2-[2-甲基氮杂环丁烷-1-基]-4-苯基-6-(三氟甲基)-嘧啶化合物
[0001]
本发明涉及新的己酮糖激酶(khk)抑制剂化合物、包含所述化合物的药物组合物以及所述化合物用于治疗某些病症的用途，所述病症诸如2型糖尿病(t2dm)、心力衰竭、糖尿病性肾脏疾病和非酒精性脂肪性肝炎(nash)。
[0002]
khk，也被称作果糖激酶，是参与果糖代谢的限速酶。它催化果糖向果糖-1-磷酸(f1p)的磷酸化，引起细胞atp水平的伴随消耗。与葡萄糖相反，果糖代谢缺乏反馈抑制，并且它触发参与例如脂肪生成、糖原异生和氧化磷酸化的下游中间产物的累积(hannou, s.a., 等人；j. clin. invest., 128(2), 544-555, 2018)。这具有与许多严重代谢障碍有关的负面代谢后果。
[0003]
khk以两种交替拼接的异构体存在，包括区别在于外显子3的khk-c和khk-a。khk-c主要在肝、肾和肠中表达，而khk-a更普遍存在。两种异构体都缺乏的小鼠完全避免了果糖诱导的代谢综合征。但是，不利的代谢效应在仅缺乏khk-a的小鼠中加重(ishimoto t, 等人；proc. natl. acad. sci. usa, 109(11), 4320-4325, 2012)。
[0004]
几项流行病学和实验研究已经报告，增加的果糖消耗、和更准确地说增加的果糖代谢可能在某些障碍（包括代谢综合征）的发展中、和特别是在t2dm (softic等人；j. clin. invest., 127(11), 4059-4074, 2017)、心力衰竭(mirtschink, p., 等人；eur. heart j., 39, 2497-2505, 2018)、糖尿病性肾脏疾病(cirillo, p., 等人；j. am. soc. nephrol., 20, 545-553, 2009)以及nafld/nash (vos, m.b., 等人；hepatology, 57, 2525-2531, 2013)的发展中起重要作用。预期khk的靶向抑制将限制果糖代谢并为许多代谢障碍提供有效治疗选项。
[0005]
us 2017/0183328 a1公开了被取代的3-氮杂双环[3.1.0]己烷类作为khk抑制剂。最近公布的数据表明，施用6周的己酮糖激酶抑制剂pf-06835919降低全肝脂肪，如在具有非酒精性脂肪肝病的对象中通过核磁共振成像-质子密度脂肪级分所测量的(j. hepatology. easl international liver congress abstracts, supplement n
°
1s第70卷, 2019年4月)。
[0006]
需要用于代谢综合征和相关适应症(包括t2dm、心力衰竭、糖尿病性肾脏疾病和nash)的替代治疗。特别地，需要作为khk的强效抑制剂的化合物。需要具有有利性质（例如，良好的口服生物利用度以支持每日给药）的khk抑制剂化合物。
[0007]
因此，在一个实施方案中，本发明提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐：
其中r是-oh、-nhc(ch2oh)3或。
[0008]
在一个特定实施方案中，当r是时，-oh基团相对于彼此处于顺式构型。
[0009]
在一个特定实施方案中，所述化合物具有式ia：或其药学上可接受的盐。
[0010]
在一个实施方案中，式i的化合物是：或其药学上可接受的盐。
[0011]
在一个实施方案中，式i的化合物是：或其药学上可接受的盐。
[0012]
在一个实施方案中，式i的化合物是：或其药学上可接受的盐。
[0013]
式i包括式ia和ib，并且在下文对式i的提及，例如在治疗方法和治疗用途中，也解读为对这些子式中的每个和全部的提及。
[0014]
在一个实施方案中，本发明也提供了一种在需要这样的治疗的患者中治疗t2dm的方法，包括给所述患者施用有效量的式i的化合物或其药学上可接受的盐。
[0015]
在一个实施方案中，本发明也提供了一种在需要这样的治疗的患者中治疗心力衰竭的方法，包括给所述患者施用有效量的式i的化合物或其药学上可接受的盐。
[0016]
在一个实施方案中，本发明也提供了一种在需要这样的治疗的患者中治疗糖尿病性肾脏疾病的方法，包括给所述患者施用有效量的式i的化合物或其药学上可接受的盐。
[0017]
在一个实施方案中，本发明也提供了一种在需要这样的治疗的患者中治疗nash的方法，包括给所述患者施用有效量的式i的化合物或其药学上可接受的盐。
[0018]
