具有冠状病毒疫苗涂覆的微突起的经皮活性剂递送装置的制作方法

具有冠状病毒疫苗涂覆的微突起的经皮活性剂递送装置
1.相关申请的交叉引用本技术要求2020年4月22日提交的美国临时专利申请第63/013,809号的权益；在法律允许的范围内，该申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
2.本发明涉及经皮或皮内递送疫苗的领域，更具体地涉及递送在经接种的哺乳动物的血清中产生冠状病毒或其他病毒特异性抗体的疫苗。


背景技术：

3.流感疫苗是每年一次的疫苗，它可以保护人们不患上流感（一种容易传播的病毒性呼吸道疾病）。流感疫苗通常是通过注射或鼻内喷雾而施用的。随着最近冠状病毒的大流行，研究人员正在积极研究预防covid-19的疫苗。一些报告描述了covid-19带来的严重公共卫生挑战，以及目前可用的治疗方案。参见例如kaloramainformation,“covid-19update:moleculardiagnostics,immunoassays,vaccines,telehealthandotherareas”（2020年4月7日）。
4.在此类治疗中，可溶解的微针阵列已被用于递送重组冠状病毒疫苗。参见例如e.kimetal.,microneedlearraydeliveredrecombinantcoronavirusvaccines:immunogenicityandrapidtranslationaldevelopment,ebiomedicine(2020),https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2020.102743。然而，这种可溶解的微针有一些缺点，包括机械强度低和断裂，以及由于成型工艺的限制而容易失去尖端的锋利度。此外，这种可溶解微针被限制在较大的厚度（例如500微米或更大），这使得它更难符合患者的皮肤表面。此外，这种实验室规模的制造并不能转化为大规模的制造，这在工艺和产品质量保证和控制等方面更具挑战性。
5.因此，本领域需要一种通过经皮递送进行的疫苗施用的有效方法，其中可以精确且均匀地涂覆贴片（patch），而不会造成阵列上残留疫苗制剂的问题或制造不一致的问题，例如阵列上不均匀的制剂涂层或制剂难以粘在贴片上。已多次尝试使用经皮微针贴片进行有效的生物活性剂/药物递送；然而，实现从微针系统中生物活性剂的快速释放，优化和开发有效的微针形状和尺寸，同时还包含足够剂量的生物活性剂已经被证明是难以实现的。因此，有必要解决粘度、生物活性剂装载、表面张力、微针的形状和尺寸以及常见的制造缺陷等问题。
6.此外，还需要可以容易地自我施用（self-administered）的疫苗产品，而不必去医生办公室或其他拥挤的地方，使病人和医疗保健提供者面临病毒暴露的风险。其他需求包括避免通常用于皮下和肌肉内注射的尖锐针头和相关的生物危害风险、佩戴时间短、以及室温稳定的产品以避免冷链储存的需要。


技术实现要素：

7.本公开满足了上述需求，涉及组合物、装置、治疗方法、试剂盒和药品的制造方法，其对治疗各种健康状况有用，包括针对冠状病毒和流感的疫苗接种。
8.更具体地，本公开涉及向有需要的对象施用作为生物活性剂（活性药物成分）的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗。本公开涉及经皮或皮内或以其他方式通过皮肤施用治疗有效剂量的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗，该疫苗易于使用和携带，可快速给药，即通过微针给药进行皮内给药。在一个实施方案中，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的经皮给药通常包括贴片组件，其具有包括多个微突起（microprojection）（或“针”或“微针”或“阵列”）的微突起构件，这些微突起涂覆有疫苗、与疫苗的储液器流体接触、或以其他方式包含疫苗。贴片组件进一步包括粘合剂组分，在一个优选的实施方案中，微突起构件和粘合剂组分安装在固定环中。微突起施加到皮肤以将疫苗递送到血流，或者更具体地说，适于在足以向血流提供治疗有效量的深度处穿透或刺穿角质层。在一个实施方案中，将涂覆疫苗的微针插入皮肤是由手持式施加器（applicator）控制的，该施加器在小于约10毫秒的时间内赋予足够的冲击能量密度。
9.优选地，微突起构件包括生物相容性涂层制剂，该制剂包含剂量足以提供治疗效果的疫苗，例如，如通过elisa和病毒中和试验所测量的，在经接种的哺乳动物的血清中产生冠状病毒特异性igg抗体和其他相关抗体。
10.涂层可以进一步包括一种或多种赋形剂或载体，以促进疫苗的跨皮肤给药。例如，生物相容性涂层制剂包括疫苗和水溶性载体，其首先以液体形式施加至微突起，然后进行干燥以形成固体生物相容性涂层。本文公开的疫苗贴片易于自我施用，佩戴时间短（例如5-30分钟），与肌肉内注射（im）或皮下注射（sc）的对应疫苗相比节省剂量，是可丢弃的（disposable），并使使用该贴片的患者中的50%得到接种/血清转化。此外，所述贴片不含防腐剂，引起的不良事件极少。
11.本发明的装置、组合物、方法等的其他实施方案将从以下描述、附图、实施例和权利要求书中显而易见。从上述和以下描述中可以理解，本文描述的每一个特征，以及两个或多个此类特征的每一个组合，都包括在本公开的范围内，只要包括在此类组合中的特征不是相互不一致的。此外，任何特征或特征的组合可以具体排除在任何实施方案或方面之外。额外的方面和实施方案在下面的描述和权利要求中阐述，特别是当与所附的实施例和附图一起考虑时。
附图说明
12.参照以下详细描述，参照附图，实施方案的上述特征将更容易理解，其中：图1描述了申请人佐萨诺（zosano）的经皮微突起递送系统：（a）施加器；（b）经药物涂覆的贴片；（c）微突起阵列；和（d）微突起尖端的细节。
13.图2是显示三种疫苗制剂的溶液粘度的线图：50 mg/ml ha和蔗糖（
♦
）；40 mg/ml ha和蔗糖（
■
）；35 mg/ml ha和蔗糖（
▲
）。
14.图3是一系列描述流感疫苗涂覆阵列的涂层形态的显微照片，如下所示：（a）涂覆阵列的一个部分的俯视图；（b）一个微突起的侧视图；（c）一个微突起的俯视图；和（d）一个微突起的前视图。
15.图4显示了用羊抗ha抗体对过程中疫苗材料进行sds-page/蛋白质印迹分析：（a）非还原条件；（b）还原条件。
16.图5是为i期临床试验生产的系统在5℃和25℃储存12个月的稳定性柱状图。
具体实施方式
17.本文将描述各种方面和实施方案。然而，这些方面和实施方案可以以许多不同的形式体现出来，不应解释为限制性的；相反，提供这些实施方案是为了使公开的内容尽可能彻底和完整，从而告知技术人员如何制造和使用本文所述的组合物、装置、治疗方法、试剂盒和药品制造方法。本文使用的术语是为了描述本文所述的组合物、装置、治疗方法、试剂盒和制造方法，除非明确说明，否则不具有限制性，因为本发明的范围将仅由本技术所附的权利要求以及由本技术衍生的延续和分案申请所附的权利要求所限制。本文引用的所有书籍、出版物、专利和专利申请，在此通过引用整体并入本文。
18.从上述和以下描述中可以理解，本文描述的每一个特征，以及两个或多个此类特征的每一个组合，都包括在本公开的范围内，只要包括在此类组合中的特征不是相互不一致的。例如，其使用与任何其他实施方案一致的任何实施方案都是可以考虑的，因此包括在本描述中。其他方面和实施方案在以下描述和权利要求中阐述，并且在与所附的实施例和附图一起考虑时也是如此。
19.如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文明确规定，否则单数形式“一”、“一个/一种”和“所述”包括复数指代。例如，对“一种方法”的提及包括一种或多种方法，和/或本文所述类型的步骤，和/或本领域技术人员在阅读本公开内容后将变得明显。
20.a定义除非另有定义，否则本文使用的所有术语和短语都包括该术语和短语在本领域所达到的含义，除非明确指出或从使用该术语或短语的上下文中清楚地看到相反的含义。任何与本文描述的方法和材料相似或相当的方法和材料都可用于本发明的实践或测试，包括本文描述的特定方法和材料。
21.除非另有说明，否则个别数值的使用被陈述为近似值，就像数值前面有词语“约”或“大约”。同样地，本技术中规定的各种范围内的数值，除非明确指出，否则被表述为近似值，就像所述范围内的最小值和最大值前面都有词语“约”或“大约”。以这种方式，高于和低于所述范围的变化可用于实现与所述范围内的值基本相同的结果。正如本文所使用的，术语词语“约”或“大约”在提及数值时，对于与所公开的主题最密切相关的技术或与讨论的范围或元素相关的技术的普通技术人员来说，应具有其普通和一般的含义。从严格的数字边界扩大的数量取决于本领域技术人员已知的因素。例如，可以考虑的一些因素包括元素的关键性和/或特定数量的变化对所请求保护的主题的性能的影响，以及本领域技术人员已知的其他考虑。正如本文所使用的，对不同的数值使用不同数量的有效数字，并不意味着限制使用“约”或“大约”这些词将如何有助于扩大或缩小特定的数值或范围。一般来说，词语“约”或“大约”可以扩大数值。对范围的公开旨在作为一个连续的范围，包括最小值和最大值之间的每一个数值，加上使用术语词语“约”或“大约”所提供的范围的扩大。因此，此处对数值范围的叙述旨在作为一种速记方法，单独提及属于该范围的每个单独的数值，并且每个单独的数值被纳入说明书，就像在此单独叙述一样。
22.如本文所用，术语“生物相容性涂层”是指并包括由“涂层制剂”形成的涂层，该涂层具有足够的粘附特性，并且与生物活性剂（即，活性药物成分，或治疗剂，或抗原，或药物）没有（或具有最小的）不利的相互作用。
23.术语“冠状病毒”是指一个人畜共患病毒家族，其影响人类并导致呼吸道感染，例如普通感冒症状和更严重甚至致命的情况，例如严重的肺炎和ards。冠状病毒的例子包括α-冠状病毒、β-冠状病毒、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-hku1、sars-cov、mers-cov、以及sars-cov-2。在一些实施方案中，冠状病毒是具有sars-cov-2的基因组序列的β-冠状病毒。在其他实施方案中，冠状病毒的基因组序列与sars-cov-2具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列一致性。在另一个方面，冠状病毒的基因组序列与蝙蝠sars样cov（bat-sl-covzc45，mg772933.1）具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列一致性。本文所述的治疗对于针对所有此类冠状病毒感染及其产生的症状进行疫苗接种是有用的。
24.如本文所用，术语“冠状病毒疫苗”是指任何针对冠状病毒的疫苗。例如，如通过elisa和病毒中和试验所测量的，在经接种的哺乳动物的血清中产生冠状病毒特异性igg抗体或其他相关抗体的任何疫苗，包括但不限于包含冠状病毒突刺（s）蛋白、sars-cov-s1亚单位、mers-s1亚单位的疫苗，以及本文其他地方列出的正在开发的疫苗。
