用于治疗冠状病毒的疫苗组合物的制作方法

本发明属于疫苗的领域，特别是用于冠状病毒的病毒样颗粒疫苗的领域。

背景技术：

1、冠状病毒是球形的包膜病毒，其直径为160至180nm并且包含正链rna基因组。由于它们的基因组有约30,000个碱基，因此它们被认为是最大的已知rna病毒。像流感病毒一样，它们具有与冠状病毒家族的其他成员进行遗传重组的能力。冠状病毒分为四大属。冠状病毒被认为是许多动物中数种严重疾病的病原体，例如，传染性支气管炎病毒、猫传染性腹膜炎病毒和传染性胃肠炎病毒。冠状病毒还在人中引起从普通感冒到严重呼吸道感染的一系列疾病。四种人冠状病毒hcov-oc43、hcov-hku1(β冠状病毒)和hcov-nl63、hcov-229e(α冠状病毒)导致了15％至30％的普通感冒(fung et al(2019)annu.rev.microbiol.73:2-529-557)。近年来，β-冠状病毒已经导致了三次重大爆发的人疾病。

2、在21世纪初期，称为sars-cov的β冠状病毒引起了被称为严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，sars)的呼吸道疾病的爆发。主要症状包括发热、干咳、头痛、呼吸急促和呼吸困难。许多感染者发展为病毒性肺炎，从而导致下呼吸道的感染。sars具有高度传染性，并通过由咳嗽或打喷嚏引起的飞沫(droplet)或者通过其他方法(例如，粪便污染)进行传播。sars在所有病例中的约9.14％中是致命的。sars的全球爆发在2003年7月得到控制，并且自2004年以来没有报道的病例(peeri et al int.j.epi,feb10,2020)。

3、在2012年，在沙特阿拉伯出现了另一种新型冠状病毒，现称为中东呼吸综合征冠状病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus，mers-cov)。mers-cov也是β冠状病毒。报道了后续的mers-cov感染病例，并且爆发传播到了中东、欧洲、亚洲和北美中的27个国家。感染mers-cov表现为伴有发热、咳嗽和呼吸急促的症状的严重急性呼吸道疾病。报道的mers-cov感染病例中约34％导致了死亡。仅少数报道的病例涉及患有轻度呼吸道疾病的对象。

4、在2019年末，出现了呼吸道感染，其迅速被鉴定为由称为sars-cov-2的新型冠状病毒毒株引起。被称为covid-19的感染具有高度感染性并引起严重肺炎，特别是在老年患者中。死亡率因国家而显著不同，其中估计范围从意大利的13.7％到日本的1.9％。截至2021年3月，美国的病死率为约1.8％(约翰霍普金斯冠状病毒研究中心(johns hopkinscoronavirus research centre)，更新截至2021年3月30日)。covid-19迅速在全世界传播，其导致对人健康的重大威胁和经济活动的大规模减慢。截至2021年2月1日，已有超过1亿人感染covid-19以及超过200万人死亡。

5、在2020年末，数种针对covid-19的疫苗被批准用于紧急使用。这些疫苗靶向sars-cov-2表面上被称为刺突蛋白的蛋白质，并利用新的平台，往往首次用于人使用。这些疫苗在临床试验中显示是高效的，但由于制造挑战以及在一些情况下需要在超低温下储存，因此在世界的许多地方的分发缓慢。此外，虽然数种新疫苗已被证明是安全的，但是一些疫苗与罕见但致命的副作用相关，这限制了它们在某些国家的使用。

6、在2020年下半年期间，出现了导致covid-19疾病的sars-cov-2变体。三种变体在它们所出现的国家中迅速成为主导，所述三种变体为b.1.1.7(也称为uk变体)、501y.v2(也称为南非变体)和p.1(称为巴西变体)。由于病毒受体结合结构域与称为血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ace2)的受体的结合亲和力提高，因此这些变体已被证明具有高度感染性。新变体的迅速传播和可能出现的新变体引起了关于再感染和最近批准的所有针对sars-cov-2的原始毒株开发的疫苗的有效性的重大担忧。

7、因此，迫切需要开发诱导针对sars-cov-2的强免疫同时安全且易于储存和分发的新疫苗。此外，迫切需要确保针对sars-cov-2的疫苗提供广泛免疫，以便针对病毒突变形式保护患者。

8、因此，存在对针对人冠状病毒的疫苗的需要，所述疫苗提供针对冠状病毒抗原的广泛免疫。

技术实现思路

1、本公开内容提供了可用于预防由人冠状病毒引起的感染的方法和组合物。更特别地，本公开内容提供了用于产生以下的方法和包含以下的组合物：表达来自人冠状病毒的抗原的病毒样颗粒(virus like particle，vlp)，所述方法和组合物可用于预防、治疗和/或诊断由冠状病毒引起的感染。

2、本公开内容提供了病毒样颗粒，其包含一种或更多种莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，mmlv)核心蛋白并且被脂质双层膜包围。vlp包含来自人冠状病毒的一种或更多种包膜多肽(例如，一种或更多种冠状病毒多肽表位)，其在诱导病毒中和抗体中发挥作用。