在一个实施方案中，本发明进一步提供了一种在需要这样的治疗的患者中治疗疾病的方法，所述疾病选自：代谢综合征；nafld、肥胖、糖尿病并发症（例如糖尿病性视网膜病变）、心血管疾病、冠状动脉疾病、慢性肾脏疾病和血脂异常，包括给所述患者施用有效量的式i的化合物或其药学上可接受的盐。
[0019]
此外，在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗中的式i的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗t2dm的式i的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗心力衰竭的式i的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗糖尿病性肾脏疾病的式i的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗nash的式i的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，本发明还提供了用于治疗代谢综合征、nafld、肥胖、糖尿病并发症（例如糖尿病性视网膜病变）、心血管疾病、冠状动脉疾病、慢性肾脏疾病、或血脂异常的式i的化合物或其药学上可接受的盐。
[0020]
此外，在一个实施方案中，本发明提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗t2dm。在一个实施方案中，本发明提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗心力衰竭。在一个实施方案中，本发明提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗糖尿病性肾脏疾病。在一个实施方案中，本发明提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗nash。在一个实施方案中，本发明还提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途，所述药物用于治疗代谢综合征、nafld、肥胖、糖尿病并发症（例如糖尿病性视网膜病变）、心血管疾病、冠状动脉疾病、慢性肾脏疾病或血脂异常。
[0021]
在一个实施方案中，本发明进一步提供了药物组合物，其包含式i的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方案中，本发明进一步提供了一种用于制备药物组合物的方法，包括将式i的化合物或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。
[0022]
本文中使用的术语“治疗”包括抑制、减慢、停止或逆转现有症状或障碍的进展或严重程度。
[0023]
本文中使用的术语“患者”是指哺乳动物。优选地，患者是人。
[0024]
本文中使用的术语“有效量”是指本发明的化合物或其药学上可接受的盐的量或
剂量，其在向患者单个或多个剂量施用后，在诊断或治疗的患者中提供期望的效果。
[0025]
本领域技术人员通过使用已知技术并通过观察在类似情况下获得的结果可以确定有效量。在为患者确定有效量时，考虑许多因素，包括、但不限于：患者的物种；它的大小、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病或障碍；疾病或障碍的程度或牵连或严重程度；个体患者的应答；施用的特定化合物；施用模式；施用的制剂的生物利用度特征；选择的给药方案；伴随药物的使用；和其它有关的情况。本发明的化合物在约0.1至约15 mg/kg体重的范围内的每日剂量是有效的。
[0026]
将本发明的化合物配制成药物组合物，其通过使所述化合物可生物利用的任何途径施用。优选地，这样的组合物用于口服施用。这样的药物组合物及其制备方法是本领域众所周知的(参见，例如，remington, j. p.,
ꢀ“
remington: the science and practice of pharmacy”, l.v. allen, 编, 第22版, pharmaceutical press, 2012)。
[0027]
式i的化合物及其药学上可接受的盐可以用于本发明的治疗方法和治疗用途中，其中某些构型是优选的。应该理解，以下优选既适用于本发明的治疗方法、治疗用途，也适用于本发明的化合物。
