用于IDS基因转移的腺相关病毒组合物和其使用方法与流程

用于ids基因转移的腺相关病毒组合物和其使用方法
1.相关申请交叉引用
2.本技术要求于2020年4月6日提交的美国临时专利申请序列号63/005,833、于2020年10月21日提交的美国临时专利申请序列号63/094,800和于2021年2月3日提交的美国临时专利申请序列号63/145,258的优先权，所述美国临时专利申请的全部公开内容特此以引用方式并入本文。
3.序列表
4.本技术含有已经以ascii格式电子提交并且特此通过引用整体并入的序列表(创建于2021年3月30日的所述ascii副本命名为“404217-hmw-037wo(182710)sl.txt”并且大小为217,283字节)。


背景技术：

5.亨特综合征(hunter syndrome)或黏多糖贮积症ii(mps ii)是致命的溶酶体贮积症，其导致预期寿命严重缩短10年至20年，并且具有高度未满足的医疗需求。此疾病是罕见的x连锁遗传性病症，主要影响男性并干扰身体的分解和回收特定黏多糖(也被称为糖胺聚糖(gag))的能力。亨特综合征是由艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(ids)中的基因缺陷引起的，ids是一种溶酶体酶，其对于逐步降解gag、硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素至关重要。ids缺陷使gag在全身的细胞中累积，从而干扰某些细胞和器官的正常功能。随着gag继续累积，亨特综合征的体征和症状变得更加明显。这些体征和症状可以包含：不同的面部特征、大头、腹部扩大、听力丧失、心脏瓣膜增厚导致心脏功能下降、阻塞性气道疾病、睡眠呼吸暂停、运动和活动性范围减小以及肝脏和脾脏的增大。三分之二的患有亨特综合征的患者发展出中枢神经系统(cns)疾病，从而导致神经认知和行为异常。小到2岁至4岁的儿童可以表现出如面部特征粗糙、骨骼异常、器官肿大(尤其是肝脏)以及伴有认知障碍的心血管并发症等症状。在美国，亨特综合征的发病率为1:130,000。
6.目前，可以用几种不同的治疗来控制亨特综合征。治疗包含骨髓移植和酶置换疗法(ert)。ert需要常规施用，如对于elaprase，其必须通过持续1-8小时的输注每周施用。批准的ert治疗不足以治疗与三分之二的亨特患者相关的神经退行性疾病。其它ert治疗仍处于临床测试阶段，如shp631，其为ids的融合蛋白，具有经工程化以穿过血脑屏障的抗体。其它治疗包含离体基因疗法，其涉及用ids基因扩增经转导的外周血淋巴细胞，所述方法不推荐用于患有认知疾病的患者。尽管有几种不同的治疗选择，但无法治愈亨特综合征。
7.基因疗法提供了治愈亨特综合征的机会。逆转录病毒载体(包含慢病毒载体)能够将核酸整合到宿主细胞基因组中，由于其对基因组的非靶向插入而产生安全性问题。例如，存在载体破坏肿瘤抑制基因或激活癌基因从而引起恶性肿瘤的风险。事实上，在一项通过用γ逆转录病毒载体转导cd34
+
骨髓前体来治疗x连锁严重联合免疫缺陷(scid)的临床试验中，十分之四的患者患上了白血病(hacein-bey-abina等人,《临床研究杂志(j clin invest.(2008)118(9):3132-42，所述文献通过引用以其整体并入本文)。另一方面，非整合载体通常在体内经历表达量不足或表达持续时间不足。
8.因此，本领域需要可以有效且安全地恢复患有亨特综合征的患者的ids基因功能的改进的基因疗法组合物和方法。


技术实现要素：

9.本文提供了可以恢复细胞中的ids基因功能的腺相关病毒(aav)组合物，以及用于使用所述aav组合物治疗与ids基因功能的降低相关的病症(例如，亨特综合征)的方法。还提供了用于制备所述aav组合物的组合物、系统和方法。
10.因此，一方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(raav)，其包括：(a)aav衣壳，所述aav衣壳包括aav衣壳蛋白；以及(b)raav基因组，所述raav基因组包括转录调控元件，所述转录调控元件可操作地连接到包括内含子的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(ids)内含子插入性编码序列。
11.在某些实施例中，ids内含子插入性编码序列编码人ids蛋白。在某些实施例中，ids内含子插入性编码序列编码seq id no:23中所示的氨基酸序列。
12.在某些实施例中，所述内含子是异源内含子。在某些实施例中，所述内含子与seq id no:33中所示的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
13.在某些实施例中，所述内含子定位在所述ids内含子插入性编码序列中与seq id no:24中所示的ids编码序列的位置708和709相对应的核苷酸之间。在某些实施例中，所述ids内含子插入性编码序列包括与seq id no:25、59或60中所示的核苷酸序列具有至少至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
14.在某些实施例中，所述内含子定位在所述ids内含子插入性编码序列中与seq id no:26中所示的ids编码序列的位置580和581相对应的核苷酸之间。在某些实施例中，所述ids内含子插入性编码序列包括与seq id no:27中所示的核苷酸序列具有至少至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
15.在某些实施例中，所述ids内含子插入性编码序列包括seq id no:25、27、59或60中所示的核苷酸序列。
16.在某些实施例中，所述转录调控元件包括选自由以下组成的组的元件中的一个或多个元件：巨细胞病毒(cmv)增强子元件、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡-β-肌动蛋白(cba)启动子、小鸡-β-肌动蛋白(smcba)启动子、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)启动子、β-葡萄糖醛酸酶(gusb)启动子、经修饰的人ef-1α启动子、calm1启动子、合成启动子和其任何组合。
17.在某些实施例中，所述转录调控元件包括与seq id no:29、30、36、39、40、41、42、44、46、47、48或55中所示的核苷酸序列具有至少至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在某些实施例中，所述转录调控元件包括seq id no:29中所示的核苷酸序列。
18.在某些实施例中，所述raav基因组进一步包括所述ids内含子插入性编码序列的3'处的聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列是外源性聚腺苷酸化序列。在某
些实施例中，外源性聚腺苷酸化序列是sv40聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，所述sv40聚腺苷酸化序列包括seq id no:45中所示的核苷酸序列。
19.在某些实施例中，所述raav基因组包括seq id no:37、43、52、54、61、63、65、69、75或77中所示的核苷酸序列。
20.在某些实施例中，所述raav基因组进一步包括5'反向末端重复(5'itr)核苷酸和3'反向末端重复(3'itr)核苷酸序列。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:18、20或49具有至少95％序列同一性，并且3'itr核苷酸序列与seq id no:14、19、21或51具有至少95％序列同一性。
21.在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:18具有至少80％序列同一性，并且3'itr核苷酸序列与seq id no:14具有至少80％序列同一性。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:18具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且3'itr核苷酸序列与seq id no:19具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:18具有至少80％序列同一性，并且3'itr核苷酸序列与seq id no:51具有至少80％序列同一性。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:49具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且3'itr核苷酸序列与seq id no:14具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:49具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且3'itr核苷酸序列与seq id no:19具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:49具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且3'itr核苷酸序列与seq id no:51具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:20具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且3'itr核苷酸序列与seq id no:21具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列和3'itr核苷酸序列分别包括seq id no:18和14；18和19；18和51；49和14；49和19；40和51；或20和21的序列。