25.术语“covid-19”是指由一种新出现的冠状病毒sars-cov-2引起的呼吸道感染。covid-19的临床综合征范围从轻度或不复杂的疾病，例如发烧、疲劳、咳嗽（有痰或无痰）、厌食、乏力、肌肉疼痛、喉咙痛、呼吸困难、鼻塞、头痛，或很少有的腹泻、恶心和呕吐，到需要住院和氧气支持或进入重症监护室并可能需要机械通风的严重疾病。在严重的病例中，covid-19可并发肺损伤、ards、败血症和脓毒性休克、多器官衰竭，包括急性肾损伤和心脏损伤。严重的covid-19患者最常见的诊断是重症肺炎。
26.术语“赋形剂”是指通常用作生物活性剂的稀释剂、载体、防腐剂、粘合剂、稳定剂等的惰性物质，包括但不限于蛋白质（例如，血清白蛋白等）、氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸等）、脂肪酸和磷脂（例如，烷基磺酸盐、辛酸酯等）、表面活性剂（例如，sds、聚山梨酯、非离子表面活性剂等）、糖类（例如，蔗糖、麦芽糖、海藻糖等）和多元醇（例如，甘露醇、山梨醇等）。其他的药用赋形剂也请参见remington's pharmaceutical sciences, 21
st ed., lww publisher (2005)。
27.如本文所用，词语“皮内”或“经皮”是通用术语，指的是将活性剂（例如，治疗剂，如抗原、药物、药品、肽、多肽或蛋白质）通过皮肤递送到局部组织或全身循环系统，而不大量切割或穿透皮肤，例如用手术刀切割或用皮下注射针刺穿皮肤。皮内药剂递送包括通过被动扩散递送以及基于外部能源的递送，例如电（如离子透入（iontophoresis））和超声波（如音波透入（phonophoresis））。
28.如本文所用，术语“皮内通量”或“经皮通量”是指活性剂或药物的皮内或经皮递送率。
29.如本文所用，术语“微突起构件”或“微针阵列”等，通常意味着包括用于穿透或刺穿角质层的多个微突起（优选以阵列布置）的微突起组。微突起构件可以通过以下方式形成：从金属或其他刚性材料的薄板蚀刻或冲压出多个微突起，并将微突起折叠或弯曲出板的平面以形成构造。微突起构件也可以用其他材料制造，包括塑料或聚合物，例如聚醚醚酮
（peek）。微突起构件可以用其他已知的技术形成，例如注射模塑或微模塑、微机电系统（mems），或通过形成一个或多个条带而沿着每个条带的边缘具有微突起来形成，例如在美国专利号 6,083,196、6,091,975、6,050,988、6,855,131、8,753,318、9,387,315、9,192,749、7,963,935、7,556,821、9,295,714、8,361,022、8,633,159、7,419,481、7,131,960、7,798,987、7,097,631、9,421,351、6,953,589、6,322,808、6,083,196、6,855,372、7,435,299、7,087,035、7,184,826、7,537,795、8,663,155和美国公开号us20080039775、us20150038897、us20160074644和us20016562号中公开的。如本领域普通技术人员所理解的，当采用微突起阵列时，通过改变微突起阵列的大小、密度等，也可以改变或操纵所递送的治疗剂的剂量。
30.术语“微突起”和“微针”在此可互换使用，是指适合穿透、刺穿或切入和/或穿过角质层进入活体动物（特别是哺乳动物，更特别是人类）的皮肤的表皮下层、或表皮层和真皮层的穿刺元件。在本发明的一个实施方案中，穿刺元件的突起长度小于1000微米。在另一个实施方案中，穿刺元件的突起长度小于500微米，更优选小于400微米。微突起进一步具有约25至500微米的宽度和约10至100微米的厚度。微突起可以形成不同的形状，例如针、刀、销、冲头及其组合。
31.术语“患者”和“对象/受试者”在此可互换使用，指的是脊椎动物，优选哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类。
32.如本文所用，生物活性剂“释放速率”是指每单位时间内从剂型或药物组合物中释放的药剂的量，例如，每小时释放的药剂的微克（mcg/hr）或每小时释放的药剂的毫克（mg/hr）。剂型的药剂释放速率通常以体外溶出速率来衡量，即在适当的条件下和在适当的流体中测量的每单位时间从剂型或药物组合物中释放的药剂的量。
33.如本文所用，术语“稳定”是指药剂制剂，意味着药剂制剂不经受不适当的化学或物理变化，包括分离、分解或失活。如本文所用，“稳定”是指涂层，也意味着机械上稳定的，即不经受从涂层所沉积的表面不适当的位移或损失。
34.如本文所用，术语“治疗有效的”或“治疗有效量”是指刺激或启动所需有益结果所需的生物活性剂的量。在本发明的涂层中使用的生物活性剂的量将是递送达到所需结果所需的生物活性剂的量的必要量。在实践中，这将会有很大的变化，取决于被递送的特定生物活性剂、递送的部位以及生物活性剂递送到皮肤组织的溶解和释放动力学。
35.b皮内递送系统根据本发明的用于皮内递送冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的装置和方法包括皮内递送系统，该系统具有微针构件（或系统），该构件具有多个微针（或其阵列），其适于刺穿角质层进入表皮下层、或表皮层和真皮层。
36.在一个实施方案中，皮内递送系统是一种经皮或皮内活性剂递送技术，其包括由位于粘合剂背衬中心的微突起构件组成的可丢弃贴片和施加器。微突起构件包括钛（或其他刚性材料，包括塑料或聚合物材料，如聚醚醚酮（peek））微针，其上涂覆有干燥的活性剂产品制剂。贴片被安装在固定环中，以形成贴片组件。贴片组件被可移除地安装在手持式施加器中，以形成皮内递送系统。施加器确保贴片以定义的施加速度和能量施加到皮内给药的部位。施加器可以设计为一次性使用或可重复使用。这种技术的例子在申请人拥有的美国专利号us20190070103中描述。
37.更具体地，贴片可以包括约200-350微米长的钛微针的约3至6 cm2的阵列，其涂覆有相关生物活性剂（例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗）的亲水制剂，并附着于粘合剂背衬。可以涂覆在贴片的微针阵列上的活性剂的最大数量取决于制剂的活性剂或分子、制剂中赋形剂的重量、以及微针阵列的可涂覆表面积。例如，可以采用具有大约1 cm2、2 cm2、3 cm2、4 cm2、5 cm2和6 cm2微针阵列的贴片。贴片用手持式施加器施用，施加器将微针压入皮肤，每次施加的深度基本一致，接近毛细血管床，允许活性剂涂层的溶解和吸收，但离皮肤的神经末梢较远。典型的贴片佩戴时间为约5至45分钟或更短，减少皮肤刺激的可能性。约0.20至0.60焦耳的标称施加器能量通常能够在冲击感觉和阵列穿透之间达到良好的平衡。由于施加器的弹簧没有完全伸展、贴片从其固定环上脱离的能量损失、以及其他损失，在冲击瞬间的实际动能可能小于这些标称值，这些损失可能包括标称值的大约25%。
38.1阵列设计一些变量在用于特定活性剂的阵列类型中起作用。例如，不同的形状（例如，类似于箭头、钩子、圆锥形或华盛顿纪念碑的形状）可以实现更高的活性剂装载能力，而微突起的长度可以增加，以提供更多的穿透驱动力。角质层的厚度约为10-40微米，微突起必须有足够的尺寸、厚度和形状，以穿透角质层并实现活性剂的递送。微突起穿透角质层，并且基底与皮肤的表面接合。
39.在一些实施方案中，有利的是在将会穿透角质层的微突起上实现更厚的涂层，同时避免将涂层施加至将不会穿透角质层的阵列的基底或基部（“街道（street）”）。更大的表面积允许更厚的涂层，而不会延伸到阵列的基部或街道。在某些情况下，涂层只施加至微突起。此外，具有涂层的更大体积的突起所需的较高穿透力可以通过较长的长度和较低的每cm2的突起密度来补偿。
40.可用于本公开的示例性皮内递送系统包括在美国专利号6,083,196、6,091,975、6,050,988、6,855,131、8,753,318、9,387,315、9,192,749、7,963,935、7,556,821、9,295,714、8,361,022、8,633,159、7,419,481、7,131,960、7,798,987、7,097,631、9,421,351、6,953,589、6,322,808、6,083,196、6,855,372、7,435,299、7,087,035、7,184,826、7,537,795、8,663,155和美国公开号us20080039775、us20150038897、us20160074644和us20020016562中描述的活性剂递送技术。所公开的系统和设备采用各种形状和尺寸的穿刺元件，以刺穿皮肤的最外层（即角质层），从而提高药剂的皮内流量。穿刺元件通常从薄而平的基底构件（例如垫或板）垂直延伸。穿刺元件通常很小，有些只有大约25至400微米的微突起长度和大约5至50微米的微突起厚度。这些微小的穿刺/切割元件在角质层中形成相应的微缝隙/微切口，以加强经皮/皮内药剂的递送。要递送的活性剂与一个或多个微突起相关联，优选通过使用基于病毒疫苗的制剂涂覆微突起以形成固体干燥涂层，或者任选地通过使用在微缝隙形成后与角质层相通的储存器，或者通过由在施加后溶解的基于病毒疫苗的固体制剂来形成微突起。微突起可以是实心的，也可以是空心的，还可以进一步包括适合接收和/或增强涂层体积的设备特征，例如孔、槽、表面不规则或类似的修饰，其中这些特征提供了增加的表面积，在这些表面上可以沉积更大量的涂层。微针可以由不锈钢、钛、镍钛合金或类似的生物相容性材料（例如聚合材料）构成。
41.因此，本公开包括具有以下特征的贴片和微针阵列：贴片尺寸：约1至20 cm2，或约2至15 cm2，或约4至11 cm2，或约3 cm2，或约5 cm2，或
约10 cm2。
42.基底尺寸：约0.5至10 cm2，或约2至8 cm2，或约3至6 cm2，或约3 cm2，或约3.13 cm2，或约6 cm2。
43.阵列尺寸：约0.5至10 cm2，或约2至8 cm2，或约2.5至6 cm2，或约2.7 cm2，或约5.5 cm2，或约2.74 cm2，或约5.48 cm2。
44.密度（微突起/cm2）：至少约10个微突起/cm2，或约200至2000个微突起/cm2，或约500至1000个微突起/cm2，或约650至800个微突起/cm2，或约725个微突起/cm2。
45.微突起的数量/阵列：约100至4000，或约1000至3000，或约1500至2500，或约1900至2100，或约2000，或约1987，或约200至8000，或约3000至5000，或约或约3500至4500，或约4900至4100，或约4000，或约3974。
46.微突起长度：约25至600微米，或约100至500微米，或约300至450微米，或约320至410微米，或约340微米，或约390微米，或约387微米。在其他实施方案中，长度小于1000微米，或小于700微米，或小于500微米。相应地，微针穿透皮肤至约25至1000微米。
47.尖端长度：约100至250微米，或约130至约200微米，或约150至180微米，或约160至170微米，或约165微米。