[0028]
式i的化合物包括：物包括：及其药学上可接受的盐。
[0029]
尽管本发明考虑所有单独对映异构体和非对映异构体以及所述化合物的混合物，包括外消旋体，但是式ia的化合物及其药学上可接受的盐是特别优选的。
[0030]
本领域普通技术人员在式i的化合物的合成中的任何方便点，通过方法诸如选择性结晶技术、手性色谱(参见例如，j. jacques, 等人,
ꢀ“
enantiomers, racemates, and resolutions”, john wiley and sons, inc., 1981，以及e.l. eliel和s.h. wilen,
ꢀ“
stereochemistry of organic compounds”, wiley-interscience, 1994)或超临界流体色谱(sfc) (参见例如，t. a. berger；“supercritical fluid chromatography primer,”agilent technologies, 2015年7月)，可以分离或拆分单独对映异构体。
[0031]
式i的化合物的药学上可接受的盐可以如下形成：例如，通过在本领域众所周知的标准条件下在合适的溶剂中使式i的化合物的适当游离碱与适当的药学上可接受的酸反应(参见，例如，bastin, r.j., 等人；org. process. res. dev., 4, 427-435, 2000和berge, s.m., 等人；j. pharm. sci., 66, 1-19, 1977)。
[0032]
通过本领域普通技术人员已知的多种程序（其中的一些在以下方案、制备和实施例中进行解释），可以制备式i的化合物或其盐。通过本领域众所周知的常规方法，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研磨和结晶，可以回收以下方案中每个步骤的产物。在以下方案中，除非另外说明，否则所有取代基如前面所定义。试剂和起始材料是本领域普通技术人员容易得到的。在不限制本发明范围的情况下，提供以下方案、制备和实施例以进一步说明本发明。另外，本领域普通技术人员理解，通过使用可以由本领域技术人员制备的具有相应的期望的立体化学构型的起始材料或中间体，可以制备式i的化合物。
[0033]
某些缩写定义如下：“acn”是指乙腈；“cdmt”是指2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪；“dcm”是指二氯甲烷；“dipea”是指二异丙基乙胺；“dmem”是指dulbecco氏改良的伊格尔培养基；“dmf”是指n,n-二甲基甲酰胺；“dmso”是指二甲亚砜；“elsd”是指蒸发光散射检测器；“es/ms”是指电喷雾质谱；“etoac”是指乙酸乙酯；“etoh”是指乙醇；“fbs”是指胎牛血清；“h”是指小时；“hatu”是指1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐；“hplc”是指高效液相色谱；“me”是指甲基；“meoh”是指甲醇；“mtbe”是指甲基-叔丁基醚；“min”是指分钟；“m/z”是指质荷比；“ph”是指苯基；“rbf”是指圆底烧瓶；“rt”是指室温；“scx”是指选择性的阳离子交换；“se”是指标准误差；“sfc”是指超临界流体色谱；“tbtu”是指2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐；“tfa”是指三氟乙酸；“thf”是指四氢呋喃。
[0034]
方案1方案1描绘了式i的化合物的一般制备。步骤1和2以一锅法完成。2,4-二氯-6-(三氟甲基)嘧啶(1)首先经历用钯催化剂、碱(诸如碳酸钠)水溶液和(4-甲氧基羰基苯基)硼酸(2)的室温suzuki偶联，以提供氯嘧啶中间体(3)。向来自步骤1的反应混合物中加入2-甲基氮杂环丁烷(4)或其盐，然后将反应物加热以提供酯中间体(5) (步骤2)。在步骤3中，将酯中间体(5)在升高的温度用氢氧化钠水解以提供实施例1的酸化合物。最后，通过在步骤4中将实施例1的酸化合物与适当的胺偶联，制备式i的替代化合物。使用在dmf、etoac/dmf或acn中的hatu；在acn中的tbtu；或在thf中的cdmt，可以实现步骤4。
[0035]
制备和实施例下述制备和实施例进一步说明本发明，且代表本发明的化合物的典型合成。试剂和起始材料是容易得到的，或可以由本领域普通技术人员容易地合成。应当理解，所述制备