22.在某些实施例中，所述raav基因组包括seq id no:28、38、50、53、56、57、58、62、64、66、70、71、72、73或74中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，所述raav基因组包括seq id no:72和74；72和28；73和74；或73和28中所示的核苷酸序列。
23.在某些实施例中，所述raav基因组包括seq id no:38、50、62、64、66、70、76或78中所示的核苷酸序列。
24.在某些实施例中，所述aav衣壳蛋白包括与由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736构成的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸206相对应的氨基酸为c；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸为h；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸为q；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸为a；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸为n；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸为s；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸为i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸590相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为g或y；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸为m；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸为k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸为c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸为g。
25.在某些实施例中，(a)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸为g；(b)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸为h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸为n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸为m；(c)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸为r；(d)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸为a，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r；或者(e)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸为i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸为c。
26.在某些实施例中，所述衣壳蛋白包括由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736构成的氨基酸序列。
27.在某些实施例中，所述aav衣壳蛋白包括与由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736构成的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸151相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸160相对应的氨基酸为d；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸206相对应的氨基酸为c；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸为h；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸为q；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸为a；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸为n；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸为s；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸为i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为
r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸590相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为g或y；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸为m；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸为k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸为c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸为g。
28.在某些实施例中，(a)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸为g；(b)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸为h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸为n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸为m；(c)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸为r；(d)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸为a，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r；或者(e)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸为i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸为c。
29.在某些实施例中，所述衣壳蛋白包括由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736构成的氨基酸序列。
30.在某些实施例中，所述aav衣壳蛋白包括与由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736构成的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸2相对应的氨基酸为t；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸65相对应的氨基酸为i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸68相对应的氨基酸为v；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸77相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸119相对应的氨基酸为l；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸151相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸160相对应的氨基酸为d；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸206相对应的氨基酸为c；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸为h；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸为q；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸为a；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸为n；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸为s；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸为i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸590相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为g或y；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸为m；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸为k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸为c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸为g。
