取代的7-(甲氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺衍生物
[0001]
本发明涉及与tyk2的假激酶结构域（jh2）结合并抑制某些细胞因子信号传导，特别是il-23和ifnα信号传导的新型化合物，涉及包含该化合物的药物组合物，涉及使用该化合物治疗某些自身免疫性疾病的方法，并涉及可用于合成该化合物的中间体和方法。
[0002]
牛皮癣和其它自身免疫性疾病（如糖尿病）据信通过某些促炎细胞因子的tyk2信号传导来介导（参见例如j.s.tokarski等人, j. biol. chem., 第290卷(17), 第11061-11074页(2015)；和l.marroqui等人, diabetes, 第64卷, 第3808-3817 页(2015)）。牛皮癣是一种慢性皮肤病，估计影响大约2%的普通人群。牛皮癣的治疗选择包括例如局部治疗，如皮质类固醇，光线疗法，如紫外b（uvb）光，和全身治疗，如甲氨喋呤和阿普斯特。不幸的是，此类药剂并不总是提供有效的治疗，并可能与各种不良副作用相关。
[0003]
us 2019/0031664 a1公开了可用于通过抑制tyk2治疗各种炎性和自身免疫性病症的某些取代的吡唑并[1,5-a]嘧啶。美国专利号7,557,110公开了作为激酶抑制剂的某些吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物，其可用于治疗激酶介导的病症，如炎性疾病和自身免疫性疾病。
[0004]
需要自身免疫性疾病，如牛皮癣、系统性红斑狼疮（sle）和糖尿病的替代治疗。特别地，需要与tyk2 jh2结构域结合的化合物。此外，需要与tyk2 jh2结构域结合并抑制il-23和ifnα信号转导的化合物。
[0005]
因此，在一个实施方案中，本发明提供了式i的化合物：其中r是：或其可药用盐。
[0006]
在一个特定实施方案中，该化合物具有式ia：
或其可药用盐。
[0007]
在一个特定实施方案中，该化合物具有式ib：或其可药用盐。
[0008]
在一实施方案中，r是：或其可药用盐。
[0009]
在一实施方案中，r是：或其可药用盐。
[0010]
在一实施方案中，该化合物是：
或其可药用盐。
[0011]
在一实施方案中，该化合物是：或其可药用盐。
[0012]
在一实施方案中，本发明还提供了在需要此类治疗的患者中治疗牛皮癣的方法，包括向患者施用有效量的式i的化合物或其可药用盐。在一实施方案中，本发明进一步提供了在需要此类治疗的患者中治疗sle的方法，包括向患者施用有效量的式i的化合物或其可药用盐。在一实施方案中，本发明进一步提供了在需要此类治疗的患者中治疗选自炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎（ra）、斑秃、特应性皮炎、中轴型脊柱关节炎、多发性硬化（ms）、1型糖尿病、2型糖尿病和成人隐匿性自身免疫性糖尿病（lada）的疾病的方法，包括向患者施用有效量的式i的化合物或其可药用盐。
[0013]
在一实施方案中，本发明提供了用于治疗的式i的化合物或其可药用盐。在一实施方案中，本发明提供了用于治疗牛皮癣的式i的化合物或其可药用盐。在一实施方案中，本发明提供了用于治疗sle的式i的化合物或其可药用盐。在一实施方案中，本发明还提供了用于治疗选自炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、牛皮癣性关节炎、ra、斑秃、特应性皮炎、中轴型脊柱关节炎、ms、1型糖尿病、2型糖尿病和lada的疾病的式i的化合物或其可药用盐。
[0014]
在一实施方案中，本发明还提供了式i的化合物或其可药用盐用于制备治疗牛皮癣的药物的用途。在一实施方案中，本发明提供了式i的化合物或其可药用盐用于制备治疗sle的药物的用途。在一实施方案中，本发明还提供了式i的化合物或其可药用盐用于制备治疗选自炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、牛皮癣性关节炎、ra、斑秃、特应性皮炎、中轴型脊柱关节炎、ms、1型糖尿病、2型糖尿病和lada的疾病的药物的用途。
[0015]
在一实施方案中，本发明进一步提供了药物组合物，其包含式i的化合物或其可药用盐与一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。在一实施方案中，本发明进一步提供了制备药物组合物的方法，包括将式i的化合物或其可药用盐与一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂混合。在一实施方案中，本发明还涵盖了用于合成式i的化合物的新型中间体和方法。
[0016]
本文中所用的术语“治疗”包括限制、减缓、停止或逆转现有症状或病症的进展或严重程度。
[0017]
本文中所用的术语“患者”是指哺乳动物，特别是人类。