和实施例通过示例而不是限制的方式阐述，并且本领域普通技术人员可以做出多种修改。
[0036]
在agilent
®
hp1100液相色谱系统上进行lc-es/ms。在与hplc接口的mass selective detector四极质谱仪上进行电喷雾质谱测量(以正和/或负模式获取)，所述hplc可以具有或可以不具有elsd。lc-ms条件(低ph)：柱：phenomenex
®
gemini
®
nx c18 2.0
×
50 mm 3.0 μm，110
å
；梯度：在1.5 min内5-95% b，然后95% b保持0.5 min 柱温：50℃
±
10℃；流速：1.2 ml/min；1 μl注射体积；溶剂a：含有0.1% hcooh的去离子水；溶剂b：含有0.1% 甲酸的acn；波长200-400 nm和212-216 nm。如果hplc配备elsd，则设置为45℃蒸发器温度、40℃雾化器温度和1.6 slm气体流速。替代性lc-ms条件(高ph)：柱：waters xbridge
®
c18柱2.1
×
50 mm，3.5 μm；梯度：在1.5 min内5-95% b，然后95% b保持0.50 min；柱温：50℃
±
10℃；流速：1.2 ml/min；1 μl注射体积；溶剂a：10 mm nh4hco
3 ph 9；溶剂b：acn；波长：200-400 nm和212-216nm；如果具有elsd：45℃蒸发器温度、40℃雾化器温度和1.60 slm气体流速。
[0037]
制备1(2s)-1-二苯甲基-2-甲基-氮杂环丁烷[(1r,4s)-7,7-二甲基-2-氧代-降冰片烷-1-基]甲磺酸盐组装一个具有加料漏斗、氮入口和温度计适配器的2000 ml 3-颈rbf。用氮气净化容器，并加入(3r)-丁烷-1,3-二醇(25 g, 277.4 mmol)、dipea (127 ml, 731 mmol)和acn (556 ml)。冷却至-30℃。经3 h逐滴加入三氟甲磺酸酐(101 ml, 601 mmol)，使得内部温度维持在-35至-30℃。加入结束以后，在-35至-30℃搅拌10 min。经5 min逐滴加入三氟甲磺酸酐(1.9 ml, 11 mmol)，使得内部温度维持在-35至-30℃。加入结束以后，在-35至-30℃搅拌10 min。经15 min逐滴加入dipea (127 ml, 731 mmol)，使得内部温度维持在-35至-30℃。加入结束以后，在-35至-30℃搅拌10 min。在氮气下在单独烧瓶中，将氨基二苯基甲烷(48.0 ml, 270 mmol)溶解在acn (49 ml, 935 mmol)中并将得到的溶液转移至加料漏斗。将胺溶液经40 min逐滴加入冷的三氟甲磺酸酯，使得内部温度维持在-20至-35℃。加入结束以后，在-35至-30℃搅拌30 min。将反应物转移至水浴，并使它经30 min缓慢地温热。移去浴并使反应物经30 min温热至室温。将容器转移至加热套，并将反应物温热至45℃保持30 min，然后冷却至室温。将所得混合物倒入1200 ml的水中，并用甲苯(400 ml
×
3)萃取。合并萃取物，用水、饱和nacl水溶液洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并在旋转蒸发器上浓缩。将物质在真空下干燥过夜。将残余物溶解在dcm (400 ml)中。在烧结玻璃漏斗上制备硅胶垫，并用1:1庚烷/etoac平衡它。将产物溶液加载到硅胶垫上，并用1600 ml的1:1庚烷/etoac洗涤。浓缩滤液以提供红色油。将所述油溶解在meoh (250 ml)中，并将烧瓶置于水浴(~10℃)中。逐份加入l(-)-樟脑磺酸(61.6 g, 265 mmol)，保持内部温度低于20℃。将所得混合物搅拌15 min，然后在旋转蒸发器上浓缩以提供棕色泡沫。将所述泡沫在真空泵上干燥2 h。将所述泡沫溶解在130 ml的dcm中。将加料漏斗连接至烧瓶。使用漏斗向搅拌溶液中缓慢地加入1100 ml的etoac。将所得混合物转移至4000 ml烧杯，并向大气敞开搅拌过夜。