31.在某些实施例中，(a)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸2相对应的氨基酸为t，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸为q；(b)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸65相对应的氨基酸为i，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为y；(c)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸77相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸为k；(d)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸119相对应的氨基酸为l，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸为s；(e)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸为g；(f)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸为h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸为n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸为m；(g)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸为r；(h)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸为a，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r；或者(i)所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸为i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸为c。
32.在某些实施例中，所述衣壳蛋白包括由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736构成的氨基酸序列。
33.另一方面，本公开提供了一种用于在细胞中表达艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(ids)多肽的方法，所述方法包括使用如本文所描述的重组腺相关病毒(raav)转导所述细胞。
34.在某些实施例中，所述细胞是中枢神经系统的细胞。在某些实施例中，所述细胞是选自由以下组成的组的中枢神经系统区域的细胞：脊髓；运动皮层；感觉皮层；海马体；壳核；小脑，任选地小脑核和其任何组合。在某些实施例中，所述细胞是神经元和/或神经胶质细胞，任选地其中所述细胞是中枢神经系统和/或周围神经系统的神经元和/或神经胶质细胞。在某些实施例中，细胞为选自由以下组成的群组的细胞：运动神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、中枢神经系统中的大脑皮质的细胞、周围神经系统的感觉神经元、施万细胞(schwann cell)和其任何组合。
35.在某些实施例中，所述细胞是肝脏的细胞。在某些实施例中，所述细胞是心脏的细胞。在某些实施例中，所述细胞是肺的细胞。在某些实施例中，所述细胞是肾脏的细胞。在某些实施例中，所述细胞是脾脏的细胞。
36.在某些实施例中，所述细胞位于哺乳动物受试者中，并且所述raav以有效转导所述受试者的所述细胞的量施用于所述受试者。
37.另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括如本文所描述的raav。
38.另一方面，本公开提供了一种用于治疗患有亨特综合征(hs)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所描述的raav或如本文所描述的药物组合物。
39.在某些实施例中，所述raav或药物组合物静脉内施用。
40.在某些实施例中，亨特综合征(hs)与艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(ids)基因突变相
关。
41.在某些实施例中，所述受试者是人受试者。
42.另一方面，本公开提供了一种用于制备raav的包装系统，其中所述包装系统包括：(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码一个或多个aav rep蛋白；(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码如本文所描述的raav的衣壳蛋白；以及(c)第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列包括如本文所描述的raav的raav基因组序列。
43.在某些实施例中，包装系统包括包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的第一载体，以及包括第三核苷酸序列的第二载体。
44.在某些实施例中，所述包装系统进一步包括第四核苷酸序列，所述第四核苷酸序列包括一个或多个辅助病毒基因。在某些实施例中，所述第四核苷酸序列包括在第三载体中。在某些实施例中，所述第四核苷酸序列包括来自选自由以下组成的组的病毒的一个或多个基因：腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和巨细胞病毒(cmv)。
45.在某些实施例中，第一载体、第二载体和/或第三载体为质粒。
46.另一方面，本公开提供了一种用于重组制备raav的方法，所述方法包括将本文所描述的包装系统引入细胞中，由此产生所述raav。
47.另一方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包括与seq id no:25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所示的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在某些实施例中，所述多核苷酸包括seq id no:25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所示的核酸序列。在某些实施例中，所述多核苷酸包括在载体、任选地病毒载体(例如，aav载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体)或质粒载体内。另一方面，本公开提供了包括前述多核苷酸的重组细胞。
48.另一方面，本公开提供了如本文所描述的raav、如本文所描述的药物组合物、如本文所描述的多核苷酸或如本文所描述的重组细胞，其用作药物。
49.另一方面，本公开提供了如本文所描述的raav、如本文所描述的药物组合物、如本文所描述的多核苷酸或如本文所描述的重组细胞，其用于治疗亨特综合征(hs)。
50.另一方面，本公开提供了如本文所描述的raav、如本文所描述的药物组合物、如本文所描述的多核苷酸或如本文所描述的重组细胞，其用于治疗患有亨特综合征(hs)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述raav、所述药物组合物、所述多核苷酸或所述细胞。
附图说明
51.图1a、1b、1c、1d和1e分别是phm-05205载体、phm-05213载体、phm-05214载体、phm-05216载体和phm-05217载体的载体图。
52.图2a和2b。图2a是示出给药后四周，野生型和ids ko半合子小鼠的肝脏中每ng转导细胞dna的载体基因组数量的图。图2b是示出给药后四周，野生型和ids ko半合子小鼠的肝脏中表示为纳摩尔/小时/毫克蛋白质的i2s活性的图。在图2a和2b中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；aav9-hids是指以2e13vg/kg的剂量施
