包含来源于凝血酶处理的干细胞的外泌体的用于预防或治疗糖尿病性皮肤病的组合物的制作方法

1.本发明涉及用于预防或治疗糖尿病性皮肤病的药物组合物，含有所述组合物的药物制剂以及制备它们的方法，所述药物组合物包含从凝血酶处理的干细胞中分离的外泌体作为活性成分。


背景技术：

2.糖尿病是一种胰岛素分泌不足或未达到正常功能的代谢疾病，特征在于高血糖，其中血液中的葡萄糖浓度增加，并且由于高血糖和尿中葡萄糖的排泄而引起多种症状和体征。已知i型糖尿病也称为“青少年糖尿病”，是由于自身免疫机制破坏胰腺的β细胞而导致的胰岛素产生的绝对或相对缺乏引起的，而ii型糖尿病是由胰岛素抵抗诱导的，并且由多种因素导致，如肥胖、胰岛素受体减少、胰岛素分泌减少和遗传因素。
3.根据韩国糖尿病协会(korean diabetes association)的2016公告，截至2014年，韩国30岁以上的成年人中的糖尿病患病率被记录为13.7％，创历史新高，并且糖尿病合并症的风险也很严重。糖尿病患者中的肥胖症和腹部肥胖症的患病率分别达到48.6％和58.9％，伴随的高血压和高胆固醇血症分别为54.7％和31.6％。因此，糖尿病可引起严重的并发症，如心血管疾病、视网膜病、肾衰竭、周围神经病变和皮肤病以及其自身的风险。
4.糖尿病性皮肤病，其是由糖尿病引起的疾病之一，可以通过长时间维持血液中的高葡萄糖水平而引起，并且具体地包括糖尿病溃疡、黑棘皮病、糖尿病脂性渐进性坏死、糖尿病性皮肤病变、发疹性黄瘤病、软纤维瘤、瘙痒、环状肉芽肿以及细菌和真菌感染。特别地，在皮肤病的情况下，由于高血糖浓度而导致恢复不好，因此它可能变成慢性疾病。因此，有必要开发能够预防和治疗由糖尿病引起的多种皮肤病的有效制剂。
5.同时，干细胞被认为是参与组织再生、治疗和免疫应答的细胞并且以它们的多能性而著称，因此存在通过使用上述特征从脐带血和骨髓中分离和培养间充质干细胞来开发用于多种疾病和症状的治疗剂的努力。
6.然而，使用干细胞本身的治疗具有以下局限性和副作用。首先，基本上，在细胞治疗剂的情况下，不能排除由于dna转移而导致的致瘤性的可能性，其次，由于干细胞本身的大尺寸，它可能引起血管阻塞或心肌梗塞，第三，当使用同种异体细胞如脐带血(同种异体移植物)移植时，存在由于细胞表面抗原而导致的排斥的问题，第四，通常，细胞治疗剂由于储存和运输的限制而导致制造过程困难和生产成本高的局限性。因此，由于干细胞的固有限制，已经开发了使用遗传操作的功效改善方法作为用于减少副作用和改善治疗效果的方法，但是迄今为止还没有明确的替代方法。
7.外泌体是具有从多种细胞分泌的膜结构的小囊泡(直径：大约30-100nm)，并且在使用电子显微镜的研究中，已经观察到它们源自称为多泡体(mvb)的特定细胞内区室，而不是直接从质膜分离，并且被释放和分泌到细胞外。也就是说，当mvb和质膜融合时，囊泡被释放到细胞外环境中，称为外泌体。虽然尚不清楚这些外泌体通过什么分子机制产生，但已知
包括红细胞以及b淋巴细胞、t淋巴细胞、树突细胞，血小板和巨噬细胞在内的各种类型的免疫细胞、肿瘤细胞和干细胞在它们存活时产生并分泌外泌体。
8.特别地，来源于干细胞的外泌体不仅含有受体和蛋白质，而且还含有核成分，并且已知其在细胞内通讯中起作用。此外，与干细胞相比，干细胞来源的外泌体含有相对较少的动物血清，因此也可以排除由动物血清感染引起的人畜共患病的风险。考虑到外泌体的这些特征，使用外泌体的细胞疗法有望称为一种新的范例，其能够克服常规干细胞疗法的局限性。
9.在这方面，虽然已经公开了使用多能干细胞对糖尿病皮肤溃疡的治疗效果(kr10-2018-0104196)，但是凝血酶处理的干细胞来源的外泌体用于治疗糖尿病性皮肤病的用途尚不清楚。
10.公开内容
11.技术问题