48.微突起宽度：约10至500微米，或约50至300微米，或约75至200微米，或约90至160微米，或约250至400微米，或约300微米，或约100微米，或约110微米，或约120微米，或约130微米，或约140微米，或约150微米。
49.微突起厚度：约1微米至约500微米，或约5微米至300微米，或约10微米至100微米，或约10微米至50微米，或约20微米至30微米，或约25微米。
50.尖端角度：约10至70度，或约20至60度或约30至50度，或约35至45度，或约40度。
51.每个阵列的总活性剂：约1 mcg至500 mcg，或约10 mcg至400 mcg，或约25 mcg至300 mcg，或至少50 mcg，或至少75 mcg，或至少100 mcg。
52.每个阵列的非活性成分的量：约0.1至10 mg，或约0.2至4 mg，或约0.3 mg至2 mg，或约0.6 mg，或约0.63 mg，或约1.3 mg，或约1.26 mg。替代地，非活性成分的量比活性剂少1至3倍，或约0.033 mg至约3.33 mg。
53.涂层厚度：约50微米至约500微米，或约100微米至约350微米，或约50微米至约200微米。
54.每个微突起的活性剂：每个微突起的抗原的量可以是约13 ng到约250 ng，或约0.01
ꢀµ
g到约100
ꢀµ
g，或约0.1到10
ꢀµ
g，或约0.5到2
ꢀµ
g，或约1
ꢀµ
g，或约0.96
ꢀµ
g。
55.在本发明的一个实施方案中，微针构件具有至少约10个微突起/cm2的微针密度，更优选地，至少约200至750个微突起/cm2。
56.在本发明的一个实施方案中，微突起具有小于1000微米的突起长度。在另一个实施方案中，微突起具有小于700微米的突起长度。在其他实施方案中，微突起具有小于500微米的突起长度。优选地，微突起的长度为300至400微米。微突起进一步具有约100至约150微米的宽度和约10至约40微米的厚度。
57.在一个实施方案中，微突起构件由不锈钢、钛、镍钛合金或类似的生物相容性材料（例如聚合材料）构成。
58.在本发明的一个实施方案中，微突起构件包括生物相容性涂层，该涂层至少布置
在微针上。疫苗抗原的量可以是每个阵列约25至约500 mcg。
59.另一个实施方案具有粘附在面积约为3.1 cm2、厚度约为25微米的钛基底上的约5 cm2的贴片面积。该基底由面积约为2.74 cm2的微突起阵列组成，包含约1987个微突起，密度约为725个微突起/cm2。每个微突起上所含的干制剂可具有美式足球的近似形状，其厚度从最大的约270微米逐渐变小，包含每个微突起约0.002 μg至约0.25 μg的冠状病毒疫苗抗原，每个贴片约5 μg至约500 μg的抗原。
60.另一个实施方案具有粘附在约6 cm 2
且厚度约为25 μm的钛基底上的约5 cm2的贴片面积。该基底由面积约为5.5 cm2的阵列组成，包含约4000个微突起，密度约为725个微突起/cm2。每个微突起上所含的干制剂呈美式足球的近似形状，其厚度从最大的约270逐渐变小，由约0.00125 μg至约0.125μg的冠状病毒疫苗抗原组成。微突起的长度约为387
±
13 μm，宽度约为120
±
13 μm，厚度约为25.4
±
2.5 μm。微突起是矩形的，具有三角形尖端，以方便穿透。该尖端的角度为40
±
5度，长度约为165
±
25微米。这种技术的进一步例子在申请人拥有的美国专利公开号 us20190070103中描述。
61.产生所需穿透力的体积、长度和密度的确切组合将有所不同，并且可能取决于活性剂、其剂量、待治疗的疾病或状况以及给药频率。因此，特定阵列的活性剂递送效率（即递送到血流中的活性剂量）将在约40%至100%之间变化，或约40%，或约50%，或约60%，或约70%，或约80%，或约90%，或约100%。
62.2冲击式施加器如申请人拥有的美国专利公开号us20190070103的图4（a）-（b）、5（a）-（e）所示，本公开的皮内活性剂递送系统可进一步包括冲击式施加器，其具有主体和可在主体内移动的活塞，其中活塞的表面冲击贴片抵靠皮肤，导致微突起刺穿角质层。该施加器适于将微针阵列施加至角质层，其冲击能量密度在10毫秒或更短时间内至少为每平方厘米0.05焦耳，或在10毫秒或更短时间内约为每平方厘米0.26焦耳，或在10毫秒或更短时间内约为每平方厘米0.52焦耳。
63.如美国专利公开号us20190070103的图2（a）和2（b）所示，皮内递送系统包括贴片，该贴片在一个表面上具有粘合剂背衬，在另一个表面上具有由活性剂涂覆的微针阵列组成的光亮金属表面。该贴片可通过手动或优选通过施加器将光亮金属表面压在皮肤上而施加至皮肤。优选地，施加器在10毫秒或更短的时间内以每平方厘米0.26焦耳的冲击能量密度将贴片施加至皮肤。如美国专利公开号us20190070103的图2a、2b、3a和3b所示，贴片可与固定环结构连接并由其支撑，形成贴片组件。固定器环适于安装在冲击适配器上，并可拆卸地将贴片连接到施加器。固定环结构可以包括内环和外环，它们被设计来接收粘合剂贴片和微针阵列。美国专利公开号us20190070103的图5（a）-（e）展示了本发明的一个实施方案，在该实施方案中，用户便于将冲击式施加器连接到已经装有贴片和微针阵列的固定环。如图所示，一旦固定环和冲击式施加器连接起来，用户就可以通过转动施加器帽来解锁冲击式施加器。美国专利公开号us20190070103的图5（c）显示，用户可以在皮肤上向下按压施加器，以分配贴片并将其施加至皮肤。贴片将会可移除地附着在患者的皮肤上，而固定环仍然连接至施加器。如us20190070103的图4（a）和4（b）所示，固定环可逆地连接到冲击式施加器，使得冲击式施加器可以在随后的给药活动中与其他贴片组件重复使用，并可能用于其他活性成分和疾病状态。
64.在另一个实施方案中，贴片和施加器作为单一的、集成的单元提供，其包装可确保制剂的稳定性和无菌性。用户从包装中取出该系统，并如本文所述地施加贴片。然后将使用过的施加器丢弃在普通垃圾桶中。该实施方案提供了复杂性更低、更小、更轻和更容易使用的系统。
65.本公开也可与各种主动经皮系统（与本文所述的被动手动皮内递送装置相反）一起使用，因为本公开内容在这方面没有任何限制。
66.一些活性经皮系统利用电传输。说明性的电传输活性剂递送系统在美国专利号5,147,296、5,080,646、5,169,382和5,169,383中公开。一个广泛使用的电传输过程，即电泳，涉及带电离子的电诱导传输。电渗，是另一种类型的电传输过程，涉及不带电或带中性电的分子的经皮运输（例如葡萄糖的经皮采样），涉及溶剂与药剂在电场影响下通过膜的运动。电穿孔，同样是另一种类型的电传输，涉及药剂通过对膜施加电脉冲、高压脉冲而形成的孔。在许多情况下，上述过程中的一个以上可能在不同程度上同时发生。因此，术语“电传输”在此有最广泛的合理解释，包括至少一种带电或不带电的药剂或其混合物的电诱导或增强传输，而不考虑该药剂实际被传输的具体机制。
67.此外，任何其他传输增强方法，包括但不限于化学渗透增强、激光烧蚀、热、超声波或压电设备，都可以与本文的公开结合使用。
68.3作为活性剂的疫苗和生物相容性涂层施加至上述微突起构件以形成固体涂层的涂层制剂由液体组成，优选具有至少一种生物活性剂的水性制剂，该生物活性剂可以溶解在生物相容性载体内或悬浮在载体内。然后将该制剂涂覆在微突起上，干燥、灭菌和包装。该生物活性剂可以是流感疫苗或冠状病毒疫苗，例如sars-cov-2亚单位疫苗。
69.本公开包括至少78种确认的covid-19候选疫苗，其中5个已经进入临床试验（kalorama论文，同上）。在本发明中有用的冠状病毒疫苗的这种例子包括但不限于以下：1. 莫德纳（moderna）mrna-127.2. inovio制药（inovio pharmaceuticals）ino-4800.3. 深圳市免疫基因治疗研究院（shenzhen geno-immune medical institute）lv-smenp-dc疫苗.4. 康希诺生物（cansino biologics）ad5-ncov.5. 葛兰素史克（glaxo）与三叶草生物（clover biopharmaceuticals）的合作(covid-19 s-trimer)和与流行病防范联盟（coalition for epidemic preparedness）（cepi）的合作(molecular clamp).6. 赛诺菲（sanofi）与translate bio的合作.7. emergent biosolutions与vaxart的协议.8. seqiris mf59.9. 免疫反应生物制药（immune response biopharma）(irbp) ir101c.10. 强生（johnson & johnson）.11. 三菱田边（mitsubishi tanabe）/ medicago.12. 血清研究所（serum institute）与 codagenix 的合作.13. 武田（takeda）抗sars-cov-2多克隆超免疫球蛋白.
14. sengenics.15. akers biosciences.16. 匹兹堡大学（u. of pittsburgh）.17. inovio和ology biosciences.18. dynavax、clover合作.19. 爱荷华大学（u. of iowa）、乔治亚大学（u. of georgia）.20. applied dna和takis biotech.21. 赛诺菲（sanofi）和gsk.以下是针对covid-19的疫苗和本公开的一部分的更详细的总结。
70.为covid-19开发的选择疫苗（来源：kalomara，同上）
开发者疫苗平台阶段modernamrn-1273mrna1inovioino-4800dna1shenzhengeno-immunelv-smenp-dc covid-19aapc修饰的慢病毒载体病原体特异性aapc11cansinoad5-ncov重组2gsk/clovercovid-12-s-trimer蛋白质亚单位pcintellistemipt-001肽pccelularity/sorrentotherapeuticscynk-001细胞介导pcsanofi/barda 重组pcbharatbiotech/flugencoroflu自限性病毒pcnovavax 重组纳米颗粒pcvaxart/emergent 口服重组vaastpcseqirismf59佐剂pcirbprespiresponseir101c细胞介导pcdynavaxcpg1018佐剂pcgskas03佐剂pcj&j 非复制性病毒载体pcmedicago vlppcseruminst/codagenix 减活pctakedatak-888血浆来源pcaltimmune 非复制性病毒载体pccurevac mrnapcgenerex 蛋白质亚单位pcibio/beijingccpharming 蛋白质亚单位/植物pcimmunopreciseantibodies b细胞选择pclinearx/takis dnapctonixtnx-1800复制性病毒载体pcacturus engrnapcentosfusogenixdnapcheat 蛋白质亚单位pczyduscadila dnapcanges dnapcbiontech/pfizerbnt162mrnapcvbi 泛冠状病毒pcisrisr-50 pcskbiopharma