用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠；并且hsc15-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠。在图2b中，人肝脏是指正常人肝脏中的代表性的i2s活性水平。*指示p《0.05时的统计显著性；***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示与wt相比，p《0.0001时的统计显著性。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
53.图3a和3b。图3a是示出给药后四周，野生型和ids ko半合子小鼠的脑(前脑、中脑和后脑)中每ng转导细胞dna的载体基因组数量的图。图3b是示出给药后四周，野生型和ids ko半合子小鼠的前脑中表示为纳摩尔/小时/毫克蛋白质的i2s活性的图。在图3a和3b中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；aav9-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠；并且hsc15-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠。在图3b中，人脑是指正常成年人脑中的代表性的i2s活性水平。n.s指示不显著。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
54.图4a和4b。图4a是示出给药后四周，在以2e13vg/kg的剂量施用包装在aav9衣壳(aav9-hids)中的phm-05205或以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳(hsc15-hids)中的phm-05205的ids ko半合子小鼠的肝脏中检测到的表示为小鼠肝脏中的代表性的野生型i2s活性水平的百分比的i2s活性水平的图。图4b是示出给药后四周，在以2e13vg/kg的剂量施用包装在aav9衣壳(aav9-hids)中的phm-05205或以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳(hsc15-hids)中的phm-05205的ids ko半合子小鼠的肝脏中检测到的表示为肝脏中的代表性的正常人i2s活性水平的百分比的i2s活性水平的图。在图4a和4b中，*指示p《0.05时的统计显著性。
55.图5a和5b。图5a是示出给药后四周，在以2e13vg/kg的剂量施用包装在aav9衣壳(aav9-hids)中的phm-05205或以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳(hsc15-hids)中的phm-05205的ids ko半合子小鼠的脑中检测到的表示为小鼠脑中的代表性的野生型i2s活性水平的百分比的i2s活性水平的图。图5b是示出给药后四周，在以2e13vg/kg的剂量施用包装在aav9衣壳(aav9-hids)中的phm-05205或以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳(hsc15-hids)中的phm-05205的ids ko半合子小鼠的脑中检测到的表示为脑中的代表性的正常人i2s活性水平的百分比的i2s活性水平的图。
56.图6a、6b和6c。图6a是示出给药后四周，在野生型和ids ko半合子小鼠的肝脏中检测到的gag水平的图。图6b是示出给药后四周，在野生型和ids ko半合子小鼠的脑中检测到的gag水平的图。图6c是示出给药后四周，在野生型和ids ko半合子小鼠的尿液中检测到的gag水平的图。在图6a、6b和6c中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；aav9-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠；并且hsc15-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠。在图6a中，人肝脏是指人肝脏中的代表性的gag水平。在图6b中，人脑是指人脑中的代表性的gag水平。在图6a-6c中，*指示p《0.05时的统计显著性，并且**指示p《0.01时的统计显著性。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
57.图7a和7b。图7a是示出给药后四周，相对于小鼠gapdh的表达水平归一化的野生型和ids ko半合子小鼠的肝脏中的hids的表达的图。图7b是示出给药后四周，相对于小鼠
gapdh的表达水平归一化的野生型和ids ko半合子小鼠的脑中的hids的表达的图。在图7a和7b中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；aav9-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠；并且hsc15-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠。在图7b中，人脑是指成年正常人脑中的代表性的ids表达水平。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
58.图8a、8b和8c。图8a是示出随着时间的推移，在野生型和ids ko半合子小鼠的尿液中检测到的总gag水平的图。图8b是示出在给药后十二周，在野生型和ids ko半合子小鼠的肝脏中检测到的gag水平的图。图8c是示出在给药后十二周，野生型和ids ko半合子小鼠的肝脏中表示为纳摩尔/小时/毫克蛋白质的i2s活性的图。在图8a、8b和8c中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；并且hsc15-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠。在图8a-8c中，***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
59.图9a、9b和9c。图9a是示出在给药后十二周，在野生型和ids ko半合子小鼠的脑中检测到的gag水平的图。图9b是示出在给药后十二周，野生型和ids ko半合子小鼠的脑中表示为纳摩尔/小时/毫克蛋白质的i2s活性的图。在图9a和9b中，*指示p《0.05时的统计显著性，并且**指示p《0.01时的统计显著性。图9c是示出在给药后十二周，野生型和ids ko半合子小鼠的脑中的表示为代表性的野生型小鼠i2s活性的百分比的i2s活性的图。在图9a、9b和9c中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；并且hsc15-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
60.图10a、10b和10c分别是t-004、t-005和t-006载体的载体图。
61.图11a和11b。图11a是示出在给药后四周，在野生型和ids ko半合子小鼠的尿液中检测到的总gag水平的图。图11b是示出在给药后四周，在野生型和ids ko半合子小鼠中检测到的以纳摩尔/小时/毫升表示的血清i2s活性的图。在图11a和11b中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；aav9-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠；hsc15-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠；hsc15-t-004是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的t-004的ids ko半合子小鼠；hsc15-t-005是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的t-005的ids ko半合子小鼠；并且hsc15-t-006是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的t-006的ids ko半合子小鼠。在图11a和11b中，*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
62.图12a、12b、12c和12d。图12a是示出在给药后四周，在野生型和ids ko半合子小鼠的脑中检测到的gag水平的图。图12b是示出在给药后四周，在野生型和ids ko半合子小鼠的肝脏中检测到的gag水平的图。图12c是示出在给药后四周，在野生型和ids ko半合子小鼠的脑中检测到的i2s活性的图。图12d是示出在给药后四周，在野生型和ids ko半合子小