12.作为通过将干细胞来源的外泌体应用于糖尿病性皮肤病的研究努力的结果，本技术的发明人证实了当在糖尿病动物模型中诱导皮肤损伤作为糖尿病性皮肤病的实例时外泌体的优异治疗效果。基于此，完成了本发明。
13.因此，本发明涉及提供用于预防或治疗糖尿病性皮肤病的药物组合物，其包含凝血酶处理的干细胞来源的外泌体作为活性成分。
14.此外，本发明涉及提供用于治疗糖尿病性皮肤病的药物制剂，其包含所述药物组合物。
15.此外，本发明涉及提供用于改善糖尿病性皮肤病的准药制剂，其包含凝血酶处理的干细胞来源的外泌体。
16.此外，本发明涉及提供制备所述药物组合物的方法。
17.然而，在本发明中要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域的普通技术人员将从下面的描述中充分理解本文没有描述的其它问题。
18.技术方案
19.为了实现本发明的目的，本发明提供了用于预防或治疗糖尿病性皮肤病的药物组合物，其包含凝血酶处理的干细胞来源的外泌体作为活性成分。
20.在本发明的一个实施方案中，所述干细胞可以选自间充质干细胞、人组织来源的间充质基质细胞、人组织来源的间充质干细胞、多能干细胞和羊膜上皮细胞。
21.在本发明的另一个实施方案中，所述间充质干细胞可以来源于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜或胎盘。
22.在本发明的另一个实施方案中，所述糖尿病性皮肤病可以选自糖尿病溃疡、发疹性黄瘤病、皮肤感染、糖尿病性皮肤病变、皮肤纤维瘤、黑棘皮病、瘙痒、糖尿病性硬肿病和环状肉芽肿。
23.在本发明的另一个实施方案中，所述药物组合物还可以包含选自培养基、细胞因子、生长因子和基因的辅助成分。
24.此外，本发明提供了用于治疗糖尿病性皮肤病的药物制剂。
25.在本发明的一个实施方案中，所述药物制剂可以是可注射型、输注型、喷雾型、液体型或贴片型。
26.此外，本发明提供了用于改善糖尿病性皮肤病的准药制剂，其包含凝血酶处理的干细胞来源的外泌体作为活性成分。
27.在本发明的一个实施方案中，所述准药制剂可以是用于皮肤的外用制剂，选自液体、软膏剂、霜剂、喷雾剂、贴剂、凝胶和气雾剂。
28.此外，本发明提供了制备药物组合物的方法，其包括以下步骤：
29.(a)在干细胞培养之后用凝血酶处理；
30.(b)从(a)的细胞培养物中分离外泌体；以及
31.(c)制备含有(b)中分离的所述外泌体作为活性成分的组合物。
32.在本发明的一个实施方案中，(a)中的所述凝血酶可以以1-1000单位/ml被包含在所述培养基中。
33.在本发明的另一个实施方案中，可以通过在3,000至100,000g离心10分钟至5小时来分离(b)中所述的外泌体。
34.此外，本发明提供了预防或治疗糖尿病性皮肤病的方法，其包括向个体施用包含凝血酶处理的干细胞来源的外泌体作为活性成分的药物组合物。
35.此外，本发明提供了所述药物组合物用于预防或治疗糖尿病性皮肤病的用途。
36.有益效果
37.在本发明中，根据本发明的具体实施方案证实了从凝血酶处理的干细胞分离的外泌体在糖尿病动物模型中具有优异的糖尿病性皮肤病变恢复效果。此外，由于基于外泌体的治疗剂是无细胞制剂，因此不包括dna，这种治疗剂具有低的癌症风险，并且不含细胞表面抗原。因此，基于外泌体的治疗剂不具有移植排斥的问题，因此是安全的。此外，作为分离材料而不是细胞，基于外泌体的治疗剂可以开发为现成的产品，从而降低生产成本。因此，根据本发明的来源于凝血酶处理的干细胞的外泌体可被开发作为用于可由糖尿病导致的多种顽固性慢性皮肤病的治疗剂，此外，预期所述外泌体可有效地用于与皮肤再生相关的领域。
附图说明
