用于增强人受试者中尿石素产生的组合物的制作方法

1.本发明涉及组合物，其包含1)石榴(punica granatum l.)和/或另一种来源的鞣花单宁和/或鞣花酸的制剂，以及2)一种或多种人乳寡糖(hmo)。本文还披露了通过将所述组合物施用于人受试者来改善肠道中尿石素a和/或其他尿石素的产生的方法。


背景技术：

2.尿石素是肠道微生物群衍生的代谢物，由肠道微生物群对鞣花单宁和/或鞣花酸的分解代谢产生。鞣花单宁的丰富来源是石榴和例如树莓、草莓、黑莓和核桃等某些水果和坚果。
3.鞣花单宁在肠道中水解以释放鞣花酸，鞣花酸通过失去其两种内酯中的一种并且通过连续去除羟基基团被肠道微生物群进一步加工成尿石素。
4.在人中，尿石素a、尿石素b和异尿石素a是鞣花单宁和/或鞣花酸分解代谢转化的可测量的最终代谢物(参见图1)。尿石素a是在人血浆和尿液中观察到的主要代谢物，主要以与葡糖醛酸和/或硫酸盐缀合的形式存在。
5.尿石素a、b、c和d都显示出延长线虫秀丽隐杆线虫(chaenorhabditis elegans)寿命的能力(在19.0％与45.4％之间)。尿石素a在整个治疗持续时间期间激活线粒体自噬。线粒体自噬是通过自噬去除受损或多余的线粒体的过程。结果进一步表明，尿石素a治疗激活了老年蠕虫中的线粒体生物发生。通过尿石素a治疗改善了衰老过程中的咽部抽吸率(pumping rate)和流动性(mobility)。使用尿石素b观察到类似的效果，而尿石素c和尿石素d则显示出轻微益处或无益处(ryu等人2016)。用尿石素a治疗已显示老年小鼠的耐力能力提高(跑步耐力提高42％)以及肌肉功能提高(自发运动水平提高57％)。瘦肌肉质量没有增加，这表明尿石素a改善了肌细胞的质量而不是数量。在分子水平上，用尿石素a治疗导致自噬和线粒体自噬转录物表达升高的普遍趋势(ryu等人2016)。
6.此外，尿石素a在临床试验中已显示出对线粒体健康的有前景的效果。以500mg/d和1000mg/d的剂量口服施用28天后，尿石素a刺激了人骨骼肌中的线粒体生物发生(andreux等人2019)。
7.线粒体是细胞的主要能量生产者，在广泛的细胞过程(包括调节细胞稳态)中发挥着至关重要的作用。平衡新线粒体的产生(线粒体生物发生)和受损线粒体的去除(线粒体自噬)的复杂的调节网络形成了健康衰老和长寿的基础。
8.线粒体自噬效率随着年龄的增长而下降，导致受损和/或多余的线粒体逐渐积累，细胞功能恶化，并且最终导致细胞死亡。大多数与衰老相关的疾病，特别是神经系统变性疾病，都与线粒体有关。线粒体功能障碍与糖尿病、癌症、心血管疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、年龄相关性黄斑变性、慢性炎症和自身免疫性障碍等多种疾病有关(haas 2019)。线粒体自噬受损或缺陷的重要性对于阿尔茨海默病(fang等人2019)和帕金森病(srivastava 2017)的发展是熟知的。
9.骨骼肌中线粒体功能差与老年个体步行速度慢和肌肉力量差密切相关。老年人肌
肉功能下降通常是更大的综合征(称为衰弱)的一部分，这是残疾、住院和死亡的重要风险因素。据报道，线粒体自噬相关基因表达的降低与衰弱老年人的较慢步行速度相关(drummond等人2014)。
10.新出现的证据表明，增强的线粒体自噬促进健康衰老而且延缓各种与年龄相关的病状的发作和进展。因此，线粒体自噬调节可以作为潜在的治疗方法来缓解与年龄相关的虚弱。
11.因此，有大量证据表明，尿石素具有延缓某些与线粒体功能相关的衰老过程的有益效果，并且因此尿石素可能是老年群体的有价值的食品补充剂。然而，由于待定的监管批准程序，分离的尿石素通常不能直接施用于人。尿石素a已在美国获得gras批准，但尚未在欧盟授权为新型食品(djedjibegovic等人2020)。
12.消耗分离的尿石素的替代方案是使用天然来源的鞣花单宁，例如石榴以及某些水果和坚果(例如树莓、草莓、黑莓和核桃)，并依靠肠道微生物群将鞣花单宁和/或鞣花酸体内分解代谢为尿石素。
13.然而，摄取天然来源的鞣花单宁(例如石榴)并不是普遍适用的替代方案，因为并非所有个体都具有适当的肠道微生物群来产生期望的尿石素代谢物。正如许多临床试验所报道的，5％-30％的给定群体不能将鞣花单宁或鞣花酸转化为尿石素，或仅产生微量的尿石素(tomas-barberan等人2014；li等人2015)。在尿石素生产者中，已区分出两种主要的代谢型：仅产生尿石素a的个体和除尿石素a外还产生异尿石素a和/或尿石素b的个体(tomas-barberan等人2014)。因此，科学文献中通常提到三种不同的尿石素代谢型：专属尿石素a生产者(um-a)、混合尿石素生产者(um-b)和非生产者(um-0)。
14.尚待确定哪些肠道微生物负责将鞣花单宁完全分解代谢转化为尿石素。许多临床试验和体外研究有助于阐明这个问题，结果是至少一些细菌组、属和物种已被认为在转化中发挥作用。在西班牙进行的几项临床研究中，属于伊格尔兹氏菌(eggerthellaceae)科和放线菌(actinobacteria)门的戈登氏杆菌(gordonibacter)属与尿石素产生相关(gonz
á
lez-sarr
í
as等人2017；cort
é
s-mart
í
n等人2019；romo-vaquero等人2015)。