鼠的肝脏中检测到的i2s活性的图。在图12a、12b、12c和12d中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；aav9-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠；hsc15-hids是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko半合子小鼠；hsc15-t-004是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的t-004的ids ko半合子小鼠；hsc15-t-005是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的t-005的ids ko半合子小鼠；并且hsc15-t-006是指以2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的t-006的ids ko半合子小鼠。在图12a、12b和12d中，*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
63.图13a和13b是示出至多给药后四周，野生型和ids ko半合子小鼠的体重的图。在图13a和13b中，组1：未处理的ids ko半合子对照；第2组：以2.2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；第3组：以6.5e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；第4组：以1.1e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；第5组：野生型小鼠对照；第6组：以2.2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的野生型小鼠；以及第7组：以1.1e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的野生型小鼠。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
64.图14a、14b和14c是示出施用包装在aavhsc15中的phm-05217的野生型小鼠的剂量依赖性i2s活性的图。图14a是示出给药后两周，在野生型和ids ko半合子小鼠中检测到的以纳摩尔/小时/毫升为单位的血清i2s活性的图。图14b是示出给药后四周，在野生型和ids ko半合子小鼠中检测到的以纳摩尔/小时/毫升为单位的血清i2s活性的图。图14c是示出给药后四周，野生型和ids ko半合子小鼠的肝脏中的以纳摩尔/小时/毫升为单位的i2s活性的图。在图14a、14b和14c中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；wt-2.2e+13是指以2.2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的野生型小鼠；并且wt-1.1e+14是指以1.1e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的野生型小鼠。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
65.图15a和15b。图15a是示出给药后四周，野生型和半合子小鼠的脑中的总gag水平的图。图15b是示出给药后四周，野生型和半合子小鼠的肝脏中的总gag水平的图。在图15a和15b中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；wt-2.2e+13是指以2.2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的野生型小鼠；并且wt-1.1e+14是指以1.1e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的野生型小鼠。在图15a和15b中，***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
66.图16a和16b。图16a是示出给药后四周，野生型和ids ko半合子小鼠的脑中的ids的表达水平的图。图16b是示出给药后四周，野生型和ids ko半合子小鼠的肝脏中的ids的表达水平的图。在图16a和16b中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；mps ii-2.2e+13是指以2.2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；mps ii-6.5e+13是指以6.5e13vg/kg的剂量施用包装在
aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；并且mps ii-1.1e+14是指以1.1e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠。在图16a和16b中，*指示p《0.05时的统计显著性，并且***指示p《0.001时的统计显著性。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
67.图17a和17b。图17a是示出在给药后两周，在野生型和ids ko半合子小鼠中检测到的血清i2s活性的图。图17b是示出了在给药后四周，在野生型ids n's ko半合子小鼠中检测到的血清i2s活性的图。在图17a和17b中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；mps ii-2.2e+13是指以2.2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；mps ii-6.5e+13是指以6.5e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；并且mps ii-1.1e+14是指以1.1e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠。在图17a和17b中，**指示p《0.01时的统计显著性，****指示p《0.0001时的统计显著性，并且ns指示不显著。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
68.图18是示出给药后四周，在野生型和ids ko半合子小鼠的肝脏中检测到的i2s活性的图。wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；mps ii-2.2e+13是指以2.2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；mps ii-6.5e+13是指以6.5e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；并且mps ii-1.1e+14是指以1.1e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠。在图18中，**指示p《0.01时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
69.图19a和19b是示出给药后两周(图19a)和四周(图19b)，在野生型和ids ko半合子小鼠的尿液中检测到的相对于尿液中的肌酐水平归一化的总gag水平的图。图19c和19d是示出给药后四周，野生型小鼠和ids ko半合子小鼠中的gag硫酸乙酰肝素(gag-hs；“hs”)(图19c)和gag硫酸皮肤素(gag-ds；“ds”)(图19d)的水平的图。wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；mps ii-2.2e+13是指以2.2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；mps ii-6.5e+13是指以6.5e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；并且mps ii-1.1e+14是指以1.1e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠。在图19a-19d中，ns指示无统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
70.图20a、20b、20c、20d、20e和20f是示出给药后四周，野生型和ids ko半合子小鼠的肝脏(图20a)、心脏(图20b)、肺(图20c)、脑(图20d)、肾脏(图20e)和脾脏(图20f)中检测到的总gag水平的图。在图20a、20b、20c、20d、20e和20f中，wt是指未处理的野生型小鼠；mps ii是指未处理的ids ko半合子小鼠；mps ii-2.2e+13是指以2.2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；mps ii-6.5e+13是指以6.5e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠；并且mps ii-1.1e+14是指以1.1e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠。在图20a-20f中，*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
05205或phm-05211的mps ii小鼠的脑中的归一化hids转录物的水平的图。小鼠被处死，并且如所指示的，在给药后2周或8周测量脑hids转录物。在图27b和27c中，ns指示不显著。