在冰浴中冷却烧杯10 min。通过真空过滤在烧结玻璃漏斗中收集沉淀，用最少量的冰冷的etoac洗涤。在玻璃料上干燥所述固体2 h。将所得白色固体溶解在最少量的dcm中，转移至2000 ml烧杯，然后用etoac缓慢稀释，直到澄清溶液开始变浑浊。向大气敞开搅拌所述悬浮液4 h。使用烧结玻璃漏斗通过真空过滤收集固体，并在玻璃料上干燥过夜以提供作为白色固体的标题化合物(111.8 g, 238.06 mmol, 86%收率)。1h nmr (400 mhz, d6-dmso)：10.54-10.47 (m, 1h), 7.61 (d, j= 7.3 hz, 5h), 7.47-7.37 (m, 7h), 5.85 (d, j= 10.3 hz, 1h), 4.68-4.61 (m, 1h), 3.91-3.83 (m, 2h), 3.37 (s, 8h), 2.99 (d, j= 14.6 hz, 1h), 2.77-2.68 (m, 1h), 2.51-2.44 (m, 4h), 2.30-2.16 (m, 2h), 1.91-1.81 (m, 2h), 1.42-1.28 (m, 3h), 1.08 (s, 3h), 1.01 (d, j= 6.6 hz, 3h), 0.77 (s, 4h)；》98% ee [hplc: chiralcel oj (10 cm x 4.6 mm, 5 μm), 5 ml/min, 40℃等度10% etoh (0.2% i
prnh2)/co2]。
[0038]
制备2[(1r,4s)-7,7-二甲基-2-氧代-降冰片烷-1-基]甲磺酸(2s)-2-甲基氮杂环丁烷-1-鎓盐向2250 ml parr容器中加入20重量%的碳载pd(oh)
2 (6.62 g)。用氮气净化瓶子并加入250 ml的meoh。向得到的悬浮液中缓慢地加入溶解在250 ml的meoh中的(2s)-1-二苯甲基-2-甲基-氮杂环丁烷[(1r,4s)-7,7-二甲基-2-氧代-降冰片烷-1-基]甲磺酸盐(111 g, 236 mmol)。密封容器。用氮气、随后用氢气净化，并增压至60 psi。在室温在parr振荡器设备中剧烈摇动反应容器15h。用氮气净化容器，然后通过celite
®
垫过滤反应混合物，用meoh洗涤。浓缩滤液以提供白色固体，并在真空下干燥。将固体悬浮在780 ml的1:1 mtbe/etoac中，并将所述混合物加热至65℃保持20 h，然后冷却至室温并搅拌过夜。通过过滤收集固体。将固体悬浮在380 ml的mtbe中，并在室温搅拌24 h。通过过滤收集白色固体以提供标题化合物(41.5 g, 136.78 mmol, 58%收率)。1h nmr (400 mhz, d6-dmso): 8.68-8.55 (m, 1h), 4.51-4.42 (m, 1h), 3.91-3.75 (m, 1h), 3.36 (s, 3h), 2.91 (d, j= 14.6 hz, 1h), 2.69-2.61 (m, 1h), 2.52-2.46 (m, 2h), 2.28-2.22 (m, 1h), 2.17-2.10 (m, 1h), 1.96 (t, j= 4.5 hz, 1h), 1.89-1.79 (m, 1h), 1.43 (d, j= 6.7 hz, 2h), 1.36-1.26 (m, 1h), 1.05 (s, 2h), 0.75 (s, 2h)。
[0039]
制备34-{2-[(2s)-2-甲基氮杂环丁烷-1-基]-6-(三氟甲基)嘧啶-4-基}苯甲酸甲酯
在氮气下在2 l 3-颈rbf中，合并2,4-二氯-6-(三氟甲基)嘧啶(25.00 g, 112.9 mmol)、(4-甲氧基羰基苯基)硼酸(21.34 g, 118.6 mmol)、碳酸钠水溶液(2 m, 170 ml, 340 mmol)和1,4-二氧杂环己烷(500 ml)。在室温搅拌并用氮气在混合物中鼓泡10 min。逐份加入双(三苯基膦)二氯化钯(ii) (1.585 g, 2.258 mmol)。将混合物在室温搅拌23 h。向悬浮液中加入[(1r,4s)-7,7-二甲基-2-氧代-降冰片烷-1-基]甲磺酸(2s)-2-甲基氮杂环丁烷-1-鎓盐(35.97 g, 118.6 mmol)。将悬浮液加热至75℃保持1 h。移去热源并通过加料漏斗经10 min加入水(500 ml)。将混合物冷却至室温并通过过滤分离黄色固体。在真空干燥箱中在45℃干燥物质以提供作为黄色固体的标题化合物(41.75 g, 定量收率)。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.35-8.32 (m, 2h), 8.11-8.08 (m, 2h), 7.66 (s, 1h), 4.64-4.57 (m, 1h), 4.16-4.06 (m, 2h), 3.90 (s, 3h), 2.52-2.45 (m, 1h), 2.06-2.00 (m, 1h), 1.54 (d, j= 4.2 hz, 3h)；es/ms m/z 352 (m+h)。