[0018]
本文中所用的术语“有效量”是指本发明的化合物或其可药用盐的量或剂量，其在单剂或多剂施用于患者时在接受诊断或治疗的患者中提供所需效果。
[0019]
有效量可以由本领域技术人员通过使用已知技术并通过观察在类似情况下获得
的结果来确定。在对患者确定有效量时，主治诊断师会考虑许多因素，包括但不限于：患者的物种；其大小、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的牵涉程度或严重性；个体患者的反应；施用的特定化合物；施用方式；施用的制剂的生物利用度特性；所选择的剂量方案；同时使用药物；和其它相关情况。
[0020]
本发明的化合物被配置为药物组合物，所述药物组合物通过使该化合物具有生物可利用性的任何途径施用。最优选地，此类组合物用于口服施用。此类药物组合物及其制备方法在本领域中是公知的（参见例如remington: the science and practice of pharmacy, l.v. allen, 著, 第22版, pharmaceutical press, 2012）。
[0021]
式i的化合物或其可药用盐特别可用于本发明的治疗方法，其所有构型（包括对映异构体）及其混合物（包括外消旋体）均设想在本发明的范围内。要理解的是，这些构型适用于本发明的治疗方法和化合物。
[0022]
在下文制备例中描述的某些中间体可含有一个或多个氮保护基团。要理解的是，保护基团可以如本领域技术人员理解的那样根据特定反应条件和要进行的特定转化而不同。保护和脱保护条件是技术人员公知的，并描述在文献中（参见例如“greene’s protective groups in organic synthesis”, 第四版, peter g.m. wuts和theodora w. greene, john wiley and sons, inc. 2007）。
[0023]
单个异构体（包括对映异构体）可由本领域普通技术人员在本发明的化合物的合成中的任何方便的点通过诸如选择性结晶技术或手性色谱法来分离或拆分y（参见例如j. jacques等人,
ꢀ“
enantiomers, racemates, and resolutions”, john wiley and sons, inc., 1981及e.l. eliel和s.h. wilen,
ꢀ“
stereochemistry of organic compounds”, wiley-interscience, 1994）。
[0024]
本发明的化合物的可药用盐可以例如通过本发明的化合物的适当的游离碱、适当的可药用酸在合适的溶剂（如二乙醚）中在本领域中公知的标准条件下的反应来形成。此外，此类可药用盐的形成可以在氮保护基团的脱保护下同时发生。参见例如gould, p.l.,
ꢀ“
salt selection for basic drugs,
”ꢀ
international journal of pharmaceutics, 33: 201-217 (1986)；bastin, r.j.等人,
ꢀ“
salt selection and optimization procedures for pharmaceutical new chemical entities,
”ꢀ
organic process research and development, 4: 427-435 (2000)；和berge, s.m.等人,
ꢀ“
pharmaceutical salts,
”ꢀ
journal of pharmaceutical sciences, 66: 1-19, (1977)。
[0025]
某些缩写定义如下：“binap”是指(
±
)-2,2'-双(二苯基膦)-1,1'-联二萘；“bop”是指(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲氨基)六氟磷酸鏻；“dcm”是指二氯甲烷；“dem”是指丙二酸二乙酯；“diea”是指n,n-二异丙基乙胺；“dmem”是指杜皮克氏改良爱哥尔氏培养基；“dmf”是指n,n-二甲基甲酰胺；“dmso”是指二甲亚砜；“dmt”是指二巯基三嗪；“etoac”是指乙酸乙酯；“etoh”是指乙醇和乙基醇；“fbs”是指胎牛血清；“hatu”是指1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓 3-氧化六氟磷酸盐；“hepes”是指4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；“hplc”是指高效液相色谱法；“ifnα”是指α-干扰素；“il-2”是指白介素2；“il-23”是指白介素23；“jak”是指两面神激酶；“lihmds”是指六甲基二硅基氨基锂；“mei”是指甲基碘；“menh