15.细菌物种嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)(阿克曼氏菌科(akkermaniaceae)、疣微菌门(verrucomicrobia))能够从石榴鞣花单宁体外产生鞣花酸。在基线和施用石榴提取物4周后，发现与非生产者相比，该物种在尿石素a生产者的粪便样品中的浓度分别高出33倍和47倍(li等人2015)。
16.据报道，在摄入石榴提取物后，um-b个体(但不是um-a个体)的乳酸菌和双歧杆菌(bifidobacteria)减少(gonz
á
lez-sarr
í
as等人2017)。另一方面，另一项临床研究报道，双歧杆菌仅在um-b受试者摄入核桃后增加(garc
í
a-mantrana等人2019)。此外，在um-a产后女性中发现的双歧杆菌(双歧杆菌科(bifidobacteriaceae)，放线菌)丰度高于um-b个体(cort
é
s-mart
í
n等人2019)。
17.在某些条件下和某些代谢型中，关于肠道微生物群组成的相互矛盾的报告的类似案例似乎更多的是惯例而不是例外。简而言之，仅部分阐明了鞣花单宁至尿石素的分解，并且当涉及到相关微生物时，可能存在更多途径。
18.目前，对激活非生产者组中尿石素产生的方法的需求未得到满足，因为这些个体不能从尿石素的健康改善效果中受益。


技术实现要素：

19.本发明的目的是使尿石素非生产者，特别是50岁以上的男性和女性，由于改善的线粒体功能，在健康衰老方面能够受益于尿石素的生理优势。改善的线粒体功能的健康益处包括保留肌肉力量、保持健康的心脏和免疫系统以及避免神经系统变性障碍。
20.本发明人现已发现，施用包含石榴果实制剂与有效剂量的一种或多种人乳寡糖(hmo)组合的口服组合物导致被认为是
″
非生产者
″
的个体中的尿石素产生的激活。如本文所定义，非生产者在摄取含有鞣花单宁和/或鞣花酸的食物来源后不产生任何所谓的最终尿石素代谢物，即尿石素a、尿石素b和异尿石素a，或仅产生极少量的尿石素。由于用于测量体液或组织中尿石素(或任何其他化合物)的分析设备的固有检测限(lod)，无法明确地确定真正的非生产者。在本文，我们将非生产者定义为尿液中最终尿石素的最大量《5μg/mg肌酐的个体。该定义与li等人((2015)，同上)的发现一致，因为尿石素a非生产者在技术上与最终尿石素非生产者相同。据li等人(2015)报道，
″
无基线ua产生
″
的个体组包括尿液中基线尿石素a产生高达2.9μg/mg肌酐的个体(li等人，2015)。因此，尿液中5μg最终尿石素/mg肌酐的最大限值似乎是非生产者和最终尿石素生产者之间的合理分界线。
21.在施用上文提及的包含石榴果实制剂与有效剂量的一种或多种人乳寡糖(hmo)组合的口服组合物后，尿石素产生的增加可能无法通过相应量的单独的石榴制剂或其他来源的鞣花单宁或鞣花酸实现。
22.在第一方面，本发明由此提供了组合物，其包含石榴果实制剂以及有效剂量的一种或多种人乳寡糖(hmo)。这些物质的组合效果是增加肠道微生物群对最终尿石素的产生。
23.本发明还涉及用于鉴定和治疗非生产者的方法，以使这些个体能够受益于改善的线粒体功能(包括增加的线粒体自噬)的积极健康效果。对于中老年个体(+50)尤其如此。该鉴定是基于在个体连续三天摄取标准化剂量的鞣花单宁后从所述个体获得的尿液样品的分析。
24.在第二方面，本发明由此提供了根据第一方面的组合物，该组合物用于在治疗被鉴定为非生产者的人受试者中使用，所述鉴定包括以下步骤：
25.a)连续三天向人受试者口服施用标准化剂量的鞣花单宁，以及
26.b)在人受试者摄取第一个标准化剂量的鞣花单宁后72-88小时，从人受试者获得尿液样品，
27.c)分析尿液样品中尿石素a、尿石素b和异尿石素a的存在和水平，
28.d)分别比较ua生产者和混合生产者的尿石素a、尿石素b和异尿石素a的水平与代谢型参考水平；
29.e)根据受试者水平与参考水平的比较，确定受试者是ua生产者、混合生产者还是非生产者，
30.其中尿液中尿石素a、尿石素b和异尿石素a存在的总量小于5μg/mg肌酐将受试者分类为非生产者。
31.在第三方面，本发明还涉及治疗被鉴定为非生产者的人受试者的方法，所述方法包括
32.a)连续三天向人受试者口服施用标准化剂量的鞣花单宁，
33.b)在人受试者摄取第一个标准化剂量的鞣花单宁后72-88小时，从人受试者获得
尿液样品，
34.c)分析尿液样品中尿石素a、尿石素b和异尿石素a的存在和水平，
35.d)分别比较ua生产者和混合生产者的尿石素a、尿石素b和异尿石素a的水平与代谢型参考水平；
36.e)根据受试者水平与参考水平的比较，确定受试者是ua生产者、混合生产者还是非生产者，
37.f)向被鉴定为属于非生产者的任何人受试者施用治疗有效剂量的根据第一方面的组合物，其包含石榴果实制剂以及一种或多种人乳寡糖(hmo)；以及
38.g)任选地在至少30天，例如30天、60天或优选90天的时间段内监测所述鉴定的受试者的最终尿石素水平的增加。
39.在第四方面，本发明还涉及用于增加人肠道中尿石素、特别是最终尿石素的产生的方法，所述方法包括将如上所述根据第一方面的组合物施用于人受试者、特别是中老年(50+)人受试者。组合物可作为可摄取药物、医疗装置、膳食补充剂、食品添加剂或医疗食品或用于特殊医疗目的的食品施用。优选地，组合物中的一种或多种hmo的剂量为在500mg与10000mg之间的hmo/天，例如至少500mg hmo/天、例如至少750mg hmo/天、例如至少1000mg hmo/天、例如至少2000mg hmo/天、例如至少5000mg hmo/天。