38.图1是通过扫描电子显微镜(sem)和透射电子显微镜(tem)获得的从凝血酶处理的干细胞分离的外泌体的一组图像。
39.图2是通过蛋白质印迹测量外泌体标志物cd9、cd63和cd81的水平的结果，以证实从凝血酶处理的干细胞分离的产物是外泌体。
40.图3a显示了制备糖尿病诱导的动物模型以验证凝血酶处理的干细胞来源的外泌体对糖尿病性皮肤病变的治疗效果，以及通过向大鼠腹腔内施用盐水而制备的正常组(saline)和通过腹腔内施用链脲霉素诱导糖尿病的组(stz)中平均血糖水平的结果。
41.图3b是显示了在实验组之间血糖没有差异的结果，在所述实验组中，诱导了糖尿病性皮肤病变，并将其用盐水(saline)、未处理的干细胞来源的外泌体(天然exo)和从凝血酶处理的间充质干细胞分离的外泌体(凝血酶exo)进行处理。
42.图4是在糖尿病诱导的大鼠模型中制造创伤以引起皮肤病变之后立即将盐水(saline)、未处理的干细胞来源的外泌体(天然exo)和从凝血酶处理的间充质干细胞分离的外泌体(凝血酶exo)分别直接应用至创伤时每5天比较创伤愈合效果的结果。
43.本发明的模式
44.作为通过将来源于干细胞的干细胞来源的外泌体应用于糖尿病性皮肤病的研究努力的结果，本技术的发明人证实了当在糖尿病动物模型中诱导皮肤损伤作为糖尿病性皮肤病的实例时外泌体的优异治疗效果。基于此，完成了本发明。
45.因此，本发明提供了用于预防或治疗糖尿病性皮肤病的药物组合物，其包含凝血酶处理的干细胞来源的外泌体作为活性成分。
46.术语“凝血酶”是参与血液凝固的蛋白酶，并且用于催化通过水解将血液中的可溶性纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白的反应。在本发明中，将其应用于干细胞以有效地增强从干细胞分离的外泌体对糖尿病性皮肤病的治疗效果。
47.本文所用的“干细胞”是指具有分化能力但尚未分化的“未分化细胞”，以及具有自我复制能力和分化成两种或更多种不同类型细胞的能力的细胞。本发明的干细胞可以是自体的或同种异体的干细胞，并且可以来源于任何类型的动物，如人和非人哺乳动物。
48.在本发明中，干细胞是胚胎干细胞或成体干细胞，优选成体干细胞。成体干细胞可以是间充质干细胞、人组织来源的间充质基质细胞、人组织来源的间充质干细胞或多能干细胞，优选间充质干细胞，但本发明不限于此。
49.间充质干细胞可以是来源于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜或胎盘的间充质干细胞，优选脐带血衍生的间充质干细胞，但本发明不限于此。
50.术语“脐带血”是指从连接胎盘和胎儿的脐静脉收集的血液。脐带血是一种在分娩过程中天然存在的副产物，比需要多次手术的一般间充质组织，如骨髓更容易收集，并且与骨髓移植相比，由于脐带血储存工业已经启动并且已经建立了基础设施，因此容易找到供体。此外，由于脐带血衍生的细胞是不表达组织相容性抗原hla-dr(ⅱ类)的细胞(所述组织相容性抗原hla-dr(ⅱ类)是组织或器官移植中排斥的最重要原因)，因此它不诱导或最小化免疫应答，如排斥，这在常规移植手术中一直是一个问题，因此不仅可以使用自体脐带血，而且还可以使用异源脐带血。
51.本文所用的术语“外泌体”是指具有从多种细胞分泌的膜结构的小囊泡(直径：约30-100nm)，并且意指通过mvb和质膜之间的融合释放到细胞外环境的囊泡。外泌体包括天然分泌的那些外泌体，或人工分泌的那些外泌体。
52.本文所用的术语“预防”是指通过施用根据本发明的药物组合物来抑制糖尿病性皮肤病或延缓其发作的所有作用。
53.本文所用的术语“治疗”是指通过施用根据本发明的药物组合物而参与缓解或有益地改变糖尿病性皮肤病的症状的所有作用。