2”是指甲胺；“meoh”是指甲醇和甲基醇；“mtbe”是指甲基叔丁基醚；“naoet”是指乙醇钠；“pd(oac)
2”是指乙酸钯(ii)；“rpm”是指每分钟转数；“rpmi”是指
roswell park memorial institute；“tea”是指三乙胺；“thf”是指四氢呋喃；“tyk2”是指酪氨酸激酶2；“uvb”是指紫外线b；且“stat”是指转录蛋白的信号转导子和激活子。
[0026]
本发明的化合物或其可药用盐可以通过本领域普通技术人员已知的多种程序来制备，其中一些在下面的方案、制备例和实施例中进行了说明。以下方案中每个步骤的产物可以通过本领域中公知的常规方法来回收，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱法、过滤、研磨和结晶。在下面的方案中，除非另行说明，所有取代基如前所定义。试剂和原材料对本领域普通技术人员而言容易获得。在不限制本发明范围的情况下，提供以下方案、制备例和实施例以进一步说明本发明。
[0027]
方案1在方案1步骤a中，化合物（2）的形成显示为使用合适的有机碱如diea和合适的偶联剂如hatu在溶剂如dmf中在0-22℃下在化合物（1）与menh2之间在本领域中公知的条件下的酰胺偶联。
[0028]
在步骤b中，将mei添加到化合物（2）中以形成二甲基碘化锍盐，随后用合适的碱如lihmds在合适的溶剂如thf中在0-22℃下处理以获得环化的化合物（3）。
[0029]
在步骤c中，化合物（3）在标准条件下使用合适的酸如4-甲基苯磺酸在合适的溶剂如乙腈中在大约55℃下脱保护，随后添加溶剂如mtbe以沉淀化合物（4）。
[0030]
方案2
方案2步骤a描绘了将dem加成到化合物（5）上并随后使用合适的碱如naoet或叔丁醇钾在大约80℃下在溶剂如etoh中环化成化合物（6）。
[0031]
在步骤b中，化合物（6）的7-羟基和5-氧代基团可使用合适的氯源如pocl3和合适的有机碱如吡啶在大约50-100℃下在合适的溶剂如乙腈中氯化以获得化合物（7）。
[0032]
在步骤c中，化合物（7）的7-氯基团上的选择性亲核芳族取代可以在本领域中公知的条件下使用适当的亲核试剂如menh2在合适的溶剂如thf中在环境温度下进行以获得化合物（8）。
[0033]
在步骤d中，可以使用合适的催化剂和配体体系如烯丙基氯化钯(ii)二聚体和binap与合适的碱如乙酸钾在适当的溶剂体系如1,4-二氧杂环已烷和2-甲基-2-丁醇中在130℃下加热的情况下对化合物（8）与取代的氨基吡啶来进行buchwald偶联以形成化合物（9）。
[0034]
化合物（9）可用合适的碱如lioh水溶液在合适的溶剂体系如etoh和thf在回流下处理以通过步骤e中所示的酯的碱性水解来获得化合物（10）。
[0035]
步骤f描绘了在本领域中公知的条件下使用合适的有机碱如diea和合适的偶联剂如bop在溶剂如dmf中在化合物（10）与化合物（4）之间进行酰胺偶联以获得式ia的化合物。
[0036]
方案3
方案3步骤a描绘了化合物（8）用合适的碱如naoh水溶液在溶剂如1,4-二氧杂环已烷中在50℃下碱性水解以获得化合物（11）。
[0037]
步骤b显示了在方案2步骤f中一般描述的条件下在化合物（11）和（4）之间进行酰胺偶联以获得化合物（12）。
[0038]
在步骤c中，可以使用合适的催化剂和配体体系如烯丙基氯化钯(ii)二聚体和binap与合适的碱如乙酸钾在适当的溶剂如1,4-二氧杂环已烷中在130℃下加热的情况下对化合物（12）与取代的氨基吡啶来进行buchwald偶联以获得式ia的化合物。
[0039]
制备例1n-[(1r)-1-(甲基氨基甲酰基)-3-甲基硫烷基-丙基]氨基甲酸叔丁酯方案1步骤a：将(叔丁氧基羰基)-d-蛋氨酸（400克，1.6摩尔）、甲胺盐酸盐（162.47克，2.4摩尔）和diea（700毫升，4.01摩尔）在dmf（4升）中的溶液冷却至0℃并加入hatu（732.1克，1.92摩尔）。将该反应升温至环境温度。搅拌2小时后，将溶剂蒸发。随后加入水（10升）并用dcm（2
×
3升）萃取水溶液。将有机层合并，用饱和碳酸氢钠水溶液（3升）洗涤，在硫酸钠上干燥，并真空浓缩。所得残余物通过用己烷中的etoac洗脱的硅胶色谱法提纯以获得作为白色固体的标题化合物（368克，87%）。es/ms m/z 263 (m+h)。
[0040]
制备例2n-[(3r)-1-甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
方案1步骤b：n-[(1r)-1-(甲基氨基甲酰基)-3-甲基硫烷基-丙基]氨基甲酸叔丁酯（368克，1.40摩尔）和mei（3.68升，59.11摩尔）的混合物在环境温度下搅拌18小时。随后该混合物真空浓缩。将一部分所得粗二甲基碘化锍盐（210克，0.52摩尔）溶解在thf（4.7升）中，在氮气氛下冷却至0℃，并逐滴加入lihmds（thf中的1.00m溶液，1.16升，1.16摩尔）。该反应混合物随后升温至环境温度。在4小时后，加入水（2.4升）并将溶剂浓缩至一半体积。该混合物用dcm（2
