(active arm)与安慰剂组(placebo arm)的副作用的比较。功效将基于如活性组与安慰剂组的双侧视力的logmar变化所测量的视敏度测量值的比较。
[0122]
类似地，可以对各种氧化应激病症或疾病进行试验，所述氧化应激病症或疾病选自老花眼、aids、抗蛇毒素、β-地中海贫血、白内障、慢性阻塞性肺病、角膜内皮细胞损失、糖尿病和糖尿病诱导的溃疡、黄斑变性、造影剂诱导的肾病、哮喘、肺挫伤、黄斑变性、甲基苯丙胺诱导的氧化应激、多发性硬化、帕金森病、血小板凋亡、老花眼、迟发性运动障碍、阿尔茨海默病、hiv、hiv-1相关的痴呆、线粒体疾病、心肌肌病、神经退行性疾病、肺纤维化、色素性视网膜炎、usher综合征、stargardt综合征、年龄相关的黄斑变性、皮肤色素沉着、需要恢复活力的皮肤、抗微生物感染和/或弗里德赖希共济失调。
[0123]
预期就本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物而言，本说明书中讨论的任何实施方案都可以实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
[0124]
应当理解，本文描述的特定实施方案是通过举例说明而不作为对本发明的限制来显示的。在不脱离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各个实施方案。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述具体过程的许多等同方案。这样的等同方案被认为在本发明的范围内，并且被权利要求所覆盖。
[0125]
说明书中提到的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域的技术人员的技术水平。
[0126]
所有的出版物和专利申请都通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请被特意地和单独地指明通过引用并入相同。
[0127]
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含(comprising)”结合使用时，词语“一(a)”或“一(an)”的使用可以意指“一”，但它也与“一或多”、“至少一”和“一或多于一”的含义一致。权利要求中使用的术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指出仅指供选择的方案，或者供选择的方案相互排斥，尽管公开内容支持仅指供选择的方案和“和/或”的定义。在整个本技术中，术语“约”用于显示数值包括设备的误差、用于确定数值的方法的固有变化或研究对象之间存在的变化。
[0128]
如在本说明书和(多项)权利要求中所使用的，词语“包含(comprising)”(以及任
何形式的包含(comprising)，如“comprise”和“comprises”)、“具有(having)”(以及任何形式的具有(having)，如“have”和“has”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括(including)，例如“includes”和“include”)、“含有(containing)”(以及任何形式的含有(containing)，如“contains”和“contain”)是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。在本文提供的任何组合物和方法的实施方案中，“包含”可以用“基本上由
……
组成”或“由
……
组成”代替。如本文所用的，短语“基本上由
……
组成”要求指定的(多个)整体或步骤以及不实质上影响所要求保护的本发明的特征或功能的那些。如本文所用的，所发布的术语“组成(consiting)”仅显示所列举的整体(例如，特征、要素、特性、性质、方法/工艺步骤或限定)或整体的组(例如，(多个)特征、(多个)要素、(多个)特性、(多个)性质、(多个)方法/工艺步骤或(多个)限定)的存在。
[0129]
本文所用的术语“或其组合”是指在该术语之前所列项目的所有排列和组合。例如，“a、b、c或其组合”旨在包括以下中的至少一种：a、b、c、ab、ac、bc或abc，并且如果顺序在特定上下文中是重要的，还包括ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个项目或条件的重复的组合，诸如bb、aaa、ab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等。本领域技术人员将理解，通常对任何组合中的项目或条件的数目没有限制，除非另外从上下文中显而易见。
[0130]
如本文所用的，诸如但不限于“约”、“基本的”或“基本上”的近似词语是指当如此修饰时被理解为不必须是绝对的或完美的，但将被认为对本领域普通技术人员而言足够接近以保证指定条件为存在的。描述可以改变的程度将取决于可以实施多大的改变，并且仍使本领域普通技术人员将修改的特征认识为仍具有未修改的特征所需的特性和能力。通常，但受限于前面的讨论，本文中由诸如“约”的近似词语修饰的数值可由所述值变化至少
±
1、2、3、4、5、6、7、10、12或15％。
[0131]
此外，提供本文的章节标题是为了与37cfr 1.77下的建议一致或以其他方式来提供组织提示。这些标题不应限制或表征可从该公开内容得出的在任何权利要求中阐述的(多项)发明。具体地并且举例来说，尽管标题指的是“发明领域”，但是这样的权利要求不应当被该标题下描述所谓的技术领域的语言限制。此外，“发明背景”部分中的技术描述不应被解释为承认该技术是该公开内容中的任何(多项)发明的现有技术。“概述”也不应被认为是对所发布的权利要求中阐述的(多项)发明的表征。此外，在该公开内容中以单数形式对“发明”的任何指称都不应当用于争议在该公开内容中仅存在单个新颖性的点。可以根据从该公开内容得出的多个权利要求的限定来阐述多项发明，并且这样的权利要求相应地限定由此保护的(多项)发明及其等同方案。在所有情况下，这样的权利要求的范围应根据该公开内容以其自身的优点来考虑，但不应受本文所述的标题限制。
[0132]
根据本公开内容，本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以在没有过度实验的情况下制备和实施。虽然本发明的组合物和方法已经就优选的实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对本文所述的组合物和/或方法以及在方法的步骤中或在方法的步骤顺序中施加变化。对于本领域技术人员显而易见的所有这样类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的发明的精神、范围和构思内。