54.本文所用的术语“糖尿病性皮肤病”包括由于胰岛素抵抗和异常胰岛素分泌引起的血糖增加而导致的与皮肤相关的各种疾病，并且特别地可以选自糖尿病溃疡、发疹性黄瘤病、皮肤感染、糖尿病性皮肤病变、皮肤纤维瘤、黑棘皮病、瘙痒、糖尿病性硬肿病和环状肉芽肿，但本发明不限于此。
55.本发明的药物组合物还可以包含选自培养基、细胞因子、生长因子和基因的辅助成分。
56.本发明的药物组合物可以单独使用或与使用手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法和生物反应调节剂的方法组合使用，用于糖尿病性皮肤病的治疗。
57.本发明的药物组合物可以包含凝血酶处理的干细胞来源的外泌体作为活性成分，并且还包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于制剂中，并且包括盐水、蒸馏水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等，但本发明不限于此。如果需要，药物组合物还可以包含其它常规添加剂，包括抗氧化剂，缓冲剂等。此外，通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂，药物组合物可以配制为可注射形式，如水溶液、乳液或混悬液，丸剂，胶囊，颗粒剂或片剂。合适的药学上可接受的载体和它们的制剂可以根据每种成分使用remington’s pharmaceutical science中公开的方法来配制。
58.本发明的药物组合物可以根据所需的方法经口或肠胃外(例如静脉内、皮下、腹腔内或局部)施用，并且药物组合物的剂量可以根据患者的状况和体重、疾病的严重程度、药物类型、施用途径和时间而变化，并且可以由本领域普通技术人员适当地选择。
59.药物组合物以药学上有效量施用。本文所用的术语“药学上有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理益处/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量可通过参数来确定，所述参数包括患者疾病的类型、严重程度、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排泄率、同时使用的治疗和药物的持续时间以及医学领域中熟知的其它参数。本发明的药物组合物可以单独施用或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂顺序或同时施用，或者以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述参数，重要的是在没有副作用的情况下以最小剂量实现最大效果，并且这种剂量可以由本领域普通技术人员容易地确定。
60.具体地，本发明的药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别、病况、体重、体内活性成分的吸收率、失活率、排泄速率、疾病类型或并用药物而变化，并且通常，可以以每天或每隔一天或一天一至三次施用0.001至150mg，优选0.01至100mg/kg体重。然而，有效量可以根据施用途径、肥胖的严重程度、性别、体重或年龄而增加或减少，因此它不以任何方式限制本发明的范围。
61.此外，本发明提供了用于治疗糖尿病性皮肤病的药物制剂，其包含所述药物组合物。
62.药物制剂可以是可注射类型、输注类型、喷雾类型、液体类型或贴剂类型，但本发明不限于此。本领域普通技术人员可以选择用于治疗相应的糖尿病性皮肤病的合适形式。
63.根据本发明的具体实施方案，证实了凝血酶处理的干细胞来源的外泌体特别对糖尿病性皮肤病具有优异的治疗效果。