×
3升）萃取。将有机物合并并真空浓缩。残余物通过用dcm 中的meoh洗脱的硅胶色谱法提纯以获得作为白色固体的标题化合物 (50 g). es/ms m/z 215 (m+h). 手性hplc：r
t (保留时间) = 9.13分钟;lc柱: chiralpac ia od 4.6
×
250 mm 5
ꢀµ
m; 等度: 0.1%二乙胺/己烷/乙醇(85/15); 柱温: 25℃; 流速: 1.0 ml/min。
[0041]
旋光度：[α]
d20 = +53
ꢀ°ꢀ
(c=0.5, meoh)。
[0042]
制备例3(3r)-3-氨基-1-甲基-吡咯烷-2-酮；4-甲基苯磺酸方案1步骤c：n-[(3r)-1-甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯（46克，214.69毫摩尔）和4-甲基苯磺酸（74.5克，433毫摩尔）在乙腈（500毫升）中的混合物在55℃下加热并搅拌4小时。随后加入mtbe（1升），将混合物冷却至22℃。过滤收集所得固体，用附加的mtbe洗涤，并真空干燥至恒重以获得作为白色固体的标题化合物（60克，95%）。es/ms m/z 115 (m+h)。
[0043]
旋光度：[α]
d20 = +31.3
ꢀ°ꢀ
(c=0.5, meoh)。
[0044]
制备例47-羟基-5-氧代-4h-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯方案2步骤a：将5-氨基-1h-吡唑-4-甲酸乙酯（12.5克，80.6毫摩尔）和dem（18.5毫升，121毫摩尔）溶解在etoh（90毫升）中。向该混合物中加入naoet（在etoh中21质量%，45.1毫升，121毫摩尔），该混合物在90℃下搅拌24小时。此后，将该混合物冷却至环境温度。随后
用5n hcl水溶液使该混合物呈酸性，将所得沉淀物过滤以获得作为白色固体的标题化合物（11.7克，65.1%）。es/ms m/z 224 (m+h)。
[0045]
替代制备例4方案2步骤a：在25℃下在氮气下向5-氨基-1h-吡唑-4-甲酸乙酯（400克，2.58摩尔）和dem（584毫升，3.87摩尔）在etoh（6.00升）中的溶液中加入叔丁醇钾（578克，5.16摩尔）。该溶液在80℃下搅拌12小时并随后冷却至22℃。该反应混合物用0.1n hcl（2升）稀释并用5n hcl将ph调节为3。将该混合物过滤，滤饼用水（800毫升）洗涤。固体真空干燥至恒重以获得作为灰白色固体的标题化合物（460克，81%）。es/ms m/z 224 (m+h)。
[0046]
制备例55,7-二氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯方案2步骤b：将7-羟基-5-氧代-4h-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯（11.7克，52.4毫摩尔）悬浮在乙腈（50毫升）中并用氮气吹扫5分钟。在50℃下向该混合物中加入pocl3（14.8毫升，157毫摩尔），随后加入吡啶（4.28毫升，52.4毫摩尔），该混合物随后在100℃下搅拌5小时。此后，将该混合物冷却至环境温度并倾入冰/水混合物中。该混合物用碳酸氢钠饱和水溶液中和，将所得沉淀物过滤以获得作为白色固体的标题化合物（13克，95.3%）。es/ms m/z (
35
cl/
37
cl) 260/262 [m+h]
+
。
[0047]
替代制备例5方案2步骤b：在50℃下在氮气下向7-羟基-5-氧代-4h-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯（400克，1.79摩尔）在乙腈（2升）中的悬浮液中逐滴加入pocl3（416毫升，4.48摩尔）和吡啶（217毫升，2.69摩尔）。该混合物在80℃下搅拌12小时。该反应混合物真空浓缩，将残余物倾入水（2升）中。将该反应混合物过滤，固体用水（800毫升）洗涤。该固体真空干燥至恒重以获得作为橙色固体的标题化合物（360克，66%）。es/ms m/z (
35
cl/
37
cl) 260/262 [m+h]
+
。
[0048]
制备例65-氯-7-(甲氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯方案2步骤c：将5,7-二氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯（50.0克，192毫摩尔）添加到thf（250毫升）中，溶液冷却至10℃。随后加入menh2的溶液（33 % w/w在etoh中）（79毫