78.图28a-28o是示出与以1.8e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠有关的各种数据的图。图28a是示出到给药后52周，使用荧光酶测定在经处理的mps ii小鼠中检测到的血清i2s活性的水平的图。单个小鼠(每组n＝3-5只小鼠)中的最小值、最大值和中值在方框中显示，其中误差条表示标准偏差。图28b是示出给药后12周、24周、39周和52周，经处理的mps ii小鼠的脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺组织中每μg转导细胞dna的载体基因组的数量的图。图28c是示出在给药后12周、24周、39周和52周，在经处理的mps ii小鼠的脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺组织中检测到的hids转录物的数量的图。图28d是示出在给药后52周，在经处理的mps ii小鼠的脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺组织中检测到的硫酸乙酰肝素的水平的图。图28e和图28f是示出在给药后52周，通过ihc在经处理的mps ii小鼠的脊髓(图28e)和海马体(图28f)中检测到的lamp1蛋白的像素强度的图。图28g是示出在给药后39周，经处理的mps ii的三叉神经节中每μg转导细胞dna的载体基因组的数量的图。图28h是示出在给药后12周、24周、39周和52周，在经处理的mps ii小鼠的肝脏组织中检测到的i2s活性的水平的图。图28i-28l是示出在给药后12周(图28i)、24周(图28j)、39周(图28k)和52周(图28l)，在经处理的mps ii小鼠的脑组织中检测到的i2s活性的水平的图。图28m是示出到给药后52周，在以1.8e14vg/kg施用包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠的尿液中检测到的gag-hs的水平的图。图28n是示出在给药后52周，以1.8e14vg/kg施用包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠中的浦肯野细胞层(purkinje cell layer)细胞密度的定量的图。图28o是示出在给药后52周，经处理的mps ii小鼠的颧弓厚度的图。在图28b-28d和28e-28m中的每一个中，未处理的mps ii和野生型小鼠用作对照。在图28j-28l中，正常成年人脑组织用作额外的对照。在每种情况下，*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且ns指示不显著。未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
79.图29a-29e。图29a是示出脚踝和爪深度和宽度测量的位置的示意图。图29b-29e是示出在给药后14周、20周、28周、34周、37周、40周、46周和52周，以1.8e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠的爪宽度(图29b)、爪深度(图29c)、脚踝宽度(图29d)和脚踝深度(图29e)测量结果的图。在每种情况下，施用媒剂的野生型小鼠和mps ii小鼠用作对照。
80.图30a-30e。图30a、30d和30e是示出至多给药后8周，在以1.8e14vg/kg施用包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠的血清(图30a)、肝脏组织(图30d)和脑组织(图30f)中检测到的i2s活性的水平的图。施用媒剂的mps ii小鼠用作对照。在图30a中，*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且ns指示不显著。图30b和30c是示出如所指示的在给药后8天、2周和8周，在以1.8e14vg/kg施用包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠的脑、心脏、肝脏和脾脏组织中检测到的载体基因组(图30b)和沉默变更的hids转录物(图30c)的水平的图。
81.图31a、31b和31c是示出如所指示的在给药后8天(图31a)、2周(图31b)和8周(图31c)，在以1.8e14vg/kg施用包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠的脑、心脏、肝脏和脾脏组织中检测到的gag-hs的水平的图。图31d是示出在所指示的各个时间点，在以
1.8e14vg/kg施用包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠的尿液中检测到的gag-hs的水平的图。在每种情况下，施用媒剂的野生型和mps ii小鼠用作对照。
82.图32a和32b是示出如所指示的通过hplc-ms/ms在用媒剂处理的野生型(wt)小鼠、用媒剂处理的mps ii小鼠以及通过以6e13vg/kg(mps ii 6e+13)、1e14vg/kg(mps ii 1e+14)或2e14vg/kg(mps ii 2e+14)的剂量静脉内施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217处理的mps ii小鼠的脑脊液(csf)(图32a)或脑组织(图32b)中检测到的gag-hs水平的图。图32c是示出如所指示的在用媒剂处理的野生型(wt)小鼠、用媒剂处理的mps ii小鼠以及通过以6e13vg/kg(mps ii 6e+13)、1e14vg/kg(mps ii 1e+14)或2e14vg/kg(mps ii 2e+14)的剂量静脉内施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217处理的mps ii小鼠的脑组织中检测到的i2s活性的水平的图。正常成年人脑组织用作额外的对照(“人wt”)。在图32a-32c中，*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。
83.图33是示出在存在或不存在甘露糖6-磷酸(m6p)的情况下，在与获得自以1.8e14vg/kg施用包装在aavhsc15中的phm-05217 8天后的mps ii小鼠的血清一起温育的ids ko hela细胞的细胞裂解物中检测到的i2s活性的水平的图。在图33中，*指示p《0.05时的统计显著性，并且***指示p《0.001时的统计显著性。
具体实施方式
84.本公开提供了可以恢复细胞中的ids基因功能的aav组合物，以及用于使用所述aav组合物治疗与ids基因功能的降低相关的病症(例如，亨特综合征)的方法。还提供了用于制备所述aav组合物的组合物、系统和方法。
85.i.定义
86.如本文所使用的，术语“重组腺相关病毒”或“raav”是指包括缺乏功能性rep和cap基因的基因组的aav。
87.如本文所使用的，术语“ids基因”是指艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因。人ids基因由国家生物技术信息中心(ncbi)基因id 3423鉴定。ids基因的互补编码序列的示例性核苷酸序列提供为seq id no:24。ids多肽的示例性氨基酸序列提供为seq id no:23。
88.如本文所使用的，术语“raav基因组”是指包括raav的基因组序列的核酸分子(例如，dna和/或rna)。本领域的技术人员将理解，当raav基因组包括转基因(例如，可操作地连接到转录调控元件的ids编码序列)时，raav基因组可以相对于转基因的转录的方向处于有义或反义定向。
89.如本文所使用的，术语“aav衣壳蛋白”是指aav vp1、vp2或vp3衣壳蛋白。术语“clade f衣壳蛋白”是指与分别在seq id no:1的氨基酸1-736、138-736和203-736中所示的vp1、vp2或vp3氨基酸序列具有至少90％同一性的aav vp1、vp2或vp3衣壳蛋白。
90.如本文所用，两个核苷酸序列之间或两个氨基酸序列之间的“一致性百分比”是藉由将所比对的序列对之间的匹配数目乘以100并除以所比对的区域的长度(包含内部空位)来计算。一致性评分仅对完美匹配进行计数，并且不考虑氨基酸彼此之间的相似性程度。应注意，长度中仅包含内部间隙，不包含序列末端处的间隙。
91.如本文所使用的，术语“与ids基因突变相关的疾病或病症”是指由ids基因突变引
起、由其加重或与其遗传相关的任何疾病或病症。在某些实施例中，与ids基因突变相关的疾病或病症是亨特综合征或黏多糖贮积症ii(mps ii)。
92.如本文所用，术语“编码序列”是指互补dna(cdna)的编码多肽的部分，其开始于起始密码子并且终止于终止密码子。基因可由于替代性剪接、替代性翻译起始和群体内的变化而具有一个或多个编码序列。编码序列可以是野生型的、沉默变更的或内含子插入性。示例性野生型ids编码序列在seq id no:24中示出。
93.如本文所使用的，术语“沉默变更”是指改变基因的编码序列或内含子插入性编码序列(例如，通过核苷酸取代)而不改变由编码序列或填充插入的编码序列编码的多肽的氨基酸序列。此类沉默变更的有利之处在于，其可提高编码序列的翻译效率，和/或在编码序列被转导到细胞中时防止与内源性基因的对应序列重组。如本文所描述的示例性沉默变更的ids编码序列在seq id no:26、67或68中示出。