ꢀꢀ
pcsinovac dnapcgreffex 非复制性病毒载体pccobrabiologics dnapc
geovax/bravovax 非复制性病毒载体pcakers/premas d-cryptpcmodernamrn-1273mrna1inovioino-4800dna1shenzhengeno-immunelv-smenp-dc covid-19aapc修饰的慢病毒载体病原体特异性aapc11cansinoad5-ncov重组2gsk/clovercovid-12-s-trimer蛋白质亚单位pcintellistemipt-001肽pccelularity/sorrentotherapeuticscynk-001细胞介导pcsanofi/barda 重组pcbharatbiotech/flugencoroflu自限性病毒pcnovavax 重组纳米颗粒pc
本公开还涉及新的流感疫苗，例如novavax, inc.的nanoflu
™
，这是该公司的重组四价季节性流感候选疫苗，使用其专有的matrix-m
™
佐剂，用于65岁及以上的成年人（kalomara，同上）。
71.上述此类疫苗/抗原与本文所述的水性涂层制剂兼容，并可根据本文所述的方法以治疗有效量加载到微突起阵列上。
72.水性涂层制剂中的生物活性成分和赋形剂的浓度被仔细控制，以实现活性成分的所需量和可接受的涂层厚度，避免涂层制剂渗入至微针阵列的基部上，保持涂层的均匀性，并确保稳定性。在一个实施方案中，活性剂以约1% w/w至约60% w/w、或约15%至60% w/w、或约35%至45% w/w的浓度存在于涂层制剂中。
73.其他涂层制剂参数包括：
•ꢀ
疫苗抗原可以用二糖稳定，例如蔗糖或海藻糖，二糖与抗原的质量比约为0.5、1或2比1。其他可以使用的二糖是乳糖和麦芽糖，其量足以稳定蛋白质。
74.•ꢀ
涂层厚度为约50微米到约100微米。
75.•ꢀ
含有抗原或抗原组合的水性制剂的粘度可为约50至约300 cp。
76.•ꢀ
其他赋形剂包括酒石酸、柠檬酸和组氨酸。
77.•ꢀ
ph范围为4.4至7.4。
78.该制剂可进一步包括浓度在约0.1% w/w至约20% w/w之间的酸。这样的酸可以选自酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、抗坏血酸、乳酸、盐酸，可以单独或组合使用。在另一个实施方案中，在涂层制剂中，活性剂与酸的比例为约1:1，约2:1，约3:1，约4:1，或约55:1。本公开进一步包括一种涂层制剂，其包括约33% w/w的冠状病毒疫苗基部和约11% w/w的酒石酸。在一些实施方案中，该酸是酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸或马来酸中的一种，以约0.33%至10% w/w，或约8.33%至约16.67% w/w，或约13.33% w/w，或约15% w/w，或约6.67% w/w的量存在。在一些实施方案中，涂层制剂包括45% w/w的活性剂、15% w/w的酸、以及40% w/w的水。
79.疫苗/抗原可以以约1％w/w至约50％w/w的浓度存在于涂层制剂中，并且弱酸（酒石酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸）以约6.67％w/w至约16.67％w/w存在于涂层制剂中。
80.在某些实施方案中，本公开的涂层制剂不含防腐剂。
81.涂层制剂中可以包括表面活性剂。适合包含在涂层制剂中的表面活性剂包括但不限于聚山梨酯20和聚山梨酯80。表面活性剂通常被用来作为渗透增强剂改善活性剂的递送。然而，申请人发现，表面活性剂导致涂层制剂中的起伏，这表明薄膜不均匀，是非常不利
的。申请人发现，通过使用本发明——特别是通过本发明的冠状病毒疫苗或流感疫苗经皮递送贴片，可以避免对表面活性剂和其他渗透性增强剂的需求。此外，申请人出人意料地发现，微针涂层避免了吸水，尽管缺乏表面活性剂，但在微针阵列的制造过程中，涂层充分地粘附在微突起上。
82.抗氧化剂可以包括在涂层制剂中。适合包含在涂层制剂中的抗氧化剂包括但不限于蛋氨酸、抗坏血酸和edta。
83.涂层制剂进一步包括液体，优选水，其量足以（适量添加）使制剂在干燥到微针上之前达到100%。液体涂层制剂的ph可以低于约ph 8。在其他情况下，ph在约ph 3和7.4之间，或约ph 3.5到4.5。优选地，涂层制剂的ph低于约ph 8，更优选地，涂层制剂的ph在3和7.4之间。甚至更优选地，涂层制剂的ph在3.5和5.5之间。
84.根据本公开的液体涂层制剂通常表现出以足够的含量和形态持续地涂覆微针，并形成稳定的固态（干燥）制剂的能力，包含小于5%的水，优选小于3%。使用工程改造的涂覆机将液体制剂施加至微针阵列和其微突起尖端，其允许精确控制微突起尖端浸入液体膜的深度。合适的涂覆技术的例子在美国专利号6,855,37中描述，其全文通过引用在此引入本文。因此，液体的粘度在微突起构件涂覆过程中起着已描述的作用。参见ameri, m.; fan, s c.; maa, y f (2010); "parathyroid hormone pth(1-34) formulation that enables uniform coating on a novel transdermal microprojection delivery system;" pharmaceutical research, 27, pp. 303-313；另见ameri m, wang x, maa y f (2010); "effect of irradiation on parathyroid hormone pth(1-34) coated on a novel transdermal microprojection delivery system to produce a sterile product adhesive compatibility;" journal of pharmaceutical sciences, 99, 2123-34。
85.包含冠状病毒疫苗的涂层制剂具有小于约500厘泊（cp）和大于3 cp，或小于约 400 cp和大于10 cp，或小于约300 cp和大于50 cp，或小于250 cp和大于约100 cp的粘度。在一些实施方案中，液体制剂在涂覆前的粘度为至少20c p。在其他实施方案中，粘度为约25 cp，或约30 cp，或约35 cp，或约40 cp，或约45 cp，或约50 cp，或约55 cp，或约60 cp，或约65 cp，或约70 cp，或约75 cp，或约80 cp，或约85 cp，或约90 cp，或约95 cp，或约100 cp，或约150 cp，或约200 cp，或约300 cp，或约400 cp或约500 cp。在其他实施方案中，粘度为大于约25 cp，或大于约30 cp，或大于约35 cp，或大于约40 cp，或大于约45 cp，或大于约50 cp，或大于约55 cp，或大于约60 cp，或大于约65 cp，或大于约70 cp，或大于约75 cp，或大于约80 cp，或大于约85 cp，或大于约90 cp，或大于约95 cp，或大于约100 cp，或大于约150 cp，或大于约200 cp，或大于约300 cp，或大于约400 cp，或少于约500 cp。在一个优选的实施方案中，涂层制剂的粘度大于约80 cp，小于约350 cp；在另一个优选的实施方案中，粘度大于约100 cp，小于约350 cp；以及，在另一个优选的实施方案中，粘度大于约100 cp，小于约250 cp。
86.一旦施加至微突起，涂层制剂可具有从微突起表面测量的约10至约400微米，或约30至约300微米，或约100微米至约175微米，或约115至约150微米，或约135微米的平均厚度。尽管优选的是涂层制剂具有覆盖微突起的均匀厚度，但由于制造工艺的原因，制剂可能略有变化。由于微突起穿透角质层，所以大体上被均匀地涂覆。在一些实施方案中，微突起并不是在从尖端到基部的整个距离上都被涂覆；相反，涂层覆盖微突起长度的一部分，从尖
端到基部测量的微突起长度的至少约10%至约80%、或20%至约70%、或约30%至约60%、或约40%至约50%。
87.液体涂层制剂被施加至微突起的阵列，从而以每个阵列约1 mcg至约500 mcg的量提供活性剂的剂量。在冠状病毒疫苗的情况下，剂量为约5 mcg至约500 mcg、或约25 mcg至约500 mcg递送到每个阵列的角质层（通过贴片或其他形式）。微突起的形状和大小对活性剂的装载能力和活性剂的递送效果有很大的影响。
88.在一个方面，水性疫苗制剂通过（a）渗滤（diafiltration）/浓缩；（b）冻干；和（c）重组进行预配制。
89.在重组之后，水性疫苗制剂被干燥到微突起上成为固体涂层，通常通过在微突起上干燥涂层制剂，如美国申请公开号2002/0128599中描述的。该涂层制剂通常是水性制剂。在干燥过程中，包括水在内的所有挥发物大多被去除；然而，最终的固体涂层可能仍然含有约1% w/w的水、或约2% w/w的水、或约3% w/w的水、或约4% w/w的水、或约5% w/w的水。通过使用干燥的惰性气氛和/或部分真空，减少制剂中存在的氧气和/或水的含量。在微突起阵列的固体涂层中，活性剂抗原可以以低于每单位剂量（贴片）约500 mcg或低于约400 mcg或低于约300 mcg或低于约200 mcg或低于约100 mcg的量存在。加入赋形剂后，固体涂层的总质量可以低于每单位剂量约5 mg，或低于每单位剂量约2 mg。
90.微突起构件通常存在于粘合剂背衬上，该背衬连接到可丢弃的聚合物固定环。该组件被单独包装在小袋或聚合物外壳中。除了组件之外，该包装还包含死体积（dead volume），其代表至少3 ml的体积。这个大体积（与涂层的体积相比）充当水的部分水槽。例如，在20℃时，由于其蒸汽压的作用，在3 ml的大气中存在的水量在饱和状态下约为0.05 mg，这通常是干燥后存在于固体涂层中的残留水量。因此，储存在干燥的惰性气氛中和/或部分真空中会进一步减少涂层的水含量，从而提高稳定性。
91.根据本公开，涂层可以通过各种已知的方法施加到微突起上。例如，涂层可以只施加于微突起构件或微突起的刺入皮肤的部分（例如，尖端）。然后对涂层进行干燥，形成固体涂层。一种这样的涂覆方法包括浸涂（dip-coating）。浸涂可以被描述为通过部分或完全将微突起浸入涂层溶液中来涂覆微突起的方法。通过使用部分浸泡技术，有可能将涂层限制在微突起的尖端。
92.进一步的涂覆方法包括辊涂（roller coating），它采用辊涂机构，同样地将涂层限制在微突起的尖端。辊涂方法在美国申请公开号2002/0132054中公开。正如其中详细讨论的那样，所公开的辊涂方法提供了光滑的涂层，在皮肤穿刺过程中不容易从微突起脱离。
93.在本发明范围内可采用的另一种涂覆方法包括喷涂（spray coating）。喷涂可以包括形成涂层组合物的气溶胶悬浮液。在一个实施方案中，将具有约10至200皮升的液滴大小的气溶胶悬浮液喷到微突起上，然后进行干燥。