64.在本发明的一个实施方案中，用凝血酶处理脐带血来源的间充质干细胞并培养，然后通过离心分离外泌体。随后，在扫描电子显微镜和透射电子显微镜下观察分离的外泌体，并且通过测量外泌体特异性标志物cd9、cd63和cd81的表达水平来证实外泌体得到了很好地分离(参见实施例1)。
65.在本发明的另一个实施方案中，在评价外泌体对糖尿病性皮肤病的治疗效果之前，通过测量糖尿病诱导的大鼠模型的血糖，证实了与正常组相比有效地诱导了糖尿病。因此，在具有相同血糖水平而无血糖差异的糖尿病大鼠模型中，在背部皮肤上制造创伤以诱导皮肤病变，随后用盐水、未处理的干细胞来源的外泌体或凝血酶处理的干细胞来源的外泌体中的每一种处理并每5天评价皮肤病恢复的程度。结果，证实了当用本发明的凝血酶处理的干细胞来源的外泌体处理时具有显著的治疗效果(参见实施例2)。
66.因此，作为本发明的另一方面，本发明提供了用于改善糖尿病性皮肤病的准药制剂，其包含凝血酶处理的干细胞来源的外泌体。
67.本发明中的准药制剂可以是用于皮肤的外用制剂，其选自液体、软膏剂、霜剂、喷雾剂、贴片、凝胶和气雾剂，并且特别地可以用作消毒剂、淋浴泡沫、漱口水、湿巾、洗衣皂、洗手液、加湿器过滤器、面膜、软膏剂或过滤器填料组合物，但本发明不限于此。准药制剂可以由本领域普通技术人员适当地选择并且用于改善糖尿病性皮肤病。
68.在本发明的另一方面，本发明提供了制备所述药物组合物的方法，其包括：(a)在干细胞培养之后用凝血酶处理；(b)从(a)的细胞培养物中分离外泌体；以及(c)制备含有(b)中分离的所述外泌体作为活性成分的组合物。
69.在本发明中，凝血酶处理浓度不受特别限制，只要它是适合增强干细胞/外泌体功效的浓度，但凝血酶优选以1-1000单位/ml被包含在培养基中。
70.在本发明中，分离外泌体的方法不受限制，例如，可以通过离心、超速离心、使用过滤器过滤、凝胶过滤层析、自由流动电泳、毛细管电泳或单独使用聚合物分离或以上的组合，优选离心/超速离心从培养物中分离外泌体。在本文中，离心/超速离心优选在4℃和3,000-100,000g下进行10分钟至5小时。
71.在本发明中，细胞培养中使用的培养基是指用于干细胞体外生长和增殖的混合物，其包括细胞生长和增殖所必需的元素，如糖、氨基酸、各种类型的营养物、血清、生长因子和矿物质。可以在本文中使用的培养基包括商业生产的培养基，如达尔伯克改良的伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle’s medium,dmem)、最低必需培养基(mem)、基础eagle培养基(basal medium eagle,bme)、rpmi1640、达尔伯克改良伊格尔培养基：营养混合物f-10(dmem/f-10)、达尔伯克改良伊格尔培养基：营养混合物f-12(dmem/f-12)、α-最低必需培养基(α-mem)、glasgow最低必需培养基(glasgow's minimal essential medium,g-mem)、isocove改良的达尔伯克培养基(imdm,isocove’s modified dulbecco's medium)和敲除dmem(knockout dmem)或人工合成的培养基，但本发明不限于此。
72.在本发明的另一个方面，本发明提供了预防或治疗糖尿病性皮肤病的方法，所述方法包括向个体施用包含凝血酶处理的干细胞来源的外泌体作为活性成分的药物组合物。
73.本文所用的术语“个体”是指需要治疗的对象，更具体地，哺乳动物如人或非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。
74.此外，本发明提供了所述药物组合物用于预防或治疗糖尿病性皮肤病的用途。