附图说明
40.图1：石榴鞣花单宁(安石榴甙)到尿石素的肠道微生物群分解代谢，以及ua生产者(代谢型a)和混合生产者(代谢型b)之间的差异。尚未检测到瞬时中间代谢物诃子鞣质酸。最终尿石素是尿石素a、尿石素b和异尿石素a。所有其他尿石素被定义为中间尿石素(garc
í
a-villalba等人2017)。
41.图2：在三种不同底物(即3g/l hmo、1g/l石榴提取物(pg)和3g/l hmo+1g/l pg)发酵后的两个温育时间范围(0-24h和0-48h)内尿石素a的产生。还包括阴性对照(空白)。
42.图3：在三种不同底物(即3g/l hmo、1g/l石榴提取物(pg)和3g/l hmo+1g/lpg)发酵后的两个温育时间范围(0-24h和0-48h)内异尿石素a的产生。还包括阴性对照(空白)。
43.图4：在三种不同底物(即3g/l hmo、1g/l石榴提取物(pg)和3g/l hmo+1g/l pg)发酵后的两个温育时间范围(0-24h和0-48h)内尿石素c的产生。还包括阴性对照(空白)。
44.图5：在三种不同底物(即3g/l hmo、1g/l石榴提取物(pg)和3g/l hmo+1g/l pg)发酵后的两个温育时间范围(0-24h和0-48h)内9个供体产生尿石素a的平均值。还包括阴性对照(空白)。
45.定义
46.自噬：自噬是细胞内不再需要的细胞质元件的调节消化。
47.双歧因子(bifidogenic)：促进双歧杆菌在肠道中生长的物质或化合物被称为双歧因子。
48.生物发生：新的活生物体或细胞器的产生。
49.分解代谢：分子通过一组代谢途径分解成更小的单元的过程。
50.缀合物：由两种或更多种化学化合物连接而形成的化合物。
51.诱饵受体：能够有效识别和结合特定生长因子或细胞因子但在结构上不能发出信
号或激活预期受体复合物的受体。
52.鞣花单宁：鞣花单宁是一类多样化的可水解单宁，单宁是一种主要由1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖中的没食子酰基的氧化连接形成的多酚。鞣花单宁水解产生鞣花酸。在石榴果实中发现的鞣花单宁的实例是：安石榴甙a和b、石榴皮鞣素、石榴皮鞣素异构体。
53.最终尿石素：最终尿石素包含尿石素a、尿石素b和异尿石素a。这些尿石素是人肠道中鞣花单宁和/或鞣花酸分解代谢转化的可测量的最终代谢物。
54.岩藻糖基化的分子：添加了一个或多个岩藻糖单元的分子。
55.肠道微生物群：肠道微生物群是居住在胃肠道中的微生物群落。
56.稳态：由生命系统维持的稳定的内部、物理和化学条件状态。
57.人乳寡糖(hmo)：人乳寡糖，缩写为hmo，是在人母乳中发现的复合碳水化合物。hmo具有核心结构，其在还原端包含乳糖单元，该还原端可以被一个或多个β-n-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个β-乳糖-n-二糖基单元延长，并且该核心结构可以被α-l-吡喃岩藻糖基和/或α-n-乙酰基-神经胺基(唾液酸基)部分取代。在这方面，非酸性(或中性)hmo没有唾液酸基残基，而酸性hmo在其结构中具有至少一个唾液酸基残基。非酸性(或中性)hmo可以是岩藻糖基化的或非岩藻糖基化的。
58.外皮：外皮通常是各种种子和果实的干燥或膜状外壳。石榴外皮由两部分组成：提供外层角质层和纤维垫(fibrous mat)的果皮，以及附有肉质假种皮的海绵组织和内果壁的中果皮。
59.水解：通过添加水分子将分子切割成两部分的化学过程。
60.中间尿石素：中间尿石素包含尿石素m-5、尿石素m-6、尿石素m-7、尿石素c、尿石素d和尿石素e。这些尿石素是人肠道中鞣花单宁和/或鞣花酸分解代谢转化为最终代谢物尿石素a、尿石素b和异尿石素a的可测量的中间代谢物。
61.代谢物：代谢物是在代谢期间(即消化或其他生理化学过程)产生的任何物质。
62.代谢型：代谢表型，即表征个体的代谢类型。
63.微生物组：微生物组包含微生物群中的所有遗传物质，微生物群是特定生态位(例如人肠道)中微生物的全部集合。
64.线粒体：线粒体是膜结合细胞器，可作为真核细胞的能量发生器发挥功能，将氧气和营养素转化为腺苷三磷酸(atp)。线粒体还为细胞信号传导活动储存钙，产生热量并介导细胞生长和死亡。线粒体不同于其他细胞器，因为它们具有两个不同的膜和一个独特的基因组。此外，它们通过二分裂变繁殖。
65.线粒体自噬：通过自噬选择性降解功能障碍的或多余的线粒体。
66.混合生产者：除尿石素a外，还产生尿石素b和/或异尿石素a作为最终尿石素的个体。
67.非生产者：不产生任何最终代谢物尿石素a、尿石素b或异尿石素a或仅以少量(尿液中＜5μg/mg肌酐，如本文所定义的)产生的个体。
68.果皮：成熟果实的外层。
69.果渣：榨汁或榨油后果实的固体残留物。
70.石榴多酚：术语石榴多酚是指石榴果实中的安石榴甙和石榴皮鞣素，包括安石榴甙a和b、石榴皮鞣素a和b、以及石榴皮鞣素异构体。
71.益生元：膳食成分，通常是寡糖，通过调节人肠道微生物群介导的为宿主提供健康益处。
72.骨骼肌：骨骼肌是人体三种类型的肌肉中最常见的一种。大多数骨骼肌通过肌腱附着在骨骼上，并且它们产生人体各部分相互关联的所有运动。骨骼肌受躯体神经系统的自愿控制。
73.ua生产者：仅产生尿石素a作为最终尿石素的个体。