3、在一些实施方案中，本公开内容提供了具有包含野生型人冠状病毒包膜糖蛋白的包膜的vlp。在一些实施方案中，多肽来自sars-cov。在一些实施方案中，多肽来自mers-cov。在一些实施方案中，多肽来自sars-cov-2。在一些实施方案中，vlp包含来自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2中多于一种中的多肽。在一些实施方案中，vlp包含来自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2中所有三种中的多肽。

4、在一些实施方案中，本公开内容提供了具有包含经修饰人冠状病毒包膜糖蛋白的包膜的vlp。在一个实施方案中，本公开内容涵盖具有包膜的vlp的产生，所述包膜包含早熟构象(premature conformation)的冠状病毒多肽。在一个具体实施方案中，经修饰包膜糖蛋白缺乏弗林蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，缺乏弗林蛋白酶切割位点的多肽来自sars-cov。在一些实施方案中，缺乏弗林蛋白酶切割位点的多肽来自mers-cov。在一些实施方案中，缺乏弗林蛋白酶切割位点的多肽来自sars-cov-2。在一些实施方案中，vlp包含来自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2中多于一种中的多肽，其中所述多肽缺乏弗林蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，vlp包含来自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2中所有三种中的多肽，其中所述多肽缺乏弗林蛋白酶切割位点。

5、在另一个实施方案中，本公开内容涵盖具有包膜的vlp的产生，所述包膜包含具有经修饰氨基酸序列的冠状病毒多肽。在一个具体实施方案中，经修饰包膜糖蛋白中有赖氨酸残基和缬氨酸残基被替换为脯氨酸残基。在一些实施方案中，具有脯氨酸替换的多肽来自sars-cov。在一些实施方案中，具有脯氨酸替换的多肽来自mers-cov。在一些实施方案中，具有脯氨酸替换的多肽来自sars-cov-2。在一些实施方案中，vlp包含来自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2中多于一种中的多肽，其中所述多肽具有脯氨酸替换。在一些实施方案中，vlp包含来自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2中所有三种中的多肽，其中所述多肽具有脯氨酸替换。

6、在另一个实施方案中，本公开内容涵盖具有包膜的vlp的产生，所述包膜包含具有经修饰氨基酸序列和早熟构象的冠状病毒多肽。在一个具体实施方案中，经修饰包膜糖蛋白中有赖氨酸残基和缬氨酸残基被替换为脯氨酸残基，并且所述经修饰包膜糖蛋白缺乏弗林蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，具有脯氨酸替换并且缺乏弗林蛋白酶切割位点的多肽来自sars-cov。在一些实施方案中，具有脯氨酸替换并且缺乏弗林蛋白酶切割位点的多肽来自mers-cov。在一些实施方案中，具有脯氨酸替换并且缺乏弗林蛋白酶切割位点的多肽来自sars-cov-2。在一些实施方案中，vlp包含来自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2中多于一种中的多肽，其中所述多肽具有脯氨酸替换并且缺乏弗林蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，vlp包含来自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2中所有三种中的多肽，其中所述多肽具有脯氨酸替换并且缺乏弗林蛋白酶切割位点。

7、在另一个实施方案中，经修饰包膜糖蛋白已被修饰使得跨膜结构域被另一种病毒的跨膜结构域替代。在一个特别优选的实施方案中，vlp具有包含分离的冠状病毒s蛋白的经修饰包膜糖蛋白，所述蛋白的跨膜结构域和胞质尾区已被来自水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，vsv)的跨膜结构域和胞质尾区替代。在一些实施方案中，具有来自vsv的跨膜结构域和胞质尾区的多肽来自sars-cov。在一些实施方案中，具有来自vsv的跨膜结构域和胞质尾区的多肽来自mers-cov。在一些实施方案中，具有来自vsv的跨膜结构域和胞质尾区的多肽来自sars-cov-2。在一些实施方案中，vlp包含来自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2中多于一种中的多肽，其中所述多肽具有来自vsv的跨膜结构域和胞质尾区。在一些实施方案中，vlp包含来自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2中所有三种中的多肽，其中所述多肽具有来自vsv的跨膜结构域和胞质尾区。在一些实施方案中，vlp包含来自sars-cov、mers-cov和sars-cov-2的一种或更多种多肽，所述多肽中的一种或更多种已如本文中所述被修饰并且具有来自vsv的跨膜结构域和胞质尾区。

8、在一个优选实施方案中，本公开内容涵盖具有包膜的vlp的产生，所述包膜包含具有经修饰氨基酸序列和早熟构象的sar-cov-2刺突多肽。经修饰包膜糖蛋白中有赖氨酸残基和缬氨酸残基被替换为脯氨酸残基，并且所述经修饰包膜糖蛋白缺乏弗林蛋白酶切割位点。此外，经修饰刺突糖蛋白已被进一步修饰，使得跨膜结构域和胞质尾区已被来自水疱性口炎病毒(vsv)的跨膜结构域和胞质尾区替代。

9、本公开内容还提供了二价和三价vlp，所述vlp包含一种或更多种经修饰人冠状病毒包膜蛋白和一种或更多种野生型人冠状病毒蛋白。

10、本发明的其他特征、目的和优点在以下详细描述中是明显的。然而，应理解，详细描述虽然指出了本发明的一些实施方案，但是仅通过举例说明而非限制的方式给出。通过详细描述，在本发明范围内的多种变化和修改对本领域技术人员将是明显的。