升，634毫摩尔），保持温度低于20℃。搅拌该混合物并升温至22℃，搅拌4小时。随后加入水（300毫升），该混合物搅拌附加的1小时。过滤收集所得固体并用thf/水混合物（2:3）（100毫升）和水（400毫升）洗涤。该固体随后真空干燥（10 mbar/50℃）至恒重以获得作为淡棕色固体的标题化合物（49.5克，90%）。es/ms m/z (
35
cl/
37
cl) 255/257 [m+h]
+
。
[0049]
制备例75-氯-7-(甲氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸方案3步骤a：将1n naoh (50毫升，50毫摩尔）添加到在1,4-二氧杂环已烷（50毫升）中的5-氯-7-(甲氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯（9.05克，35.5毫摩尔）中并将该混合物升温至50℃。在16小时后，将该混合物冷却至环境温度并通过添加1n hcl将ph调节至~3。收集固体并真空干燥以获得作为浅棕褐色固体的标题化合物（8.0克，》99%）。es/ms m/z (
35
cl/
37
cl) 227/229 [m+h]
+
。
[0050]
制备例85-[(6-乙氧基-2-吡啶基)氨基]-7-(甲氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯方案2步骤d： 向圆底烧瓶中装入5-氯-7-(甲氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯（1.3克，5.1毫摩尔）、6-乙氧基吡啶-2-胺（850毫克，6.2毫摩尔）、乙酸钾（1.1克，11毫摩尔）、2-甲基丁-2-醇（1.4毫升）和1,4-二氧杂环已烷（14毫升）。该烧瓶用氮气冲洗5分钟。加入binap（0.23克，0.36毫摩尔）和烯丙基氯化钯(ii)二聚体（92毫克，0.24毫摩尔），该混合物在130℃下加热。在1小时后，将该混合物冷却至环境温度并用水（30毫升）稀释。该混合物通过硅藻土过滤，滤液悬浮在meoh（400毫升）和dcm（100毫升）中。加入siliamets
®ꢀ
dmt树脂（silicycle r79030b），该混合物在80℃下加热4小时。将该混合物冷却至环境温度，过滤并在环境温度下真空干燥以获得标题化合物（1.7克，93%）。es/ms m/z 357 (m+h)。
[0051]
制备例95-[(6-乙氧基-2-吡啶基)氨基]-7-(甲氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸方案2步骤e： 向圆底烧瓶中装入5-[(6-乙氧基-2-吡啶基)氨基]-7-(甲氨基)吡
唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯（1.7克，4.8毫摩尔）、etoh（18毫升）、thf（5毫升）和溶解在水（11毫升）中的lioh（0.5克，20毫摩尔）。在氮气下将该混合物加热至回流 4小时并随后令其冷却至环境温度。通过添加5n hcl将ph调节至~4。在搅拌30分钟后，将所得固体过滤，用冰冷却的水（20毫升）洗涤，并在环境温度下真空干燥以获得标题化合物（1.4克，89%）。es/ms m/z 329.0 (m+h)。
[0052]
制备例105-氯-7-(甲氨基)-n-[(3r)-1-甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺方案3步骤b：将bop（7.2克，16毫摩尔）添加到5-氯-7-(甲氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸（2.75克，12.1毫摩尔）、(3r)-3-氨基-1-甲基-吡咯烷-2-酮;4-甲基苯磺酸（3.48克，12.2毫摩尔）和diea（9毫升，51.6毫摩尔）在dmf（50毫升）中的混合物中。在环境温度下搅拌1小时后，加入100毫升冰水，该混合物搅拌20分钟。收集所得固体，用附加的水洗涤，并真空干燥以获得作为微黄色固体的标题化合物（2.54克，65%）。es/ms m/z (
35
cl/
37
cl) 323/325 [m+h]
+
。
[0053]