[0040]
实施例14-{2-[(2s)-2-甲基氮杂环丁烷-1-基]-6-(三氟甲基)嘧啶-4-基}苯甲酸在氮气下在2 l rbf中，小心地合并4-{2-[(2s)-2-甲基氮杂环丁烷-1-基]-6-(三氟甲基)嘧啶-4-基}苯甲酸甲酯(41.80 g, 115.4 mmol)、氢氧化钠水溶液(2 m, 173.1 ml, 346 mmol)、meoh (418 ml)和thf (209 ml)。将所得混合物缓慢地温热至75℃并搅拌2 h，然后冷却至室温。在真空中除去有机溶剂。加入水(400 ml)和etoac (300 ml)。使用真空过滤通过celite
®
垫过滤所得混合物。分离有机层。将碱性水层用更多的etoac (300 ml)洗涤。使用2 m hcl将水层酸化至ph = 5。用etoac (3
×
300 ml)萃取。合并有机萃取物，经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩。在真空下干燥残余物，然后将它溶解在thf (750 ml)中，并加入siliamets
®
thiol (si-thiol)树脂(2.5 g)。将所得混合物在40℃搅拌6 h，然后冷却至室温并过滤。浓缩滤液以提供固体。将其与从4-{2-[(2s)-2-甲基氮杂环丁烷-1-基]-6-(三氟甲基)嘧啶-4-基}苯甲酸甲酯(7.95 g, 21.5 mmol)开始使用与上文所述基本上相同的程序制备的物质合并。将合并的物质在庚烷: etoac的10:1 (v/v)溶液中搅拌1 h。通过过滤收集固体，用庚烷洗涤，并在真空下干燥以提供标题化合物(34.8 g, 75%)。es/ms m/z 338 (m+h), 336 (m-h)。
[0041]
实施例2[(3r,4s)-3,4-二羟基吡咯烷-1-基]-[4-{2-[(2s)-2-甲基氮杂环丁烷-1-基]-6-(三氟甲基)嘧啶-4-基}苯基]甲酮
mmol)和acn(16ml)，然后轻轻加入dipea(2.25g,3.01ml,17.4mmol)。将混合物在室温搅拌5min，然后加入hatu(2.64g,6.95mmol)。搅拌25min以后，在减压下除去所有挥发物。将残余物用乙酸异丙酯(20ml)稀释并用hcl水溶液(1m、20ml
×
2)、水(20ml)、碳酸钠水溶液(1m、20ml)和水(20ml)萃取。将有机层用mgso4干燥，过滤并在减压下除去所有挥发物。将该物质溶解在methf(18ml)中并用naoh水溶液(1m,18ml)洗涤。将有机层用mgso4干燥，过滤并在减压下除去所有挥发物以提供作为黄色泡沫的粗制标题化合物(1.53g)。
[0045]
偶联方法e：在氮气氛下给rbf装入4-{2-[(2s)-2-甲基氮杂环丁烷-1-基]-6-(三氟甲基)嘧啶-4-基}苯甲酸(8.61g,25.0mmol)、(3r,4s)-吡咯烷-3,4-二醇盐酸盐(3.8g,26.2mmol)和acn(71ml)。缓慢地加入dipea(13ml,75mmol)。在搅拌所得混合物的同时，加入tbtu(9.0g,27.5mmol)。搅拌6min。在真空中除去所有挥发物。将残余物溶解在2-甲基四氢呋喃(86ml)中并用盐酸(1m,86ml
×
2)、氢氧化钠(1m,86ml
×
2)和氯化锂(10质量%,86ml)洗涤。将有机相经mgso4干燥，过滤，并浓缩。将残余物溶解在etoac(43ml)中并浓缩至干燥两次以提供作为黄色泡沫的粗制标题化合物(10.3g)。
[0046]
使用如在表1中所示的起始材料量和偶联方法制备分开批次的粗制标题化合物。在表1中提及的起始材料是4-{2-[(2s)-2-甲基氮杂环丁烷-1-基]-6-(三氟甲基)嘧啶-4-基}苯甲酸。
[0047]
表1
粗制产物批号使用的起始材料的量(g)使用的起始材料的量(mmol)使用的偶联方法10.2020.570c20.1040.300b32.106.10b41.022.95a51.032.99c61029.1a72.025.88a81.995.79d90.1040.302e102.005.80e112.045.92e121.032.99d131.032.99a141.053.06e158.6125.0e
[0048]