75.在下文中，为了帮助理解本发明，将提出示例性实施方案。然而，提供以下实施例仅仅是为了更容易地理解本发明，而不是为了限制本发明。
实施例
76.实施例1：凝血酶处理干细胞诱导外泌体分泌
77.将人脐带血来源的间充质干细胞(3
×
105个)接种在100-mm培养皿(orange scientific cat#4450200)中并培养1周。在证实了细胞在培养板中充满并增殖之后，将培养基替换为稀释了50单位/ml凝血酶(reyon pharmaceutical.co.,ltd)的无血清培养基(α-mem培养基)，并再培养6小时。然后，将培养液分到离心管中，在4℃、6,000rpm下离心30分钟，并将上清液转移到新的管中以去除细胞碎片。将上清液再次在4℃、100,000rpm下超
速离心2-4小时，然后进一步去除上清液以获得外泌体。
78.如图1所示，作为在扫描电子显微镜(sem)和透射电子显微镜(tem)下对根据上述方法分离的外泌体进行观察和成像的结果，证实了通过上述方法的凝血酶刺激所分泌的外泌体。
79.此外，为了清楚地证实所获得的产物是否是外泌体，进行蛋白质印迹以验证已知外泌体标志物cd9、cd63和cd81的表达。结果，如图2所示，发现从凝血酶处理的干细胞获得的产物正常表达cd9、cd63和cd81，因此所述产物被鉴定为外泌体。
80.实施例2：凝血酶处理的干细胞来源的外泌体对糖尿病性皮肤病变的治疗效果的验证
81.本技术的发明人进行以下体内实验以验证通过实施例1的方法获得的外泌体是否对慢性糖尿病性皮肤病具有治疗效果。
82.首先，为了制备糖尿病诱导的动物模型，在将链脲霉素以100mg/kg/体重每天一次腹腔内施用至12至16周龄的sd大鼠持续4天之后，从尾部收集血液2周以测量血糖水平。作为血糖测量的结果，仅选择血糖水平为300mg/dl或更高的大鼠并将其用于实验。如图3a所示，实验中使用的正常组是在相同条件下腹腔内施用盐水，测量血糖为100mg/dl，并且证实了糖尿病诱导组的平均血糖为350mg/dl或更高。
83.然后，通过在糖尿病诱导的大鼠背部制造具有一定大小的创伤，在糖尿病诱导的大鼠中诱导糖尿病性皮肤病变。在制造创伤之后，将从未处理的间充质干细胞(天然msc)分离的外泌体(天然exo)和从凝血酶处理的间充质干细胞分离的外泌体(凝血酶exo)直接施用到每个损伤(每个10μg)。在本文中，作为测量对应于每个实验组的每组大鼠的血糖的结果，如图3b所示，证实了各组之间的血糖没有差异。
84.然后，以5天的间隔拍摄相应的部位，测量疾病区域的变化，并比较治疗效果，如图4所示，当与用盐水和天然msc来源的外泌体中的每一种进行处理相比时，用凝血酶处理的msc来源的外泌体处理对皮肤损伤的治疗效果显著更好。根据上述结果，可以看出从凝血酶处理的msc分离的外泌体对糖尿病性皮肤病具有优异的治疗效果。
85.本领域普通技术人员应当理解，本发明的上述描述是示例性的，并且在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本文公开的示例性实施方案修改成其它特定形式。因此，应当理解，上述示例性实施方案在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。
86.工业实用性
87.由于根据本发明的基于外泌体的治疗剂是无细胞制剂，因此不包括dna，这种治疗剂具有低的癌症风险，并且不含细胞表面抗原。因此，这种基于外泌体的治疗剂不具有移植排斥的问题，因此是安全的。此外，作为分离材料，而不是细胞，基于外泌体的治疗剂可以开发为现成的产品，因此可以降低生产成本。因此，预期根据本发明的来源于凝血酶处理的干细胞的外泌体能够用作可由糖尿病引起的多种顽固性慢性皮肤病的治疗剂。