制备例11制备用于tyk2-jh2示踪剂结合测定的示踪剂(2e)-2-[(2e,4e)-5-[3-[6-[4-[4-[[5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-6-(甲基氨基甲酰基)-1,2,4-三嗪-3-基]氨基]吡唑-1-基]-1-哌啶基]-6-氧代-己基]-3-甲基-5-磺酸根合-1-(3-磺酸根合丙基)吲哚-1-鎓-2-基]戊-2,4-二烯叉基]-3,3-二甲基-1-(3-磺酸根合丙基)二氢吲哚-5-磺酸盐;三乙基铵将2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺（5.95克，29.1毫摩尔）添加到nmp（20毫升）中的5-氯-3-甲基硫烷基-1,2,4-三嗪-6-甲酸乙酯（6.8克，29.0毫摩尔）中并在环境温度下搅拌。在90分钟后，加入二乙醚（100毫升），该混合物搅拌15分钟。将所得固体过滤并用二乙醚洗涤。固体在dcm和碳酸氢钠饱和水溶液之间分配。有机层用氯化钠饱和水溶液进一步洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并蒸发以获得作为淡黄色固体的5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-3-甲基硫烷基-1,2,4-三嗪-6-甲酸乙酯（10.12克，82%）。es/ms m/z 402.2 (m+h)。
[0054]
5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-3-甲基硫烷基-1,2,4-三嗪-6-甲酸乙酯（10.12克，23.7毫摩尔）在环境温度下在thf中的2m menh2中（75毫升，150毫摩尔）搅拌4小时。加入二乙醚（100毫升）并将该混合物搅拌15分钟。收集所得固体，用二乙醚（50毫升）洗涤并真空干燥以获得作为浅黄色固体的5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-n-甲基-3-甲基硫烷基-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺（8.03克，78%）。es/ms m/z 387.0 (m+h)。
[0055]
在0℃下将间氯过氧苯甲酸（703毫克，3.14毫摩尔）添加到5-[2-甲氧基-3-(1-甲
基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-n-甲基-3-甲基硫烷基-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺（500毫克，1.26毫摩尔）在dmf（12.5毫升）中的悬浮液中并令其升温至环境温度。在30分钟后，加入4-(4-氨基吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁基酯（520毫克，1.89毫摩尔），该混合物在环境温度下搅拌。24小时后，该混合物在dcm与碳酸氢钠饱和水溶液之间分配。有机层在硫酸镁上干燥，过滤并蒸发。所得固体用二乙醚研磨数次并真空干燥以获得作为86%纯的黄色固体的4-[4-[[5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-6-(甲基氨基甲酰基)-1,2,4-三嗪-3-基]氨基]吡唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯（720毫克，81%）。es/ms m/z 605.2 (m+h)。
[0056]
向4-[4-[[5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-6-(甲基氨基甲酰基)-1,2,4-三嗪-3-基]氨基]吡唑-1-基]哌啶-1-甲酸叔丁酯（720毫克，1.0毫摩尔）在meoh（5毫升）中的悬浮液中加入二氧杂环已烷中的4n hcl（2.5毫升，10毫摩尔）并在环境温度下搅拌。72小时后，蒸发该混合物。所得材料在dcm（100毫升）与水（20毫升）之间分配。通过添加1n naoh将水层的ph调节至》8并用3:1氯仿/异丙醇萃取。将有机层合并，在硫酸镁上干燥，过滤并蒸发。所得固体用二乙醚研磨并随后真空干燥以获得作为86%纯的黄色固体的5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-n-甲基-3-[[1-(4-哌啶基)吡唑-4-基]氨基]-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺（585毫克，97%）。es/ms m/z 505.0 (m+h)。
[0057]
将(2e)-2-[(2e,4e)-5-[3-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-6-氧代-己基]-3-甲基-5-磺酸根合-1-(3-磺酸根合丙基)吲哚-1-鎓-2-基]戊-2,4-二烯叉基]-3,3-二甲基-1-(3-磺酸根合丙基)二氢吲哚-5-磺酸三乙基铵（10毫克，0.008毫摩尔）在dmso（1毫升）中的溶液添加到5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-n-甲基-3-[[1-(4-哌啶基)吡唑-4-基]氨基]-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺（4.5毫克，0.008毫摩尔）和tea（0.002毫升，0.014毫摩尔）在dmso（1毫升）中的溶液中。反应小瓶包裹在铝箔中以避光，并在环境温度下搅拌整夜。所得残余物通过用水中0至20%乙腈洗脱的制备型hplc（kinetix evo c18 30 mm