94.也可以采用图案涂布（pattern coating）来涂覆微突起。图案涂布可以使用用于将沉积的液体定位到微突起表面的分配系统来应用。沉积的液体的数量优选为0.1至20纳升/微突起。合适的精确计量的液体分配器的例子在美国专利号5,916,524、5,743,960、5,741,554和5,738,728中公开。
95.也可以使用喷墨技术来施加微突起涂层制剂或溶液，其使用已知的电磁阀分配器、任选的液体动力装置和定位装置，该装置通常通过使用电场进行控制。来自印刷业的其
他液体分配技术或本领域已知的类似液体分配技术可用于施加本发明的图案涂层。
96.在本公开的一个实施方案中，包含冠状病毒疫苗或流感疫苗的干燥涂层制剂的厚度为从微突起表面测量约10至100微米、或约20至80微米、或约30至60微米、或约40至50微米。所需的涂层厚度取决于几个因素，包括所需的剂量（因此也包括递送该剂量所需的涂层厚度）、板的每单位面积上的微突起的密度、粘度、涂层组合物的溶解度和浓度以及所选择的涂覆方法。施加至微突起的涂层厚度也可以进行调整，以优化冠状病毒疫苗的稳定性。已知的制剂佐剂也可以添加到涂层制剂中，只要它们不对涂层制剂必要的溶解度和粘度特性以及干燥涂层的物理完整性产生不利影响。
97.将涂层施加至微针，其从微针阵列的基部或街道突出。将涂层施加至微针的尖端，并且不旨在覆盖微针和微针阵列的表面。这减少了每个经皮贴片的活性剂的量，鉴于fda关于经皮递送系统上残留活性剂的危险性的指导意见，这是有利的，该指导意见建议应尽量减少系统中残留的活性剂的量。参见fda guidance for industry, residual drug in transdermal and related drug delivery systems（2011年8月）。申请人的策略是在不使用过量的活性剂进行涂覆的情况下，最大限度地将活性剂释放到每单位面积的皮肤中。
98.在施加涂层后，通过各种方法将涂层制剂干燥到微突起上。经涂覆的微突起可以在环境室条件下进行干燥。然而，可以使用各种温度和湿度来将涂层制剂干燥到微突起上。此外，可以对经涂覆的构件进行加热、在真空下或在干燥剂上储存、冻干、冷冻干燥或用于去除涂层中的残留水分的类似技术。
99.在环境温度下，利用辊筒，以50 rpm的速度旋转，在活性剂制剂储存器（体积为2 ml）中进行涂覆，以产生厚度约为50至100 μm的可控厚度的薄膜。有关该涂覆工艺的进一步信息可在美国专利号6,855,372中找到。将微突起阵列浸入活性剂薄膜中，涂层的量由浸入（穿过）活性剂薄膜的次数控制。
100.在干燥过程中，可能会出现与形成具有受控和一致厚度的微突起的均匀涂层有关的问题。在经皮贴片涂层中的一个常见的问题（称为“滴水”或“泪滴”形成），发生在涂层干燥时，涂层在微突起的末端积累成“泪滴”形状。这种泪滴状会使微针的尖锐末端变钝，有可能影响到穿刺的有效性和均匀性。微针上不均匀的制剂层会导致活性剂递送不均匀，有时甚至不充分。此外，干燥过程中的问题导致制剂涂层的质量控制问题。
101.液体涂层制剂包括：冠状病毒疫苗/抗原或流感疫苗/抗原，其量为约10至约1000微克ha/毫升、或约25至约500微克ha/毫升、或量为0.001% w/w至约30% w/w、或约0.01% w/w至约25% w/w、或约0.1% w/w至约10% w/w，以及酒石酸，其量为约5% w/w至约25% w/w、优选约10% w/w至约20% w/w、更优选约15% w/w，置于液体载体中，该载体优选水，更优选去离子水。使用这些液体涂层制剂，保持约150 cp至约350 cp、优选约200 cp至约300 cp、更优选约250厘泊的粘度，以及约50 mnm-1
至约72 mnm-1
、优选约55 mnm-1
至约65m mnm-1
，更优选约62.5 mnm-1
的表面张力，可以防止滴水。可以避免泪滴的形成，同时使每次浸入液体涂层制剂的微突起能够吸取足够体积的液体涂层制剂，从而以最少的浸入次数达到所需的活性剂剂量。当涂层溶液的粘度和表面张力足够高时，涂层液体在浸泡后和干燥前不会迅速滴回或形成泪滴状。
102.4包装和灭菌改进的干燥的涂层制剂的物理稳定性不仅提供了增加治疗剂本身的储存或保存
期的好处，而且提高了疗效，因为一旦按照本发明的组合物以及配制和递送方法进行稳定，治疗剂将在更大范围的可能制剂中发挥作用，并使用更多种类的治疗剂递送手段。
103.本公开包括活性剂制剂，其中通过在干燥的惰性气氛中制造和/或包装活性剂制剂，氧气和/或水的劣化被最小化和/或控制。该制剂可以在干燥剂的存在下包含在干燥的惰性气氛中，任选地在包括箔层的腔室或包装中。
104.干燥剂可以是本领域技术人员已知的任何一种。一些常见的干燥剂包括但不限于分子筛、氧化钙、粘土干燥剂、硫酸钙和硅胶。干燥剂可以是在惰性气体存在的情况下与含有生物活性剂的制剂一起放置在包括箔层的包装中的干燥剂。
105.在另一个方面，在将制剂涂覆到微突起阵列递送装置上之后，将活性剂制剂包装在包括箔层的腔室中。在该实施方案中，干燥剂包含在腔室中，优选连接到由箔层组成的腔体盖上，并且用干燥的氮气或氩气或其他惰性气体（例如惰性气体）吹扫（purge）该腔室，然后用箔盖密封包含递送装置的箔腔室。这里可以使用任何合适的惰性气体来创造干燥的惰性气氛。
106.在一个实施方案中，用于配制和递送适合皮内递送的冠状病毒疫苗的组合物和方法利用贴片组件。该贴片组件在干燥的惰性气氛中并在有干燥剂的情况下制造和/或包装。在一个实施方案中，贴片组件在干燥的惰性气氛中制造和/或在包括箔层并且具有干燥的惰性气氛和干燥剂的腔室中包装。在一个实施方案中，贴片组件是在部分真空中制造和/或包装的。在一个实施方案中，贴片组件是在干燥的惰性气氛和部分真空中制造和/或包装的。在一个实施方案中，贴片组件在部分真空下的干燥惰性气氛中制造和/或在包括箔层并具有干燥惰性气氛、部分真空和干燥剂的腔室中包装。
107.一般来说，在本发明的所述实施方案中，惰性气氛应具有基本零水含量。例如，水含量基本为零的氮气（干氮气）可以通过电控沸腾的液氮来制备。吹扫系统也可用于减少水分或氧气含量。部分真空的范围是约0.01至约0.3个大气压。
108.在一个实施方案中，配制和递送适合使用微针递送装置进行皮内递送的冠状病毒疫苗的组合物和方法，是在干燥的惰性气氛（优选氮气或氩气）中以及在干燥剂或氧气吸收剂的存在下制造和/或包装的。
109.在一个实施方案中，配制和递送适合使用微针递送装置进行皮内递送的疫苗的组合物和方法，是在具有干燥的惰性气氛（优选氮气）和干燥剂或氧气吸收剂的衬箔腔室中制造和/或包装的。
110.在一个实施方案中，配制和递送适合使用微针递送装置进行皮内递送的疫苗的组合物和方法，是在部分真空中制造和/或包装的。
111.在一个实施方案中，配制和递送适合使用微针递送装置进行皮内递送的疫苗的组合物和方法，是在具有干燥惰性气氛（优选氮气）、部分真空和干燥剂或氧气吸收剂的衬箔腔室中制造和/或包装的。
112.在本实施方案的一个方面，疫苗进一步包括生物相容性载体。在另一个实施方案中，存在一种适于递送疫苗的皮内递送系统，其包括：（a）微突起构件，其包括适于刺穿患者的角质层的多个微突起；（b）包含冠状病毒疫苗的水凝胶制剂，其中水凝胶制剂与微突起构件连通；以及（c）密封在微突起构件周围的用惰性气体吹扫并适于控制环境条件的包装，其中经密封的包装已被暴露至辐射以对微突起构件进行灭菌。
113.在另一个实施方案中，存在一种适于递送疫苗的皮内递送系统，其包括：（a）微突起构件，其包括适于刺穿患者的角质层的多个微突起；（b）布置在微突起构件附近的固体膜，其中所述固体膜是通过浇注（cast）液体制剂制成的，该液体制剂包括疫苗、聚合材料、增塑剂、表面活性剂和挥发性溶剂；以及（c）密封在微突起构件周围的用惰性气体吹扫并适于控制环境条件的包装，其中经密封的包装已被暴露至辐射以对微突起构件进行灭菌。
114.本公开还涉及一种对适于递送疫苗的贴片组件进行最终灭菌的方法，包括以下步骤：（a）提供微突起构件，其具有适于刺穿患者的角质层的多个微突起，所述微突起具有包含置于微突起构件上的冠状病毒疫苗的生物相容性涂层；以及（b）将微突起构件暴露于选自伽马辐射和电子束的辐射，其中该辐射足以达到所需的无菌保证水平。这种无菌保证水平可以是10-6
或10-5
。该方法可进一步包括将微突起与干燥剂一起密封在用惰性气体吹扫的包装内，并将包装好的微突起暴露于选自伽马辐射和电子束的辐射，其中该辐射足以达到所需的无菌保证水平。
115.在本实施方案的一个方面，该方法进一步包括以下步骤：将包括附着在粘合剂背衬上的微突起构件的贴片安装在预干燥的固定环上以形成贴片组件，并随后将微突起构件密封在包装内。在本实施方案的一个方面，该系统进一步包括与贴片组件一起密封在包装内的干燥剂，和/或用氮气吹扫包装，和/或包装包括由箔层组成的袋。优选地，该箔层包括铝。
116.将微突起构件暴露于辐射的步骤可以在大约-78.5至25℃下发生，或者该构件可以在环境温度下暴露于辐射。辐射可以在大约5至50 kgy、或大约10至30 kgy、或大约15至25 kgy、或大约21 kgy、或大约7 kgy的范围内。在本实施方案的一个方面，辐射以至少约3.0 kgy/hr的速率递送到微突起构件。
117.在一个实施方案中，疫苗涂覆的微针暴露于约7-30 kgy范围内的辐射剂量。更优选地在15-30 kgys的范围内，达到10-5至10-6的无菌保证水平。
118.本公开涉及疫苗制剂，其当涂覆在本公开的微针构件上时，在如上所述被暴露于辐射后，在室温下稳定至少6个月、或至少9个月、或至少12个月、或至少18个月、或至少24个月。
119.在某些实施方案中，微针上的干燥的疫苗制剂在至少6个月内保持约100%的初始纯度，或约99%的初始纯度，或约98%的初始纯度，或约97%的初始纯度，或约96%的初始纯度，或约95%的初始纯度，或约90%的初始纯度。在其他方面，这种纯度在包装后至少保留9个月，或至少12个月，或至少18个月，或至少24个月。
120.在一个实施方案中，一种用于制造适于递送疫苗的皮内递送装置的贴片组件的方法，包括以下步骤：提供具有适于穿透或刺穿患者的角质层的多个微针的微针构件，所述微针具有置于微针构件上的生物相容性涂层，该涂层由置于其上的具有疫苗、二糖和酒石酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸的涂层制剂形成；将微针构件与干燥剂一起密封在用氮气吹扫并适于控制微针周围的环境条件的包装内，并将微针构件暴露于选自伽马辐射、电子束和x射线的辐射中，其中该辐射足以达到所需的无菌保证水平。
121.根据本发明的另一个实施方案，一种用于递送稳定的生物活性剂制剂的方法包括以下步骤：（i）提供具有多个微突起的微突起构件；（ii）提供生物活性剂的稳定化制剂；（iii）形成包括稳定化生物活性剂制剂的生物相容性涂层制剂，（iv）用生物相容性涂层制
剂涂覆微突起构件以形成生物相容性涂层；（v）通过干燥使生物相容性涂层稳定化；以及（vi）将经涂覆的微突起构件施加至对象的皮肤。
122.此外，药剂的最佳稳定性和保存期是通过固体和基本干燥的生物相容性涂层实现的。然而，涂层溶解和药剂释放的动力学可以根据一些因素的不同而明显地变化。可以理解的是，除了具有储存稳定性外，生物相容性涂层应允许治疗剂的理想释放。