具体实施方式
74.在多个研究组进行的许多临床试验中，至少记录了三种类型的尿石素生产者或代谢型。首先，有些个体被描述为不产生最终尿石素代谢物或甚至任何类型的尿石素，或仅产生微量的尿石素。这些个体通常被称为
″
非生产者
″
。根据不同的临床试验，非生产者组占群体的5％-30％(tomas-barberan等人2014；li等人2015)。然而，关于该组中的个体缺乏排泄的尿石素的报道应被理解为一个分析问题，而不是事实上证明这些个体根本不产生尿石素(cerdf
á
等人2004；等人2014；truchado等人2012)。这在一项干预研究(li等人2015)中得到了务实的解决，在该研究中，尿液中基线尿石素a含量高达2.9μg/mg肌酐的参与者被分类为非生产者。
75.因此，如上所提及，
″
非生产者
″
在本文中被定义为在摄取含有鞣花单宁和/或鞣花酸的食物来源后，以低且可能在生理上微不足道的量产生最终尿石素a、尿石素b和异尿石素a的个体，因为声称在该组个体中完全不存在这些代谢物似乎没有科学依据。根据li等人(2015)的观察，我们将非生产者定义为尿液中最终尿石素的最大量＜5μg/mg肌酐的个体。
76.其次，有一个主要的个体组仅产生尿石素a作为最终代谢物。该专属尿石素a生产者、ua生产者组占群体的25％-80％。最后，存在一个更异质的组，该组由除尿石素b和/或异尿石素a外还产生尿石素a的个体组成。该混合生产者组占给定群体的10％-50％。可能存在其他代谢型，因为大多数代谢型研究是在可能无法代表所有文化和种族的西班牙群体中进行的。
77.对这些组的出现的直接解释是，非生产者缺乏有效产生最终尿石素或总共尿石素所需的一种或多种细菌物种或细菌组，或可替代地，这些细菌仅以不够低的水平存在。肠道微生物群的组成或功能的遗传多态性或差异也会导致个体对摄入富含鞣花单宁的食物的不同反应。在这方面，已经描述了除鞣花单宁之外的一些酚类化合物(例如木脂素和原花青素)在个体之间的高度可变的代谢素)在个体之间的高度可变的代谢等人2020)。
78.换言之，非生产者可能是一个相当异质的组，由于各种潜在的原因其最终尿石素或总共尿石素的产量是微不足道的。ua生产者似乎是一个更同质的组，其肠道微生物群包含产生尿石素a所需的所有细菌物种，但不同群体之间存在差异。最后，混合生产者组可能包含至少三个亚代谢型：尿石素a+异尿石素a的产生、尿石素a+尿石素b的产生以及尿石素a+异尿石素a+尿石素b的产生。据我们所知，直到现在还没有尝试表征这些不同的亚代谢型。
79.显然，非生产者不能从尿石素的积极健康效果中受益，或者只能在非常有限的程度上受益。因此，很明显，通过改善的线粒体功能，激活这些个体中的尿石素产生将有利于他们的整体健康。因此，我们发现可以合理地预期非生产者将受益于将其代谢型改变为产生尿石素的代谢型。
80.只有少数研究涉及代谢型之间的转化。在分娩后的第一年内，对健康的哺乳期女性的代谢型进行了四次测定(cort
é
s-mart
í
n等人2019)。结果证明，混合生产者组中20％的女性出于未知原因改变了代谢型成为ua生产者。另一项临床研究报告了在健康的超重-肥胖个体中非生产者转化为尿石素生产者的情况。在摄入石榴提取物后，观察到六分之三的非生产者的转化。这些转化的情况似乎有些不清楚，因为转化的非生产者组在基线上与专性非生产者的不同之处在于其显著更高的戈登氏杆菌水平。此外，该研究没有报告转化的非生产者的实际尿石素产生(gonz
á
lez-sarr
í
as等人2017)。
81.本发明人现已发现，与施用相应量的单独的石榴提取物相比，通过施用包含石榴果实制剂(例如果渣提取物)和一种或多种人乳寡糖(hmo)的组合物，被鉴定为非生产者的个体可以更一致地将其代谢型改变为ua生产者或混合生产者，且导致产生显著更高的尿石素。
82.在第一方面，本发明由此提供了组合物，其包含
83.a.石榴果实制剂，和
84.b.一种或多种人乳寡糖(hmo)。
85.在实施方案中，hmo选自中性hmo或酸性hmo。中性hmo可以是一种或多种岩藻糖基化的hmo或一种或多种非岩藻糖基化的hmo。
86.在施用根据第一方面的组合物后，尿液中最终尿石素代谢物中的一种或多种的量等于或高于5μg/mg肌酐使先前的非生产者成为ua生产者或混合生产者。
87.石榴果实制剂可通过本领域已知的方法获得。在一些实施方案中，石榴果实制剂可从石榴的果皮中获得。该制剂可以是从石榴果渣获得的石榴果实的提取物，即通过提取压榨的果实的残留物。提取物优选是干燥提取物，例如粉末或颗粒。本领域熟知的制备石榴果实的提取物的其他方法也在本发明的范围内。
88.特定实施方案涉及包含至少40％多酚的石榴果实的提取物。根据本发明的石榴果实的提取物优选地进一步包含至少30％石榴多酚和/或至少20％安石榴甙。
89.根据本发明的第一方面的组合物可以使得石榴果实制剂与一种或多种人乳寡糖(hmo)之间的比率(w/w)包含在5∶1-1∶10的范围内。
90.在一个实施方案中，根据第一方面的组合物包含石榴果实制剂(例如提取物)，选自中性hmo或酸性hmo的一种或多种hmo。中性hmo可以是一种或多种岩藻糖基化的hmo或一种或多种非岩藻糖基化的hmo。
91.在第二方面，本发明提供了根据第一方面的组合物，该组合物用于在治疗被鉴定为非生产者的人受试者中使用，所述鉴定包括以下步骤：
92.a)连续三天向人受试者口服施用标准化剂量的鞣花单宁，