94.如本文所使用的，术语基因的“内含子插入性编码序列”是指包括插入基因的编码序列中的一个或多个内含子的核苷酸序列。基因的内含子插入性编码序列也被称为包括内含子的内含子插入性编码序列。在某些实施例中，内含子中的至少一个内含子是非天然或异源内含子，即，具有与基因的天然内含子不同的序列。在某些实施例中，内含子插入性编码序列中的所有内含子是非天然内含子。非天然内含子可以具有来自不同物种的内含子的序列或来自相同物种或来自不同物种的不同基因中的内含子的序列。可替代地或另外地，非天然内含子序列的至少一部分可以是合成的。技术人员将理解，非天然内含子序列可以被设计为通过引入本领域已知的任何共有剪接基序来介导rna剪接。示例性共有剪接基序在sible等人,(2016)《自然评论：遗传学(nature reviews genetics)》,17,407-21中提供，所述文献通过引用整体并入本文。插入非天然内含子可以提高载体包装的效率和稳健性，因为这样的序列可以允许调整载体以达到最佳大小(例如，4.5-4.8kb)。在某些实施例中，内含子中的至少一个内含子是基因的天然内含子。在某些实施例中，内含子插入性编码序列中的所有内含子是基因的天然内含子。非天然或天然内含子可以在编码序列中的任何核苷酸间键处插入。在某些实施例中，在核苷酸间键处插入一个或多个非天然或天然内含子预计促进有效剪接(参见例如，zhang(1998)《人类分子遗传学(human molecular genetics)》,7(5):919-32，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。在某些实施例中，一个或多个非天然或天然内含子插入连接两个内源性外显子的核苷酸间键处。因此，在某些实施例中，基因的内含子插入性编码序列包括设计用于有效剪接的一个或多个内含子。在某些实施例中，可以将一个或多个内含子插入基因的编码序列中，以增强基因的表达(例如，通过内含子介导的增强(ime))。
95.如本文所使用的，术语“异源内含子”和“非天然内含子”是指并非给定基因天然的内含子。
96.在本公开中，ids基因中的核苷酸位置是相对于起始密码子的第一核苷酸指定的。起始密码子的第一核苷酸是位置1；起始密码子的第一核苷酸的5'处的核苷酸具有负数；起始密码子的第一核苷酸的3'处的核苷酸具有正数。人ids基因的示例性核苷酸1是ncbi参考序列：ng_011900.3(登录区域：ng_011900，区域5029..33347，分类单元9606，染色体x，图xq28)的核苷酸170，并且人ids基因的示例性核苷酸3是ncbi参考序列：ng_011900.3的核苷酸172。与起始密码子的5'处相邻的核苷酸是核苷酸-1。
97.如本文所使用的，术语“转录调控元件”或“tre”是指顺式作用核苷酸序列，例如，dna序列，其通过rna聚合酶调节(例如，控制、增加或减少)可操作连接的核苷酸序列的转录以形成rna分子。tre依靠一种或多种反式作用分子，如转录因子来调控转录。因此，一个tre在其与不同的反式作用分子接触时(例如当其位于不同类型的细胞中时)可以不同方式调控转录。tre可以包括一种或多种启动子元件和/或增强子元件。所属领域的技术人员将了解，基因中的启动子和增强子元件可在位置上靠近，并且术语「启动子」可指包括启动子元件和增强子元件的序列。因此，术语「启动子」不排除序列中的增强子元件。启动子和增强子元件无需来源于相同基因或物种，并且每个启动子或增强子元件的序列可与基因组中的对应内源性序列一致或大体上一致。
98.如本文所用，术语「可操作地连接」用于描述tre与待转录的编码序列之间的连接。通常，使基因表达处于包括一种或多种启动子和/或增强子元件的tre的控制下。如果编码序列的转录由tre控制或影响，那么编码序列“可操作地连接”于tre。tre的启动子和增强子元件可自编码序列呈任何定向和/或距离，只要获得所需转录活性即可。在某些实施例中，tre位于编码序列的上游。
99.如本文所用，术语“聚腺苷酸化序列”是指当转录成rna时构成聚腺苷酸化信号序列的dna序列。聚腺苷酸化序列可以是天然的(例如，来自ids基因)或外源性的。外源性聚腺苷酸化序列可以是哺乳动物或病毒性聚腺苷酸化序列(例如，sv40聚腺苷酸化序列)。
100.如本文所使用的，“外源性聚腺苷酸化序列”是指与ids基因(例如，人ids基因)的内源性聚腺苷酸化序列不相同或基本上相同的聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，外源性聚腺苷酸化序列是相同物种(例如，人)中的非ids基因的聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，外源性聚腺苷酸化序列是不同物种(例如，病毒)的聚腺苷酸化序列。
101.如本文所使用的，在向受试者施用aav的背景下，术语“有效量”是指达到所期望的预防或治疗效果的avv的量。
102.如本文所使用的，在提及如ids蛋白的表达水平等可测量值时，术语“约”或“大约”涵盖给定值或范围的
±
20％或
±
10％、
±
5％、
±
1％或
±
0.1％的变化，如适用于执行本文所公开的方法。
103.ii.腺相关病毒组合物
104.一方面，本文提供了可用于在ids基因功能降低或有缺陷的细胞中表达ids多肽的新型raav组合物。在某些实施例中，本文所公开的aav包括：aav衣壳，所述aav衣壳包括衣壳蛋白(例如，aav进化枝f(aav clade f)衣壳蛋白)；以及raav基因组，所述raav基因组包括可操作地连接到内含子插入性ids编码序列(例如，沉默变更的内含子插入性ids编码序列)的转录调控元件，从而允许ids在用aav转导的细胞中的染色体外表达。
105.来自本领域已知的任何衣壳的衣壳蛋白可以用于本文所公开的raav组合物，包含但不限于来自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8或aav9血清型的衣壳蛋白。例如，在某些实施例中，衣壳蛋白包括与由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736构成的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，衣壳蛋白包括与由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736构成的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中：所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸206相对应的氨基酸为c；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸为h；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸为q；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸为a；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸为n；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸为s；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸为i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸590相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为g或y；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸为m；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸为k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸为c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸为g。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸为g。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸为h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸为n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸为m。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸为r。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸为a，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸为i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸为c。在某些实施例中，所述衣壳蛋白包括由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736构成的氨基酸序列。