123.此处包含一种对适于递送冠状病毒疫苗的经皮装置进行最终灭菌的方法，包括以下步骤：提供微突起构件，其具有适于穿透或刺穿患者的角质层的多个微突起，所述微突起具有置于微突起构件上的生物相容性涂层，该涂层由具有置于其上疫苗的涂层制剂形成；以及将微突起构件暴露于选自伽马辐射和电子束的辐射，其中该辐射足以达到所需的无菌保证水平。该方法的另一个方面包括进一步的步骤：将微突起构件密封在适于控制微突起构件周围的环境条件的包装内。在一个方面，该包装包括箔袋。该方法的另一个方面包括将干燥剂密封在包装内的进一步步骤。此外，该方法还包括以下步骤：在将微突起构件密封在包装内之前，将微突起构件安装在预先干燥的固定环上。该方法的另一个方面包括在密封包装之前用惰性气体吹扫包装的步骤。在一个实施方案中，该惰性气体包括氮气。
124.b治疗方法本发明的活性剂-装置组合可用于治疗各种疾病和病症，包括针对covid-19、其他冠状病毒和流感的疫苗接种。患者可以通过使用本文其他地方描述的施加器装置，自我施用包含约5 mcg至约500 mcg的疫苗/抗原的疫苗涂覆的微阵列贴片。贴片被施加至选定的皮肤区域，一般是平坦的，没有多余的毛发，例如上臂、靠近手腕、大腿、胸部或背部。贴片佩戴时间可以是约1分钟到约30分钟，或约5分钟到约20分钟，或约10分钟。此后，患者取下贴片并将其丢弃到垃圾桶中。
125.患者可以从医生的办公室、药房、通过邮件或从雇主那里获得贴片。该贴片不需要冷藏，用于一次性使用，而且是可丢弃的，不需要利器生物容器等。
126.在一个实施方案中，当本公开的疫苗贴片被施用于患者群体时，统计学上显著的数量的此类患者被成功接种。在其他实施方案中，至少10%的此类患者得到了血清保护（seroprotected），或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%的此类患者得到了血清保护。
127.在其他方面，与im或sc可注射对应疫苗相比，本文所述的疫苗涂覆的贴片是节省剂量的。例如，与im或sc可注射对应疫苗相比，本文的贴片需要至少5%、或至少10%、或至少20%、或至少30%更少的疫苗/抗原。
实施例
128.实施例1——能够将稳定的三价流感疫苗涂覆在经皮微突起贴片上的制剂方法如下所述，成功开发了三价流感疫苗经皮贴片，其与三价流感疫苗肌肉内（im）注射制剂相比具有三个关键优势：（1）不含防腐剂；（2）室温储存；以及（3）节省剂量。更重要的是，这种贴片系统在临床前和临床研究中被证明是稳定和有效的。
129.三价流感疫苗，具有两种a型和一种b型流感病毒株，对每一种毒株具有15微克的血凝素（ha）作为表面抗原，目前以两种制剂在美国上市，一种是灭活的可注射形式（fluzone
®
，赛诺菲巴斯德；fluvirin
®
，诺华疫苗；fluvarix
®
和flulavaltm，葛兰素史
克；afluria
®
，csl），另一种是减毒活鼻腔喷雾剂（flumist
®
，medimmune）。三价可注射形式作为由三个单独的单价流感病毒株制备的无菌悬浮液而提供，通过常规的针头和注射器进行施用，由于与利器相关的不稳定安全问题，可能会造成不理想的疼痛和增加成本。此外，液体可注射产品必须在冷藏条件下储存，在整个生产过程中需要昂贵的冷链储存。为了达到无菌的目的，可注射制剂可能含有汞基硫柳汞作为多剂量瓶的防腐剂。尽管flumist
®
鼻腔喷雾剂提供了针头/注射器注射的替代方案，但它的特点仍然是液体制剂，需要在2-8℃下进行冷链储存。总的来说，非常需要寻求无针流感疫苗免疫替代品，其能够在无冷链储存中提供额外的成本效益，并在无防腐剂的剂型中增加安全性。
130.皮肤含有丰富的抗原呈递细胞（apc）：可行的表皮中的朗格汉斯细胞（lc）和真皮中的树突状细胞。apc在采集皮肤中的抗原、迁移到引流淋巴结、并将处理过的抗原递呈给cd8+和cd4+t辅助细胞方面起着关键作用。因此，正如现在通过本公开可以理解的，通过皮肤途径的疫苗接种，即经皮免疫，使剂量节约成为可能，这为患者的安全和成本节约进一步增加了好处。皮肤免疫系统的有效性是疫苗接种策略成功和安全的原因，该策略已经靶向皮肤，其通过皮内接种减毒天花活疫苗和狂犬病疫苗，使用标准肌肉内剂量的五分之一到十分之一。
131.上述所有需求导致了用于三价流感疫苗的新型经皮微突起贴片递送系统的开发。这种经皮微突起递送系统能够穿透皮肤浅层屏障，而没有疼痛或不便之处。小的药物涂覆的贴片面积为5 cm2，密封在贴片固定环上。贴片是用可重复使用的手持式施加器（图1a）施用的。贴片包括钛微突起阵列（图1b中每2 cm2约1,300个微突起），其连接到粘合剂背衬的中心。疫苗制剂被涂覆在每个微突起的尖端。贴片和固定环压在皮肤上。涂覆有药物的微突起穿透浅层皮肤屏障层进入表皮/真皮层（深度为50-150微米），在那里疫苗制剂迅速溶解并释放到皮肤中。
132.重新配制疫苗主体（bulk），即当前的液体可注射产品，并使用要求高疫苗浓度和其他物理特性（如下所述）的新型涂覆工艺放置在微突起阵列上。单价流感病毒株是低浓度的液体，其配方复杂，是复杂的疫苗制造过程的结果。每一株流感病毒都是在胚胎鸡卵的尿囊液中繁殖的。从尿囊液中，对流感病毒颗粒进行浓缩、纯化，用洗涤剂（triton x-100）破坏，然后通过添加甲醛和/或脱氧胆酸钠进行灭活，从而为三个毒株中的每一个产生“分裂病毒”或“分裂病毒粒”。将灭活的病毒株悬浮并合并到三价溶液中，其在整个生产和运输过程中必须在冷藏条件下储存。硫柳汞或2-苯氧基乙醇（2-pe）通常被添加到多剂量瓶中作为防腐剂。因此，疫苗主体可能含有不溶性颗粒（不溶于水的脂类、脂类-蛋白质复合物和聚集的蛋白质）、triton x-100、低分子量化合物和缓冲剂。
133.本实施例1描述了能够将疫苗浓度提高200-500倍的预配方和配方工艺，并定义了制造贴片递送系统的关键涂覆参数。对涂覆有不含防腐剂的三价流感疫苗的贴片进行了长期稳定性评估，并在临床前和i期人体临床试验中进行了测试，以证明无冷链、室温储存的可行性和与肌肉内给药途径相比节省剂量的免疫原性性能。
134.材料和方法材料单价分裂病毒的流感病毒菌株提取物来自于卵孵化。每种单价毒株溶液在使用前都如下面“方法”部分所述经过进一步处理。蔗糖（批号27412a，高纯度低内毒素级）和海藻
糖（批号26554a，高纯度低内毒素级）购自ferro-pfanstiehl（cleveland, oh），并按收货状态使用。表面活性剂购自几个供应商，并按收货状态使用——tween 80，批号58217（icn biomedicals inc., aurora, oh）；zwittergent 3-14，批号b36399（calbiochem, san diego, ca）；triton x100，批号qc2755s4d1（89521）（union carbide corporation, houston, tx）；pluronic f68，批号16h1147（sigma，st. louis, mo）。
135.贴片递送系统由2 cm2的钛阵列的微突起（kemac, azusa, ca）组成，共有1300个微突起，其中微突起的长度为225微米，微突起头部的长度和宽度分别为100微米和115微米，尖端角度为60度（见图1d）。递送系统还包括聚碳酸酯环（jatco, union city, ca）、5 cm2的粘合剂贴片（medical tape 1523, 3m, st. paul, mn），以及铝箔袋（mangar, new britain, pa）。
136.方法流变测定使用锥体和平板粘度计（brookfield eng. lab., cap 2000）测定浓缩的涂层制剂的粘度。每次测量需要70
ꢀµ
l的液体样品。每个液体样品的粘度是在几个剪切率和几个温度下测定的。
137.接触角测量使用基于半角测量法的接触角测量仪（tantec inc., schaumberg, il），通过将5
ꢀµ
l的液滴置于金属钛片上，确定涂层制剂和钛基底之间的接触角。
138.扫描电子显微镜（sem）使用sem来确定涂层在微突起上的形态和位置。用碳素双粘带将经涂覆的钛阵列粘在铝钉上，并置于sem（日立，s-2460n）的真空室中。
139.单辐射免疫扩散法（srid）单一径向免疫扩散法适用于量化起始材料、涂覆溶液和经涂覆阵列中的流感ha含量。在这种被动扩散方法中，在用洗涤剂处理后，样品溶液和参考疫苗从孔中径向扩散，并与均匀分散在凝胶基质中的特定抗体发生反应。抗原-抗体的相互作用表现为在抗原（ha）孔周围出现确定的沉淀环。该环的直径将继续增加，直到达到平衡。在平衡条件下，沉淀物环的直径与ha的浓度成正比。完全扩散后，测量每个样品溶液和参考疫苗的沉淀圈。样品中的血凝素含量是根据流感参考中心提供的国际参考标准确定的，并以
µ
g/ml为单位进行校准。
140.酶联免疫吸附试验（elisa）开发了一种间接elisa方法来检测无毛豚鼠（hgp）血清中抗流感特异性抗体的存在。先前，开发了一种间接elisa方法来确定用卵清蛋白涂覆的阵列免疫的hgp的抗卵清蛋白抗体滴度。对于流感疫苗涂覆的阵列，开发了一种类似的检测方法，专门确定用流感疫苗免疫的hgp血清的终点滴度。终点滴度被定义为通过非线性回归确定的免疫hgp血清样本的反稀释度，其od值比非免疫对照hgp血清的平均od值高出三个标准差（n = 10）。
141.双孢菌素试验（bca）使用购自pierce的试剂盒（rockford, ill），通过bca测定法，测量原材料、涂覆溶液和涂覆阵列的蛋白质含量。直接从疫苗原料中制备一组连续稀释的标准品。未知样品用水稀释，使其浓度在检测的标准工作范围内。将标准品和样品装入96孔板，并放入平板阅读
器（molecular devices，spectramax 250），摇动30秒，并在37℃下孵育30分钟。在562 nm处测量吸光度，将标准品的平均值拟合到以下形式的4参数方程中。
142.。
143.lowry检测法一些样品的总蛋白含量是通过改良的lowry检测法测量的，使用牛血清白蛋白（bsa）作为蛋白标准。lowry方法是基于蛋白质与铜离子反应后形成的蓝色复合物，以及随后蛋白质-铜复合物对folin-ciocalteau试剂的还原。蓝色的强度与样品中存在的蛋白质的量成正比，并在750 nm处用分光光度计测量。
144.sds-page/蛋白质印迹在invitrogen预铸nupage凝胶上通过sds-page分离流感疫苗ha蛋白样品。根据xcell ii印迹模块“novex western transfer apparatus”（invitrogen）的使用说明，将分离的蛋白质印迹到pvdf膜上。用稀释的抗ha一抗或抗ha抗血清对印迹的pvdf膜进行检测。非特异性结合位点用pbs与5%牛奶加0.1%吐温20阻断。使用hrp结合的二抗和amersham pharmacia公司的ecl检测试剂对蛋白质印迹进行可视化。
145.triton-x 100的测定表面活性剂triton-x 100的浓度在液体样品中通过两种方法测量，一种是比色法，另一种是hplc法。比色法包括与钴硫氰酸铵形成复合物，形成蓝色沉淀。然后将沉淀物提取到二氯化乙烯中，用分光光度法测量吸光度。hplc方法是一种反相法，使用c4柱和线性乙腈梯度。