×
100 mm, 5μm）提纯以获得作为亮蓝色固体的标题化合物（8.5毫克，65%）。es/ms m/z 673.4 (m+h)。
[0058]
实施例15-[(6-乙氧基-2-吡啶基)氨基]-7-(甲氨基)-n-[(3r)-1-甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺方案2步骤f：向5-[(6-乙氧基-2-吡啶基)氨基]-7-(甲氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸（1.4克，4.3毫摩尔）、(3r)-3-氨基-1-甲基-吡咯烷-2-酮;4-甲基苯磺酸（1.2克，4.1毫摩尔）在dmf（25毫升）中的混合物中加入diea（3毫升，17毫摩尔）和bop（2.5克，5.5毫摩尔）。在环境温度下搅拌18小时后，该反应混合物在3:1 dcm和meoh与2n naoh水溶液之间分配。水层用3:1 dcm和meoh萃取两遍。将有机层合并并用5n naoh水溶液和饱和氯化钠水溶
液洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并真空浓缩。所得残余物经由反相色谱法提纯以获得标题化合物（0.94克，52%）。es/ms m/z 425.2 (m+h)。
[0059]
实施例25-[(4,6-二甲基-2-吡啶基)氨基]-7-(甲氨基)-n-[(3r)-1-甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺方案3步骤c：向20毫升小瓶中装入5-氯-7-(甲氨基)-n-[(3r)-1-甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺（1克，3.1毫摩尔）、4,6-二甲基吡啶-2-胺（660毫克，5.4毫摩尔）和乙酸钾（770毫克，7.8毫摩尔）。将小瓶抽空并用氮气回填3遍。加入1,4-二氧杂环已烷（11毫升）、(r)-binap（160毫克，0.25毫摩尔）和烯丙基氯化钯(ii)二聚体（66毫克，0.18毫摩尔），小瓶用氮气冲洗并加热至130℃。~30分钟后，将该混合物冷却至环境温度并倾入etoac（75毫升）和水（50毫升）的混合物中。剧烈搅拌~10分钟后，将该混合物过滤。固体依次用etoac和水洗涤，随后真空干燥以获得粗米色固体。该固体悬浮在dmf（20毫升）、dmso（20毫升）和meoh（5毫升）的混合物中。加入1克siliamets
®ꢀ
dmt树脂（silicycle r79030b），混合物在设定为80℃的加热块中搅拌整夜。将树脂过滤并用附加的dmf和dmso洗涤。在高真空下浓缩滤液以获得作为灰白色固体的标题化合物（725毫克，57%）。es/ms m/z 409 [m+h]
+
。
[0060]
tyk2-jh2示踪剂结合测定具有n端his6标签的人jak（细胞质酪氨酸激酶的两面神家族）家族酪氨酸激酶2（tyk2）（genbank np_003322）的假激酶结构域（jh2）在杆状病毒中表达并通过hispur ni-nta亲和力和superdex 200尺寸排阻色谱法纯化。制备例11中制备的化合物，其是alexa fluor 647染料（thermo fisher scientific）与合适的tyk2 jh2结合剂的缀合物，在本文中被称为“示踪剂”。在100% dmso中制备实施例1和实施例2的化合物的3倍、10点连续稀释，并使用声学液体处理将50 nl/孔转移到proxiplate-384f白板（perkinelmer 6008280）中。用于确定百分比抑制的对照孔含有100% dmso（50 nl）和含有示踪剂（2.00 nm最终浓度）（最低，低fret）或稀释的tyk2-jh2酶（0.200 nm最终浓度）与示踪剂（2.00 nm最终浓度）（最大，高fret）的测定缓冲液。
[0061]
将5.0
ꢀµ
l在测定缓冲液 （50 mm hepes ph 7.5，10 mm氯化镁，1 mm乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-n,n,n',n'-四乙酸，0.01% brij-35和milli-q）水中的his标记的tyk2-jh2（0.402 nm）和lanthascreen eu-anti-his ab（4.02 nm, lifetech, pv5597）添加到含有50 nl稀释化合物的proxiplate-384板和对照孔中。将5.0
ꢀµ