93.b)在人受试者摄取第一个标准化剂量的鞣花单宁后72-88小时，从人受试者获得尿液样品，
94.c)分析尿液样品中尿石素a、尿石素b和异尿石素a的存在和水平，
95.d)分别比较ua生产者和混合生产者的尿石素a、尿石素b和异尿石素a的水平与代谢型参考水平；
96.e)根据受试者水平与参考水平的比较，确定受试者是ua生产者、混合生产者还是非生产者，
97.其中尿液中尿石素a、尿石素b和异尿石素a存在的总量小于5μg/mg肌酐将受试者分类为非生产者。
98.在第三方面，本发明还涉及治疗被鉴定为非生产者的人受试者的方法，所述方法包括
99.a)连续三天向人受试者口服施用标准化剂量的鞣花单宁，
100.b)在人受试者摄取第一个标准化剂量的鞣花单宁后72-88小时，从人受试者获得尿液样品，
101.c)分析尿液样品中尿石素a、尿石素b和异尿石素a的存在和水平，
102.d)比较ua生产者和混合生产者的尿石素a、尿石素b和异尿石素a的水平与代谢型参考水平；
103.e)根据受试者水平与参考水平的比较，确定受试者是ua生产者、混合生产者还是非生产者，
104.f)向被鉴定为非生产者的任何人受试者施用治疗有效剂量的根据第一方面的组合物，其包含石榴果实制剂以及一种或多种人乳寡糖(hmo)；以及
105.g)任选地在至少30天，例如30天、60天或优选90天的时间段内监测所述鉴定的受试者的一种或多种最终尿石素的产生。
106.在第二和第三方面的优选的实施方案中，对被鉴定为非生产者的个体的治疗涉及施用每日剂量的根据第一方面的组合物，该组合物含有在500-10000mg之间的hmo/天和500-5000mg之间的石榴果实制剂/天。
107.人乳寡糖(hmo)是一组复合糖或寡糖，在人乳中以高浓度存在。hmo作为选定肠道微生物的代谢底物，从而有助于婴儿肠道微生物群的发育。换言之，hmo作为益生元物质发挥功能。
108.已发现hmo通过选择性地刺激特定细菌(尤其是双歧杆菌)的生长来塑造婴儿的肠道微生物群。hmo的这些双歧因子效果是结构特异性的，并且可能会因不同个体的乳中的hmo组成而异。
109.hmo所代表的结构多样性大致可分为岩藻糖基化(中性hmo)、唾液酸化(酸性hmo)和非岩藻糖基化的中性结构。到目前为止，已经鉴定出大约200种不同的hmo。人乳寡糖的组成部分是五种单糖d-葡萄糖、d-半乳糖、n-乙酰葡糖胺、l-岩藻糖和唾液酸。乳糖形成乳寡糖的还原端。人乳中产生的hmo的量和组成在女性之间差异很大。
110.除了具有益生元效果外，hmo还充当可溶性诱饵受体，其阻止病毒、细菌或原生动物病原体与上皮细胞表面糖的附着。这种作为抗粘合剂的功能可能有助于预防肠道以及呼吸道和泌尿道的传染性疾病。
111.每日向健康成人补充高达20g剂量的2
′‑
岩藻糖基乳糖(2
′
fl)和乳糖-n-新四糖(lnnt)可改变肠道微生物群，主要影响特别地是放线菌和双歧杆菌的相对丰度大量增加，而厚壁菌门(firmicutes)和变形菌门(proteobacteria)的相对丰度减少。该调节在1-2周内发生(elison等人2016)。
112.在另一实施方案中，根据第一方面的组合物包含选自以下的一种或多种hmo：2-岩藻糖基乳糖(2
′‑
fl)、3-岩藻糖基乳糖(3-fl)、二岩藻糖基乳糖(dfl)、乳糖-n-四糖(lnt)、乳糖-n-新四糖(lnnt)、3-唾液酸基乳糖(3
′‑
sl)、6-唾液酸基乳糖(6
′‑
sl)、乳糖-n-岩藻五
糖1(lnfp-1)或其混合物。
113.优选地，一种或多种hmo包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：2
′‑
fl以及lnnt和lnt中的至少一种；2
′‑
fl和dfl中的至少一种以及lnnt和lnt中的至少一种(例如2
′‑
fl、dfl以及lnnt和lnt中的至少一种)；2
′
fl和6
′‑
sl；dfl和6
′‑
sl；2
′‑
fl、dfl和6
′‑
sl；2
′‑
fl、6
′‑
sl以及lnnt和lnt中的至少一种；或2
′‑
fl、dfl、6
′‑
sl以及lnnt和lnt中的至少一种。
114.在一些实施方案中，将根据第一方面的组合物施用于如上文讨论的为非生产者的人受试者。在一些实施方案中，将根据本发明的第一方面的组合物施用于非生产者组的人受试者随时间的推移导致所述人受试者的肠道微生物群发生改变，其能够改善鞣花单宁和/或鞣花酸分解代谢为最终尿石素中的一种或多种。
115.特定实施方案涉及如本文披露的组合物用于通过向人受试者施用持续至少30天、例如至少50天、例如至少100天、例如至少150天来增强尿石素产生的用途。优选地，施用组合物至少直到受试者产生一种或多种最终尿石素。
116.本发明组合物可配制成配制剂、优选可摄取配制剂，例如药物、膳食补充剂、食品添加剂或医疗食品或用于特殊医疗目的的食品。配制剂可包含其他成分，例如但不限于赋形剂、包衣剂、调味剂、一种或多种草本提取物或制剂、一种或多种营养素(例如一种或多种维生素和/或矿物质)。组合物可配制成片剂、丸剂、胶囊、粉末或颗粒。适用于该目的的其他配制剂对于技术人员来说将是显而易见的，并且也是可以预见的。组合物可配制成不同的配制剂，其中第一装置包含石榴果实制剂，并且第二装置包含一种或多种hmo。可替代地，组合物可配制成单一配制剂。