146.切向流过滤（tff）使用两种类型的tff系统来对分裂病毒粒流感提取物进行渗滤和浓缩：实验室规模的tff系统（millipore，labscale）配备有pellicon xl再生纤维素膜（millipore，50 cm2，30kd mwco），更大规模的tff系统（pall，centrematetm）配备有0.1 ft2 30 kd mwco聚醚砜pes薄膜。采用切向流过滤作为第一步，以去除盐和其他低分子量物种，作为丰富单价菌株的ha含量的一种方式。使用注射用无菌水来通过渗滤去除低分子量物质。为了有效地去除存在于单价菌株中的表面活性剂（例如triton x-100），采用了额外的tff清洗步骤。这个清洗步骤包括在使用
¼ꢀ‑ꢀ
10渗滤体积（diavolume）的无菌注射水进行浓缩之前进行渗滤。渗滤和清洗后，每个疫苗溶液的体积被减少到原来体积的1/20-1/50，使ha浓度增加到5-10 mg ha/ml。这是疫苗通过tff浓缩可以有效浓缩到的浓度极限。由于背压的增加，很可能是由于溶液中的不溶性颗粒对膜造成的污损，因此不可能通过tff进一步浓缩单价菌株（见讨论部分）。tff系统的ha浓缩物的回收率很高，通常大于95%，这是由bca蛋白质测定和浓缩前后的srid效力决定的。在tff浓缩后，对单价菌株进行收集、配制，然后冻干，作为进一步增加ha浓度的手段。
147.冻干为了临床前研究，在tff浓缩后，将单价菌株装入20 ml的玻璃瓶中，用液氮闪冻，并放置在歧管式冷冻干燥机（virtis，25el freezemobile）上。溶液被允许冻干2-5天，直到室压达到稳定状态（~50 mtorr）。对于i期材料的临床生产，将5 ml配制好的tff浓缩液装入20 ml的玻璃瓶中，在stoppering托盘干燥机（labconco, freezezone）中冻干。冻干后的回
收率也很高（》90%），这是由bca蛋白质测定和重组冻干粉的srid确定的。
148.ha纯度的测定单价疫苗主体的ha纯度是相对于溶液中的总蛋白和总固体而确定的。单价疫苗主体的总蛋白是使用牛血清白蛋白为参考标准，用lowry检测法测定的。然后通过将样品中已知的ha含量除以测量的总蛋白来计算相对于总蛋白的ha纯度%。相对于总固体的ha纯度%是通过如下方法确定的：将单价疫苗主体的一部分蒸发至干，以确定溶液中存在的固体总重量，并将该值除以样品的已知ha含量。
149.为了估计通过tff纯化后固体中的ha纯度%，将10 ml的单价疫苗主体在过滤装置（centricon，millipore）中浓缩大约10倍。然后用两份10 ml体积的纯化水对浓缩物进行清洗和重新浓缩，以去除残留的加工盐和原料中存在的其他低分子量物质。然后将浓缩物蒸发至干，将剩余固体的干重划除以样品中存在的ha量。
150.在冻干过程之后，通过称量冻干粉末的一部分，并在用纯水重组之后用srid进行分析，重新评估ha纯度%。
151.微突起阵列和涂层钛微突起阵列是通过光/化学蚀刻制造的，并使用受控的制造工艺形成。参见，例如，ep0914178b1。
152.在环境温度下，利用辊筒，以50转/分的速度旋转，在药物制剂储存器（体积为2 ml）中进行涂覆，以产生厚度控制在约100微米的薄膜。将微突起阵列浸入薄膜中，涂层的量由浸入（通过）药物薄膜的次数控制。每次浸泡之间的时间约为5秒，这足以在环境条件下干燥涂覆的液体制剂。
153.结果和讨论涂层的制剂参数这种新型的经皮微突起贴片系统的特点是在微突起阵列上涂覆有固态制剂。 因此，开发能够实现涂覆过程的液体配方是稳定的、提高性能的固态制剂的先导。
154.制备了一种液体制剂，主要满足三个关键的涂层制剂参数——疫苗浓度、粘度和表面活性。更具体地说，具有高疫苗浓度和足够高的粘度的液体制剂是有利的（但不一定是必须的），以确保每次浸入液体制剂的微突起能吸取足够体积的液体进行干燥，这样可以用最少的浸入次数达到所需的疫苗剂量。涂覆溶液的粘度必须足够高，使得涂覆溶液在浸泡后但在干燥前不会迅速滴回。同样重要的是药物涂层储存器中液体制剂的牛顿行为，即恒定的粘度相比于剪切率，因为涂覆过程涉及与辊筒的一定程度的剪切力。表面活性是在液体制剂和钛表面之间建立亲水界面的一个方面，它可以通过接触角测量来量化。优选的接触角是30度至60度（参考水和钛表面之间70度至80度的接触角）。如果疫苗制剂对钛表面没有足够的亲水性，通常需要使用表面活性剂。
155.此外，提高疫苗（抗原）的纯度，即减少制剂中的非免疫原性贡献化合物的量，是一个重要的考虑因素，因为制剂被涂覆在微突起，其表面积有限。沉积在微突起的过多制剂可能会使微突起变钝，阻碍皮肤渗透。上述设计变量指导了下文所述的预配制/配制方法。
156.单价主体溶液每个疫苗主体溶液在收到时都是浑浊的，表明存在不溶性颗粒，可能是由于不溶于水的脂类、脂类-蛋白质复合物和聚集的蛋白质。主体溶液中的血凝素抗原（ha）浓度很
低，约为0.1
ꢀ‑ꢀ
0.2 mg/ml，而且ha的纯度不一，通常为总固体（低分子量溶质、蛋白质和不溶性颗粒）的20
ꢀ±ꢀ
5%和总蛋白质含量（ha和非ha蛋白）的40
ꢀ±ꢀ
10%。为了将ha抗原涂覆在微突起阵列上，需要重新配制主体溶液以提高ha浓度和纯度。由于非ha蛋白和颗粒可能有助于免疫学反应，所以只能通过去除低分子量材料来提高ha纯度，这些材料包括缓冲剂、盐和表面活性剂，例如triton-x 100（在疫苗生产过程中用于分割病毒颗粒）。低分子量物质的去除是通过渗滤来完成的。
157.切向流过滤（tff）过程在含有30 kd膜的tff系统中，单价主体溶液最初被浓缩，使其体积减少到原体积的1/20-1/50，并用10渗滤体积的10 mm磷酸盐缓冲液清洗。然而，这个过程导致ha纯度%略有增加（增加《15%），而triton-x 100（mw为625 道尔顿）的浓度显著增加。更高分子量的triton-x 100胶束的形成是这个过程未能有效去除triton-x 100的原因。
158.已知triton-x 100在临界胶束浓度（cmc）为0.13-0.56 mg/ml时可形成分子量为80,000道尔顿的胶束。单价主体溶液通常含有0.1-0.3 mg/ml的triton-x 100，这比ha的浓度高，已经接近或达到其cmc。因此，最初的浓缩步骤使triton-x 100远远超过了它的cmc，达到了高达15 mg/ml的浓度，形成的triton-x 100胶束太大，无法通过30-kd膜。
159.因此，将该过程修改为在浓缩前增加额外的洗涤步骤。这个过程在渗滤中保持了相对较低的triton-x 100浓度，并允许从单价主体溶液中有效减少表面活性剂。已发现，在两个渗滤体积的蒸馏水之后，大约95%的triton-x 100可以被去除。不幸的是，这种低水平的表面活性剂使ha的回收率恶化了5-10％。ha回收率下降的机制尚不清楚，但可能是由于蛋白质的溶解度降低和/或渗滤膜的疏水性增加。ha和triton-x 100的最佳重量比被确定为2:1
ꢀ‑ꢀ
5:1，这可以清除大部分多余的triton-x 100，而不显著影响ha的回收。初次洗涤后，将经洗涤的溶液浓缩到原体积的1/20-1/50，将ha浓度提高到5-10 mg ha/ml。所得tff浓缩液的固体成分含有45
ꢀ±ꢀ
5% ha（10
ꢀ‑ꢀ
15 mg ha/ml浓度）；15
ꢀ±ꢀ
5% triton-x 100（3
ꢀ‑ꢀ
5 mg/ml），剩余的非ha蛋白质和不溶性颗粒构成了白色浑浊溶液的剩余重量部分（40
ꢀ±ꢀ
10%）。
160.该溶液没有达到用于涂层的40-50 mg/ml的目标ha浓度。不幸的是，在tff系统中的进一步浓缩达到了粘度极限，此时前压和后压变得如此之高，以至于可能危及膜的完整性。因此，进一步的浓缩是通过冻干tff浓缩物和随后重组到所需的ha浓度实现的。
161.冻干过程在冻干之前，将蔗糖或海藻糖添加到tff浓缩物中作为冻干剂（冻干剂：ha重量比为1:1）。这两种二糖稳定剂的效果是通过对制剂进行10次冷冻/解冻循环（用液氮冷冻并立即在室温下解冻）来评估的。通过elisa测定，10次冷冻/解冻循环前后的ha效力没有变化（数据未显示），表明海藻糖或蔗糖保持了抗原稳定性。虽然在固态生物制药配方中通常需要较高重量比的冻干剂，以提供蛋白质的长期稳定性，但更重要的是限制制剂的总固体含量，从而保持微突起的尖端上的涂覆形态大小紧凑，这对微突起尖端的渗透效率很重要。此后，将蔗糖添加到tff冷冻浓缩物中，蔗糖：ha的重量比为1：1，用于冻干。所得冻干疫苗的固体成分包含30+5%的ha、30+5%的蔗糖、10+5%的triton-x 100，非ha相关的蛋白质和固体颗粒构成了30+15%的剩余部分。
162.涂层制剂
为了制备液体涂层溶液，每一种冻干的单价制剂都用比原来冻干前体积少四到五倍的注射用无菌水进行重组，以进一步提高ha浓度至40-50 mg ha/ml。这导致了重组疫苗的精细悬浮。然后，根据其srid效力值，将重组的单价溶液的等分试样按1:1:1的ha比例进行组合，以产生三价涂层溶液，每株疫苗的浓度为~14-15 mg ha/ml。同样，制备三价液体涂层溶液以满足三个关键涂层溶液参数——疫苗浓度、粘度和表面活性。
163.疫苗浓度涂层溶液的疫苗浓度被配制得尽可能高，以减少达到目标剂量所需的涂覆经过次数，即在旋转滚筒上浸入薄膜的次数，以努力减少生产每个贴片所需的制造时间。然而，涂层溶液的粘度和稳定性限制了用于涂层的疫苗浓度。在本实施例中，发现ha浓度为60 mg ha/ml或更高的涂层溶液过于粘稠，无法在滚筒上形成连续的薄膜，并在涂覆机的连续剪切下随时间凝固。出于这个原因，ha的浓度被保持在40和50 mg总ha/ml之间。下表总结了在预配制/配制过程的不同阶段的ha浓度和相对于总固体的纯度。
164.表1. 通过预配制过程的ha浓度和纯度总结。
[0165] *在添加冻干保护剂之后。
[0166]
粘度涂层溶液的粘度由抗原、非ha蛋白/颗粒和triton-x 100的总浓度控制，在涂层过程中影响到微突起上薄膜的流动。微突起尖端的每一次浸泡都可以吸取一些涂层溶液。如果溶液的粘度太低，则微突起上的溶液可能会在被干燥前滴回涂层溶液薄膜。如果溶液的粘度太高，则液体会流动得太慢，无法根据需要均匀地涂覆在微突起上。通过实验确定，液体制剂的粘度范围为0.20至1.50泊，以达到可接受的涂层形态。图2描述了三种ha/蔗糖（1:1重量比）浓度（50、40和35 mg/ml）的流感疫苗制剂在不同剪切率下的粘度。正如预期的那样，发现涂层溶液的粘度与制剂中ha的浓度直接相关。在50 mg/ml的ha浓度下，涂层溶液在整个剪切率范围内显示出对于涂覆所需的粘度，并且由于其足够高的浓度，它还需要最少的涂覆次数。
[0167]
表面活性涂层溶液还应该表现出适当的表面活性，以有效地润湿微突起。润湿性取决于液体的表面张力和基底的表面能量，它衡量涂层溶液在微突起表面上附着、粘附和扩散的能力，可以通过接触角测量来确定。润湿性差会阻碍液体的吸收，或者导致不均匀的、局部的涂层。含有表面活性剂的液体制剂可以影响表面张力，并通过减少溶液和基底之间的接触
角来改善表面润湿性。与纯水在钛基底上的接触角（80
°
）相比，涂层制剂（等重量比的ha和蔗糖）显示出良好的润湿性，接触角从26
°
到36
°