步骤2-纯化纯化方法a：合并批次1-6并使用0-3%的在etoac中的etoh的梯度通过硅胶色谱纯化合并的粗制产物以提供黄色泡沫。将该物质溶解在etoac(300ml)中并用在水(372ml)中的氯化锂(10质量%)洗涤3次。将有机相经mgso4干燥，过滤并在真空中浓缩以提供黄色固体。将固体
在庚烷(177 ml)中研磨2 h，过滤，风干，然后在真空下干燥过夜以提供作为黄色固体的标题化合物(14.65 g，由偶联和纯化步骤的总收率82% )。
[0049]
纯化方法b：合并批次7-15并使用0-10%的在etoac中的etoh的梯度通过硅胶色谱纯化合并的粗制产物以提供黄色泡沫。将该物质在5% 丙酮/庚烷混合物(165 ml)中在60℃研磨30 min，然后在室温研磨6 h。在减压下过滤，在空气流下干燥30 min，然后在高真空下干燥以提供作为结晶性白色粉末的标题化合物(15.8 g，由偶联和纯化步骤的总收率64% )。
[0050]
实施例3n-[2-羟基-1,1-双(羟基甲基)乙基]-4-{2-[(2s)-2-甲基氮杂环丁烷-1-基]-6-(三氟甲基)嘧啶-4-基}苯甲酰胺在小瓶中将4{2-[(2s)-2-甲基氮杂环丁烷-1-基]-6-(三氟甲基)嘧啶-4-基}苯甲酸(700 mg, 2.08 mmol)溶解在dmf (10 ml)中。加入2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇(280 mg, 2.31 mmol)、hatu (1.21 g, 1.21 g)和dipea (1.1 ml, 6.3 mmol)。将小瓶密封并在室温搅拌1 h。将混合物用etoac稀释，用水洗涤两次，然后用饱和nacl水溶液洗涤。将有机层经na2so4干燥，过滤并浓缩。将得到的物质如下纯化：使用0-10% 的在ch2cl2中的meoh的梯度的硅胶色谱，随后是使用10-100% 的在水(含有0.1% tfa)中的acn (含有0.1% tfa)的梯度的反相色谱，以提供标题化合物(287 mg, 31%)。es/ms m/z 441 (m+h), 439 (m-h)。
[0051]
测定对人khk-c和人khk-a的khk酶活性测定使用测量f1p产生的酶测定，可以测量对khk c或a活性抑制的固有效力。在dmso中准备化合物，并以10点浓度曲线进行试验，以在96孔板中产生范围为20 μm至1.02 nm的化合物的3倍系列稀释物。在测定缓冲液[50 mm4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸(hepes), 10 mm氯化钾, 100 mm氯化镁, 2 mm三(2-羧基乙基)膦(tcep), 0.01% 正辛基葡萄糖苷]中准备酶，并在室温与化合物一起温育15 min。反应以100 μl的体积进行，其中含有果糖(对于khk-c测定为250 μm，对于khk-a测定为1.25mm)和atp (对于两种异构体均为150 μm)的底物浓度；将其在室温进一步温育20 min。然后通过添加终止缓冲液停止反应，终止缓冲液包含0.2% 甲酸和1 μg/ml 13c6-果糖-6-磷酸(
13c6-f6p)内标。将板在-20℃储存直到rapidfire ms分析。
[0052]
用于f1p定量的rapidfire ms分析将具有三个hplc四元泵的agilent 300 rapidfire自动萃取系统(agilent, santa clara, ca)偶联至配备电喷雾电离(esi)接口源的agilent 6495三重四极质谱仪(agilent technologies, santa clara, ca)。所述rapidfire mass spec系统配备可重复
使用的rapidfirec18(c型)固相萃取(spe)筒(g9205a)。
[0053]
用于样品加载和洗涤的溶剂a是6mm辛胺(acrosorganics129495000)，其使用乙酸调至ph5.0。用于样品洗脱的溶剂b是20%的在acn（含有0.1%甲酸）中的水。通过在真空下直接从多孔板中抽吸10μl到收集环上来依次分析样品。将10μl样品加载到c18筒上，并使用溶剂a以1.25ml/min的流速洗涤5000ms。然后将保留的分析物使用溶剂b以1.25ml/min的流速保持5000ms洗脱到质谱仪。将系统使用溶剂a以1.25ml/min的流速重新平衡2000ms。
[0054]
三重四极质谱仪配有esi源，并以负模式[m-h]-使用选择的反应监测(srm)来监测分析物。在m/z259.02/96.9处监测f1p，并在m/z264.99/97处监测
13c6-果糖-6-磷酸。使用