117.通过分析由人肠道微生物群产生的尿石素的水平，本发明人现已发现，与单独施用hmo共混物或石榴果实制剂相比，hmo共混物+石榴果实制剂在最终尿石素、尿石素a和异尿石素a，以及中间尿石素、尿石素c方面具有协同效果(参见实施例5)。
118.在第四方面，本发明由此还涉及用于增加人肠道中尿石素、特别是最终尿石素的产生的方法，所述方法包括将如上所述根据第一方面的组合物施用于人受试者、特别是中老年(50+)人受试者。组合物可作为可摄取药物、医疗装置、膳食补充剂、食品添加剂或医疗食品或用于特殊医疗目的的食品施用。优选地，组合物中的一种或多种hmo的剂量为在500mg与10000mg之间的hmo/天，例如至少500mg hmo/天、例如至少750mg hmo/天、例如至少1000mg hmo/天、例如至少2000mg hmo/天、例如至少5000mg hmo/天。
119.在实施方案中，根据第四方面的用于增加人受试者中尿石素的产生的方法包括施用根据第一方面的组合物，该组合物含有在500mg与10000mg之间的hmo/天，例如至少500mg hmo/天、例如至少750mg hmo/天、例如至少1000mg hmo/天、例如至少2000mg/天、例如至少5000mg hmo/天。
120.在另一实施方案中，根据第四方面的用于增加人受试者中尿石素的产生的方法包括施用根据第一方面的组合物，该组合物含有至少75mg安石榴甙/天，例如在75mg/天与1500mg/天之间、例如在100mg/天与1000mg/天之间，优选地至少300mg/天。
121.在另一实施方案中，与摄取根据第一方面的组合物的单独组分之一后产生的可达到的尿石素水平相比，根据第四方面的用于增加人受试者中尿石素的产生的方法导致尿石素的产生增加。
122.在优选的实施方案中，本发明涉及用于增加人受试者肠道中尿石素a、尿石素b和
异尿石素a中的一种或多种的产生的方法，所述方法包括将如上所述根据第一方面的组合物施用于人受试者、特别是中老年(50+)人受试者。
123.石榴果实制剂优选地包含至少40％多酚、至少30％石榴多酚和至少20％安石榴甙。在一些实施方案中，将组合物以如下剂量施用于人受试者：至少75mg安石榴甙/天，例如在75mg/天与1500mg/天之间、例如在100mg/天与1000mg/天之间、优选地至少300mg/天。在一些实施方案中，石榴多酚的剂量是至少100mg/天，例如在100mg/天与2000mg/天之间、例如在100mg/天与1200mg/天之间、优选地至少400mg/天。多酚的剂量是至少125mg/天，例如在125mg/天与2500mg/天之间、例如在250mg/天与1500mg/天之间、优选地至少500mg/天。
124.在优选的实施方案中，本发明的组合物可配制成试剂盒，其包含1)含有石榴提取物的片剂，2)两种hmo 2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)和乳糖-n-新四糖(lnnt)的粉末或颗粒组合，以及3)使用说明书。
125.在另一实施方案中，本发明的组合物可配制成片剂，其包含石榴提取物、2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)和乳糖-n-新四糖(lnnt)的混合物。
126.在另一实施方案中，本发明的组合物可配制成试剂盒，其包含1)含有石榴提取物的片剂，2)一种或多种选自以下的hmo的粉末或颗粒：2
′‑
fl、3-fl、dfl、lnt、lnnt、3
′‑
sl、6
′‑
sl、lnfp-1或其混合物，以及3)使用说明书。
127.在另一实施方案中，本发明的组合物可配制成片剂，其包含石榴提取物和一种或多种选自以下的hmo的混合物：2
′‑
fl、3-fl、dfl、lnt、lnnt、3
′‑
sl、6
′‑
sl、lnfp-1或其混合物。
128.在本发明的其他实施方案中，石榴提取物可以被例如核桃、树莓、草莓和黑莓等其他天然来源的鞣花单宁和/或鞣花酸替代。
129.实施例
130.实施例1
131.包含石榴提取物和hmo的组合的试剂盒的配制剂
132.开发了由石榴提取物和两种hmo 2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)和乳糖-n-新四糖(lnnt)的组合组成的试剂盒。试剂盒由片剂配制剂和粉末配制剂组成。
133.石榴的干燥乙醇提取物用于片剂配制剂。乙醇提取物基于石榴果实果渣(monteloeder s.l.公司，埃尔切，阿利坎特，西班牙)。安石榴甙的含量最少是30％。石榴提取物的每日剂量是1000mg/4片。
134.将以下片剂赋形剂添加至配制剂中：微晶纤维素、交联的羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠、二氧化硅、植物脂肪酸镁盐、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇。
135.作为其他活性成分，两种hmo 2
’‑
岩藻糖基乳糖和乳糖-n-新四糖(glycom a/s公司，赫斯霍尔姆，丹麦)的共混物用于粉末配制剂。两种hmo之间的质量比是2：1(2
’‑
fl/lnnt)。2
’‑
fl/lnnt共混物的每日剂量是5000mg/棒状包装。将以下赋形剂添加至配制剂中：硬脂酸镁(0.25质量％)。
136.实施例2
137.通过尿液样品诊断非生产者