l的测定缓冲液中的示踪剂（2.00 nm最终浓度）添加到该板中并令其在环境温度下平衡30分钟。30分钟后，该板在perkinelmer envision上使用以下设置进行计数：激发（340 nm），示踪剂发射（665 nm）和
lanthascreen eu-anti-his抗体发射（615 nm）。确定示踪剂发射（665 nm）对lanthascreen eu-anti-his抗体发射（615 nm）的比。使用最大和最小对照孔计算每个抑制剂浓度下的百分比抑制率，并拟合至genedata screener
®
中的四参数非线性逻辑方程以获得《 0.254 nm (n=1)的实施例1的化合物的ic
50
和《 0.254 nm (n=1)的实施例2的化合物的ic
50
。该结果表明实施例1和实施例2的化合物在体外与tyk2-jh2假激酶结构域结合。
[0062]
在tf1细胞中抑制通过pstat1的ifnα信号传导tf1细胞（atcc, cl-2003）在补充有10%透析fbs、0.1 mg/ml氨苄青霉素和2 ng/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的rpmi 1640（gibco）中生长。将tf1细胞（每孔100 k个）接种在无血清dmem中的96孔聚-d-赖氨酸涂布的板中并在37℃下在5% co2下温育整夜。将实施例1在dmso中连续稀释，添加到细胞中，并在37℃下温育1小时。随后37℃下用10 ng/ml ifnα2刺激细胞20分钟。除去培养基后，将细胞在含有 halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的缓冲液（thermo scientific #78441）中在环境温度下裂解30分钟。根据供应商推荐的方案，使用 alphalisa surefire ultra p-stat1 (tyr701)测定试剂盒（perkin elmer #alsu-pst1-a50k）将p-stat1（tyr701）的量量化为615 nm处的光发射。计算每个抑制剂浓度下的百分比抑制，并使用genedata screener
®
拟合至四参数非线性逻辑方程以获得表示为具有平均值标准误差（sem）的几何平均值的0.038
ꢀµ
m (
±ꢀ
0.004
ꢀµ
m, n=2)的实施例1的化合物的ic
50
和0.084
ꢀµ
m (n=1)的实施例2的化合物的ic
50
。该结果表明实施例1和实施例2的化合物是tf1细胞中通过pstat1的ifnα信号传导的抑制剂。
[0063]
il23 pstat3 alphalisa测定表达内源性il23受体的il2依赖性kit225细胞（university of texas md anderson cancer center）用连接至荧火虫荧光素酶的lenti stat3 reporter（sabiosciences cls-6028l）稳定转导。这些细胞用于通过使用alphalisa技术（tgr biosciences alsu-tst3-a50k）在il2的存在下由il23诱导后量化由stat3磷酰化导致的基因表达来监控tyk2活性。该细胞在补充有10% fbs（invitrogen 10082）、1x pen/strep（gibco 15140-122）、200 ng/ml puromycin（sigma p9620）和新鲜的10 ng/ml重组人il2（r&d systems 202-il-50）的rpmi 1640（gibco 22400）中生长。
[0064]
对于测定准备，将细胞以300,000个细胞/孔分配到dmem（sigma d5796）中的biocoat黑色聚-d-赖氨酸涂布的透明底384孔板（becton dickinson bio-coat 35-4640）中并在37℃下温育整夜。溶解在dmso中的化合物连续稀释1:3以产生10点浓度响应曲线（最终dmso = 0.1%）。细胞在37℃下用实施例1预温育1小时，随后用il23（25 ng/ml最终）刺激30分钟。在以2000 rpm离心10分钟后，细胞团块用1:1裂解缓冲液（tgr biosciences）和halt protease & phosphatase混合抑制剂（thermo scientific 1861281）的混合物裂解30分钟。根据供应商推荐的方案进行alphalisa反应，并使用envision读板仪（perkin elmer）测量荧光素酶水平。使用四参数非线性逻辑方程（genedata screener 13.0.5）计算相对ic
50
以获得表示为具有平均值标准误差（sem）的几何平均值的0.029
ꢀµ
m（
±ꢀ
0.007
ꢀµ
m, n=2）的实施例1的化合物的ic
50
和0.060
ꢀµ
m（n=1）的实施例2的化合物的ic
50
。该结果表明实施例1和实施例2的化合物在基于细胞的测定中是il-23信号传导的抑制剂。