13c6-果糖-6-磷酸作为内标计算f1p的面积比率值。
[0055]
基本上如上文所述试验实施例1至3的化合物：表2实施例编号hkhk-cic
50
(nm)hkhk-aic
50
(nm)122.6(se=13.8,n=4)21.5(se=16.3,n=4)223.1(se=16.8,n=3)12.7(se=9.68,n=3)329.7(se=7.53,n=4)23.4(se=2.29,n=5)
[0056]
上表2中所示的结果表明，实施例1至3的化合物抑制khk-c和khk-a二者的酶活性。
[0057]
khk细胞活性测定使用细胞khk对果糖向f1p的转化的抑制的细胞测定，可以测量效力。将hepg2肝细胞铺板到96-孔细胞培养板上的生长培养基[dulbecco氏改良的伊格尔培养基(dmem)高葡萄糖，10％热灭活的胎牛血清(hifbs),1
×
青霉素/链霉素]中，并使其在37℃培养箱中附着过夜。洗涤生长培养基并替换为测定培养基，所述测定培养基包括gibcooptimem1还原血清培养基(reducedserummedium)、0.1%酪蛋白、8.33mmd-果糖-13
c6和浓度范围为100μm至0.0051μm(10点浓度曲线)的化合物。将板在37℃温育3h，此后从细胞孔中抽吸测定培养基。然后将终止溶液添加至细胞，所述终止溶液包括80%meoh、2mm乙酸铵和50ng/ml果糖-6-磷酸-13
c6。将板在-20℃储存直到rapidfirems分析(如上文所述)。
[0058]
基本上如上文所述试验实施例1至3的化合物：表3实施例编号hepg2ic
50
(nm)1911(se=150,n=3)2186(se=14.8,n=3)382.1(se=6.24,n=5)
[0059]
上表3中所示结果表明，实施例1至3的化合物抑制hepg2细胞中果糖向f1p的代谢。
[0060]
用于药代动力学测定的液体色谱串联质谱(lc-ms/ms)方法：通过将180μl含有内标的meoh:acn(1:1,v/v)加至50μl血浆中，使用蛋白沉淀来提取样品。然后将样品用meoh:水(1:1,v/v)稀释，使其浓度在标准曲线范围内。使用配备有turboionspray接口的sciexapi4000三重四极质谱仪(appliedbiosystems/mds；fostercity,ca)并在阳离子模式运行，通过lc-ms/ms分析稀释的样品。将分析物使用echelonc184um20x2.1mm柱进行色谱分离。lc条件是水/1m碳酸氢铵(2000:10，v/v)(流动相a)，和meoh/1m碳酸氢铵
(2000:10，v/v) (流动相b)。
[0061]
在sprague dawley大鼠中的药代动力学使用sprague dawley大鼠(禁食的；n＝3/施用途径)来表明实施例2和实施例3的体内药代动力学性能。通过在媒介物中的单个口服(po；3 mg/kg；10 ml/kg的体积)或静脉内(iv；1 mg/kg；1 ml/kg的体积)剂量施用化合物。在给药后0至至多24小时的多个时间点，从每只动物采集血液。通过如上文所述的lc-ms/ms方法测定实施例2和实施例3的血浆浓度。
[0062]
对于实施例2，生物利用度为65%，而静脉内剂量揭示平均半衰期为6.42小时且平均清除率为5.57 ml/min/kg。对于实施例3，生物利用度为69%，而静脉内剂量揭示平均半衰期为2.95小时且平均清除率为12.7 ml/min/kg。该数据显示实施例2和3在大鼠中具有低的总清除率，提示最小的首过提取、高口服生物利用度和延长的消除（由适当的平均半衰期证明）。
[0063]
在狗中的药代动力学使用比格狗(进食的，n=3)来表明实施例2和实施例3的体内药代动力学性能。通过在媒介物中的单个口服(po；2 mg/kg；2 ml/kg的体积)或静脉内(iv；1 mg/kg；1 ml/kg的体积)剂量施用化合物。在给药后0至至多24小时的多个时间点，从每只动物采集血液。通过如上文所述的lc-ms/ms方法测定实施例2和实施例3的血浆浓度。
[0064]
对于实施例2，静脉内剂量揭示平均半衰期为11.3小时且平均清除率为2.15 ml/min/kg。对于实施例3，平均半衰期为4.52小时且生物利用度为~96%，如通过口服剂量所确定的；而静脉内剂量揭示平均半衰期为5.07小时且平均清除率为4.77 ml/min/kg。该数据显示实施例2和3在狗中具有低的总清除率，提示最小的首过提取、高口服生物利用度和延长的消除（由适当的平均半衰期证明）。