138.非生产者(即不能在尿液中产生总量高于5μg/mg肌酐的最终尿石素的个体)显然无法从这些尿石素所赋予的与线粒体功能刺激和改善相关的健康益处中受益。非生产者通
过以下方法诊断：
139.个体连续三天服用每日剂量的含有30％安石榴甙的石榴提取物(2g/8片)。在第四天早上，收集尿液样品并通过lc-ms/ms分析对尿石素含量进行分析。
140.这允许根据将鞣花单宁代谢成最终尿石素的能力对个体进行分类。如果尿液中最终尿石素的总量小于5μg/mg肌酐，则该个体被分类为非生产者。中间尿石素的专属存在不会改变非生产者的状况。
141.实施例3
142.通过胃肠模拟模型确定对于最终尿石素产生有益的hmo
143.在m-tripleshime
tm
体外胃肠模型(prodigest公司)中研究了石榴提取物与一种或多种hmo组合对肠道微生物组的影响。m-tripleshime
tm
的典型反应器设置由一系列模拟人胃肠道不同部分的四个反应器组成。前两个反应器采用填充和抽取(fill-and-draw)原理来模拟食物摄取和消化的不同步骤，其中蠕动泵将限定量的shime饲料(140ml 3x/天)以及胰液和胆汁液(60ml 3x/天)分别添加到胃和小肠隔室中，并且在指定的间隔后排空各自的反应器。最后两个隔室是具有恒定体积和ph控制的连续搅拌反应器。选择不同血管的保留时间和ph以类似于结肠不同部分的体内条件。近端结肠设置为ph 5.4-5.6且保留时间＝12h，并且远端结肠设置为ph 6.0-6.5且保留时间＝20h。
144.将具有最少30％安石榴甙含量的石榴提取物以及2
′‑
岩藻糖基乳糖和乳糖-n-新四糖(2
′‑
fl和lnnt)的混合物(质量比为2∶1)添加到shime饲料中，浓度等于5克/天的每种成分。
145.在接种非生产者个体的粪便微生物群后，这些反应器会模拟近端结肠、横结肠和远端结肠。在对结肠不同区域的微生物群落进行为期两周的适应后，在三个结肠隔室中建立了具有代表性的微生物群落，该微生物群落在不同结肠区域的组成和功能上都有所不同。
146.此外，猪粘蛋白包括在模拟结肠的反应器中，以考虑粘液层的定植。因此，m-tripleshime
tm
允许在几周的时间段内培养腔内和粘液相关的微生物群落。
147.m-tripleshime
tm
分四个阶段运行：
148.1.稳定：在用健康的非生产者提供的新鲜粪便样品接种反应器后，两周的稳定期允许微生物群落根据当地环境条件在不同的反应器中进行区分。
149.在此期间，提供基本营养基质以支持粪便接种物中最初存在的肠道微生物群的最大多样性。
150.2.对照：在这两周期间，将标准营养素基质给予至模型中持续14天的时间段。不同反应器中的基线微生物群落组成和活性通过样品分析确定并且用作参考。
151.3.治疗-第1部分：shime系统在正常条件下运行3周，但在标准营养素基质中补充了石榴提取物(最少30％安石榴甙)和hmo。测试的hmo是2
′‑
fl和lnnt的2∶1混合物。
152.4.治疗-第2部分：shime系统在正常条件下运行3周，但在标准营养素基质中仅补充了石榴提取物(最少30％安石榴甙)。
153.5.冲洗：在这两周期间，shime系统仅用标准营养素基质再次运行。
154.定期收集每个反应器中的液体样品，并使用16s rrna测序分析产生的尿石素的组成和驻留微生物群落的组成。
155.发酵系统的结果显示，最终尿石素、尤其是尿石素a，是在用石榴提取物以及2
′‑
fl和lnnt(2∶1)的hmo混合物治疗3周后产生的。此外，在随后的3周仅用石榴提取物治疗期间，这种效果得以维持，这表明肠道微生物群已达到最终尿石素产生的平衡。
156.微生物群落的剖析表明，在第一个治疗期期间，结肠区域远端部分的阿克曼氏菌的丰度增加。近端部分几乎没有发生这种变化。在第二个治疗期效果得以维持。
157.这项体外研究表明，用石榴提取物和hmo共混物2
′‑
fl和lnnt(2∶1)进料m-tripleshime
tm
激活了源自非生产者的肠道微生物群中最终尿石素的产生。此外，将石榴提取物作为唯一补充剂添加到营养素基质中，效果在3周内得以维持。因此，通过用石榴提取物以及2
′‑
fl和lnnt的hmo共混物进行治疗，可以将非生产者的肠道微生物群改变为尿石素生产者的肠道微生物群。
158.实施例4
159.用富含鞣花单宁的食物来源和hmo共混物的组合治疗非生产者
160.以下干预研究被设计用于研究富含鞣花单宁的食物来源和hmo共混物的组合是否能够激活非生产者的肠道微生物群产生一种或多种最终尿石素。
161.该临床研究是一个两部分研究。在研究的第一部分，确定了一组潜在研究参与者的尿石素代谢型。只有非生产者被招募到研究的第二部分。在研究的第二部分，确定了每个研究参与者为期3周每日服用石榴提取物对尿石素产生的影响，然后对以下进行比较：
162.1)连续每日服用石榴提取物对尿石素产生的影响，以及
163.2)每日服用石榴提取物加hmo共混物的组合对尿石素产生的影响。
164.hmo共混物的剂量和组成基于初步体外研究。
165.第1部分代谢型鉴定
166.这项代谢型鉴定研究招募了六十名健康志愿者(30名男性和30名女性)。排除标准是：胃肠疾病或任何慢性疾病的病史，减肥饮食，持续用膳食补充剂进行治疗，研究前长达8周摄入抗生素、益生元、益生菌或药物，怀孕或哺乳。在参与研究前，所有受试者都填写了关于他们饮食习惯的问卷。在研究前1周和研究期间(第1部分)，禁止摄入例如浆果(草莓、树莓、黑莓等和衍生食品例如果酱)、石榴、巧克力、坚果和葡萄酒等含有鞣花单宁的来源。