不等，无论ha浓度如何。ha抗原和/或triton-x 100可以是制剂中的表面活性剂。此外，当几种表面活性剂（例如tween 80、pluronic f68和zwittergent 3-14）被添加到涂层制剂中时（高达1%），钛表面的接触角保持不变（数据未显示）。这一观察结果再次表明，涂层制剂具有固有的表面活性，这将有利于涂覆过程。
[0168]
已知金属钛可以在表面形成氧化薄膜（主要是tio2），其表面活性是动态的，取决于薄膜的厚度、微观结构和组成。对环境空气中有机化合物的表面吸收也会显著影响表面活性、亲水性或疏水性。为了评估金属钛的表面能量对制剂的润湿性的影响，通过在250℃下加热1小时对金属钛进行预处理。高温加热可以烧掉污染物，使表面向更高程度的亲水性转变。事实上，预加热的钛显示纯水的接触角明显下降，为50
°
，而未处理的钛表面为80
°
，这表明预加热的钛表面的亲水性（或表面能量）大幅增加。有趣的是，涂层制剂在预加热钛表面上的接触角保持不变（26
°
至36
°
），这表明涂层制剂压制了钛基底的表面活性。总的来说，涂层溶液表现出强大的润湿性，受涂层基底的影响最小，并表现出优异的涂层性能。
[0169]
涂层制剂的物理稳定性尽管具有用于涂层的适当的物理特性，但500 mg/ml的ha/蔗糖涂层制剂是乳白色的悬浮溶液。由于没有可见的颗粒，这种精细的悬浮液可能主要含有纳米颗粒。这种悬浮液被认为是物理稳定的，因为在溶液冷藏保存一个月后，没有观察到相分离（颗粒沉降）。此外，溶液在7,000 rpm的转速下离心2分钟后，也没有明显的颗粒沉降现象。像稳定的乳液、水包油或油包水通常由乳化剂（或表面活性剂）稳定，纳米颗粒的悬浮液可能由triton-x 100稳定。
[0170]
涂覆过程涂覆装置包括涂层溶液储存器和与涂层溶液接触的不锈钢滚筒。滚筒被旋转以产生涂层制剂的连续薄膜（~100
ꢀµ
m厚），钛阵列上的微突起尖端被浸入其中。通过对浸泡深度的精确控制，只有微突起的尖端被涂上了涂层制剂。由于涂覆在微突起尖端的制剂体积相对较小，制剂的固体含量高，而且阵列的表面积非常大，预计在环境条件下，微突起表面上的液体涂层在涂覆后不到5秒钟就会被风干。疫苗的涂覆量由阵列浸入薄膜的次数来控制，并由bca和/或srid来监测。
[0171]
图3显示了微突起尖端上的代表性涂层形态。涂层均匀地分布在所有微突起上（图3a），并位于微突起尖端上（图3b-d为单个微突起的侧视图、俯视图和前视图）。
[0172]
由于涂层溶液在涂覆过程中暴露在高剪切力下，制剂必须在用于涂覆的薄膜的物理稳定性和溶液中的抗原的化学稳定性方面具有足够的稳定性。涂层制剂的物理稳定性是通过监测流变仪中模拟的长时间剪切力下的溶液粘度来确定的。 在一些生物制药配方中，已观察到暴露在恒定剪切力下的涂层制剂的物理不稳定性，其证据是凝胶的形成和薄膜的破裂导致溶液粘度增加。通过体外效力测定srid，在一小时的涂覆运行中定期监测化学稳定性。在一小时暴露至恒定剪切力期间，粘度和srid效力都保持不变。
[0173]
随着单价主体疫苗的预配制和涂覆工艺的开发，制备了三价疫苗制剂，在下文描述。
[0174]
三价流感疫苗的制造
三种单价毒株a/new caledonia（h1ni）、a/ panama（h3n2）和b/shandong，浓度从125到500微克ha/ml，被用于三价经皮递送系统的i期临床制造。每种单价毒株的主体病毒提取物约2升，经过渗滤，然后在tff仪器上浓缩到10 mg ha/ml。然后将浓缩的单价溶液以1:1重量比的ha：蔗糖单独配制，并冷冻干燥成粉末形式。然后将这三种冻干的粉末重新组合，产生1:1:1的三价涂层溶液，浓度为42 mg ha/ml（每种单价毒株为14 mg ha/ml）。这种涂层溶液表现出可接受的粘度和润湿性，可以在每个阵列中以最少的浸泡次数涂覆30微克三价ha的目标剂量（即每个单价毒株约10微克）。涂覆后，将可接受的系统包装在氮气吹扫的热封箔袋中，并储存在2-8℃。从临床批次中选择有代表性的系统，用srid检测法进行批次释放测试。所有测试的系统都符合》8微克ha/贴片的批次释放规格。在整个批次中随机选择的20个系统的平均数为：11.0 mcg a/new caledonia、13.3 mcg a/panama和12.2 mcg b/shangdong，相对标准偏差在6%以内。
[0175]
稳定性的考虑在整个预配制过程中（渗滤/浓缩、冻干和重组），保持抗原的稳定性是最重要的。除了所有的加工压力外，还担心涂层制剂中存在的高浓度triton-x 100对ha的抗原性的影响，因为triton-x 100的浓度增加了10倍以上，从0.1
ꢀ‑ꢀ
0.3 mg/ml增加到3
ꢀ‑ꢀ
5 mg/ml（参见tff过程部分）。
[0176]
为了评估这一效果，在一系列预配制步骤之后对a/panama疫苗进行了sds-page/蛋白质印迹分析（图4），包括不使用表面活性剂和使用三种高浓度表面活性剂（sds（10%）、triton-x 100（10%）或zwittergent 3-14（5%和10%））重组的冻干疫苗。在考马斯蓝（coomassie blue）染色凝胶的非还原条件下（左侧为sds-page凝胶），很明显，起始疫苗中存在的所有条带也都存在于重组的样品中，这表明对于所评估的任何制剂都没有检测到降解。当凝胶被转移到膜上进行蛋白质印迹分析时（图4，右侧的凝胶），同样，在不同制剂和起始单价疫苗之间没有注意到差异。一系列的条带，其反映了ha蛋白和抗ha抗体之间的结合，主要发生在高分子量上。根据匹配的条带和条带强度（相对于起始疫苗），经过冷冻干燥并暴露于高浓度强表面活性剂的制剂中的ha保持了抗原性。在还原条件下，所有制剂在sds-page凝胶上显示出与起始疫苗类似的条带。在蛋白质印迹凝胶上的条带模式在所有制剂中也都很匹配。
[0177]
最终产品的长期稳定性是用i期临床生产过程中生产的系统来评估的。在5℃和25℃的湿度受控的腔室中，经氮气吹扫的热封箔袋稳定放置长达12个月。由srid确定的每个菌株的ha效力被用作稳定性指示检测，并与三个单价毒株中每个毒株的t=0批次释放数据进行比较。数据（图5）报告为图5中初始三价效力的百分比，其表明ha在5℃和25℃下在12个月内保持良好的稳定性（》85%初始），表明该产品的潜在室温稳定性。
[0178]
经涂覆的流感疫苗系统的免疫原性表现临床前免疫原性数据是从无毛豚鼠身上获得的，豚鼠的皮肤结构与人类相似。 这种疗效动物模型的积极免疫反应促使我们决定进入贴片制剂的1期人体试验。通过经皮途径给药（两种贴片设计，每株7-8微克ha）在血凝素抑制（hai） 血清转化百分比方面优于通过肌肉内注射（im）途径给药（每株15微克ha）（表2）。这表明，即使抗原减少50%，贴片诱导的免疫反应（初次免疫后第28天）也相当于或超过了im注射的免疫反应。
[0179]
表2：临床前免疫原性结果总结
。
[0180]
微针装置用于疫苗递送的性能和安全性的人体临床验证执行1期临床研究（单中心、开放标签、随机），从而比较通过微针贴片给药的三价流感抗原与通过标准肌肉内途径递送的三价疫苗的疗效。在这项研究中，健康男性和女性（18-40岁；约30名受试者/组）接受了涂有各抗原株（a/new caledonia（h3n2）、a/panama（h3n2）、b/shandong）；12 μg /株）的微针贴片或商业im递送疫苗（各株15 μg）的治疗。一旦给药，贴片就佩戴5或15分钟。
[0181]
在免疫原性分析组中获得的结果对所有三个组按毒株列于表3。
[0182]
表3：按照用于指导免疫原性分析组的emea标准说明的免疫原性结果（hi
ꢀ–ꢀ
1/dil）
*emea指导：专利药品委员会（cpmp），关于统一流感疫苗要求的指导说明，1997年3月；1接种前滴度《10（1/dil）与接种后滴度》=40（1/dil）的受试者的比例；2接种前滴度《10与接种后滴度》=4倍滴度的受试者的比例；“指导”中的\：第0天和第21天之间的平均几何增长；**接种后滴度》=40（1/dil）的受试者比例；
¶
具有95%置信区间的统计。
[0183]
在接种21天后，所有三个治疗组的所有毒株都符合emea的三个标准。两个微针贴片组的免疫原性结果在整体上与im组相似。贴片的佩戴时间似乎并没有在很大程度上影响抗体反应的程度。三组的总ige（非特异性）数据相似，在24.7和41.6 ku/l之间。对于iga和igg（针对a/h1n1）毒株），各组之间在第0天（接种前）的数值相似。疫苗接种21天后，iga和igg都比第0天时高出5至11倍，各组之间没有差异。 微针贴片组表现出与im对照组相似的免疫反应。
[0184]
结论成功开发了三价流感疫苗经皮贴片，并在临床前和i期人体临床试验中证明了是有效的。建立了独特的预配制过程，其包括通过tff系统进行渗滤/初始浓缩、冷冻干燥和重组，以制备高ha浓度（~40-50 mg ha/ml）溶液用于涂覆。这种预配制过程非常有效，导致抗原的损失非常小（过程产量》85%）。在预配制过程后制备的后续涂层溶液经过优化，以具有可接受的物理和化学稳定性，可以涂覆在钛微突起的尖端。与目前可用的制剂相比，该贴片制剂表现出三个关键优势：不含防腐剂、室温储存和节省剂量。基于上述经皮贴片的成功，本领域的普通技术人员会明白，这种技术可以扩展到任何可以配制成涂层溶液（使用类似或不同的赋形剂）并以治疗有效量施加于微突起阵列的疫苗。
[0185]
实施例2——采用经皮微突起贴片上的合成肽抗原的冠状病毒疫苗冠状病毒疫苗贴片的制备将会大致按照实施例1进行，不同点在于抗原将会是合成肽。在这个非限制性例子中，这种合成肽将会是五种肽抗原。这五种肽以1:1:1:1:1的比例混合。然后将混合物以每种肽约50至约100微克的剂量涂在微突起贴片上。在约ph 3至约9.5下配制该混合物。五种肽如下：hp201-215 dlfgiwskvydplycns3974
ꢀꢀꢀꢀ
yngsicvigtplsrfmgf
core57
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akrrrrhrrdqggwrrspcore78
ꢀꢀꢀꢀ
vdpyvrqglqillpsaaycore113
ꢀꢀꢀ
gtlgwtadllhhvplvgp。
[0186]
将会通过sds-page/蛋白质印迹评估贴片，并将会大致按照实施例1中描述的程序从无毛豚鼠身上获得临床前免疫原性数据。
[0187]
人体临床试验也将会大致按照实施例1的方案进行。
[0188]
申请人预期，当实施例2的疫苗贴片被施用于患者群体时，统计学上显著的数量的此类患者将会被成功接种。在其他实施例中，至少10%的此类患者将会得到血清保护，或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%的此类患者将会得到血清保护。
[0189]
在其他方面，与im或sc可注射对应疫苗相比，实施例2的疫苗涂覆的贴片将会是节省剂量的。例如，与其im或sc可注射对应物相比，此处的贴片将会需要至少5%、或至少10%、或至少20%、或至少30%更少的疫苗/抗原。
[0190]
虽然本发明已经结合其具体的实施方案进行了描述，但应该理解，上述描述以及实施例是为了说明而不是限制本发明的范围。本发明范围内的其他方面、优点和修改对与本发明有关的领域的技术人员来说是显而易见的。