167.研究参与者连续三天服用每日剂量的含有40％安石榴甙的石榴提取物(2g/8片)。在第四天早上，收集尿液样品并通过lc-ms/ms分析对尿石素含量进行分析。
168.研究参与者被分类为ua生产者、混合生产者或非生产者。
169.只有非生产者被招募到研究的第二部分。
170.第2部分确定石榴提取物相比于石榴提取物+hmo共混物对非生产者的尿石素产生的影响
171.第1部分的非生产者随机接受以下两种治疗：
172.1.用石榴提取物治疗三周，然后通过尿液测试检测尿石素产生，然后再用石榴提取物(pe+pe)治疗三周。
173.2.用石榴提取物治疗三周，然后通过尿液测试检测尿石素产生，然后用石榴提取物以及2
′‑
fl和lnnt的hmo共混物(pe+hmo)治疗三周。
174.石榴的干燥乙醇提取物用于片剂配制剂。乙醇提取物基于石榴果实果渣(monteloeder s.l.公司，埃尔切，阿利坎特，西班牙)。安石榴甙的含量是40％。石榴提取物
的每日剂量是1000mg/4片。
175.两种hmo 2
′‑
岩藻糖基乳糖和乳糖-n-新四糖(2
′‑
fl和lnnt)的共混物(质量比为2∶1)作为粉末施用。共混物的每日剂量是5000mg。
176.在治疗3周和6周后，研究参与者连续三天服用每日剂量的含有40％安石榴甙的石榴提取物(2g/8片)。在第四天早上，收集尿液样品并通过lc-ms/ms分析对尿石素含量进行分析。
177.在研究期的第3周和第6周(即施用石榴提取物和收集尿液前一周)，禁止摄入例如浆果(草莓、树莓、黑莓等和衍生食品例如果酱)、石榴、巧克力、坚果和葡萄酒等含有鞣花单宁的来源。
178.在治疗6周后，在一些参与者的尿液样品中测量了最终尿石素。与pe+pe组相比，pe+hmo组的非生产者显著更多地成为生产者(p＜0.05)。因此，石榴提取物加hmo的组合比单独的石榴提取物更能激活非生产者中最终尿石素的产生这一假设得到了证实。
179.研究期间未报告副作用。
180.实施例5
181.用富含鞣花单宁的食物来源和hmo共混物的组合体外刺激尿石素产生
182.以下研究被设计用于在短期体外模拟中评估hmo共混物、石榴提取物(pg)和两者的组合对九名随机选择的人供体的肠道微生物群产生尿石素的影响。prodigest公司(https：//www.prodigest.eu/en)的短期结肠模拟模型用于研究测试产品与肠道微生物组之间的相互作用。
183.所有供体年龄在50与70岁之间，身体健康，在实验前6个月没有使用抗生素的历史。收集粪便材料，并且制备粪便悬浮液并将其与冷冻保护剂混合。将获得的悬浮液等分，快速冷冻，然后保存在-80℃。就在实验前，粪便样品被解冻并立即添加到反应器中。
184.将反应器与含有结肠基础营养素的无糖(sugar-depleted)营养培养基一起温育48小时(37℃，以90rpm振荡，厌氧条件)。在0h(基线)、24h后和48h后(随访)收集来自反应器的样品。每个粪便样品用于4种不同的治疗：
185.·
对照治疗(空白)：仅将营养培养基添加至反应器中。
186.·
人乳寡糖(hmo)治疗：在基线将3g/l的hmo共混物添加至反应器中。
187.·
石榴提取物(pg)治疗：在基线将1g/l添加至反应器中。
188.·
石榴提取物+hmo(pg+hmo)治疗：在基线将1g/l的pg和3g/l的hmo共混物添加至反应器中。
189.温育以单次重复进行，产生36次独立温育。
190.石榴提取物是基于石榴果实果渣(monteloeder s.l.公司，埃尔切，阿利坎特，西班牙)的乙醇提取物。安石榴甙的含量大约是40％。
191.hmo共混物是由2
’‑
岩藻糖基乳糖(2’fl)和乳糖-n-新四糖(lnnt)(质量比为4∶1)(2’fl：lnnt)组成的粉末。hmo共混物由丹麦赫斯霍尔姆glycom a/s公司提供。
192.最终尿石素(尿石素a、异尿石素a和尿石素b)的浓度在0h、24h和48h进行测量。此外，中间尿石素(尿石素c和尿石素d)的浓度在0h、24h和48h进行测量。
193.与hmo治疗或pg治疗相比，观察到hmo+pg治疗分别在供体1、2和3的尿石素a产生方面具有协同效果，而在供体6和8中的产生程度较小(图2)。
194.与hmo治疗或pg治疗相比，观察到hmo+pg治疗分别在供体1和5的异尿石素a产生方面具有协同效果，而在供体6和8中的产生程度较小(图3)。
195.与hmo治疗或pg治疗相比，观察到hmo+pg治疗分别在供体5和7的尿石素c产生方面具有协同效果，而在供体1中的产生程度较小(图4)。
196.未观察到hmo+pg治疗在尿石素d产生方面具有协同效果。
197.在任何样品中均未检测到尿石素b。这可能是由于该化合物在最终尿石素的代谢途径中合成较晚(图1)。
198.因此，总体而言，hmo+pg治疗的组合以协同方式在源自9个随机分配的供体中的7个(即除供体4和9之外的所有供体)的粪便样品温育中改善了尿石素产生。这种效果在尿石素a的产生中最明显。图5呈现了9个供体中尿石素a产生的平均数据。
199.值得注意的是，在48h体外研究期间，无法预期对非生产者(可能是供体7和9)的任何刺激作用，因为足够量的用于鞣花单宁/鞣花酸分解代谢的相关细菌可能需要数周才能增殖到足够的水平。
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