106.例如，在某些实施例中，衣壳蛋白包括与由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736构成的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，衣壳蛋白包括与由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736构成的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中：所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸151相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸160相对应的氨基酸为d；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸206相对应的氨基酸为c；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸为h；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸为q；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸为a；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸为n；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸为s；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨
基酸501相对应的氨基酸为i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸590相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为g或y；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸为m；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸为k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸为c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸为g。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸为g。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸为h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸为n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸为m。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸为r。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸为a，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸为i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸为c。在某些实施例中，所述衣壳蛋白包括由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736构成的氨基酸序列。
107.例如，在某些实施例中，衣壳蛋白包括与由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736构成的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，衣壳蛋白包括与由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736构成的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列其中：所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸2相对应的氨基酸为t；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸65相对应的氨基酸为i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸68相对应的氨基酸为v；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸77相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸119相对应的氨基酸为l；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸151相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸160相对应的氨基酸为d；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸206相对应的氨基酸为c；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸为h；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸为q；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸为a；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸为n；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸为s；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸为i；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸590相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为g或y；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸
为m；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸为r；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸为k；所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸为c；或者所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸为g。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸2相对应的氨基酸为t，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸312相对应的氨基酸为q。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸65相对应的氨基酸为i，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为y。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸77相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸690相对应的氨基酸为k。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸119相对应的氨基酸为l，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸468相对应的氨基酸为s。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸626相对应的氨基酸为g，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸718相对应的氨基酸为g。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸296相对应的氨基酸为h，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸464相对应的氨基酸为n，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸681相对应的氨基酸为m。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸687相对应的氨基酸为r。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸346相对应的氨基酸为a，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r。在某些实施例中，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸501相对应的氨基酸为i，所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸505相对应的氨基酸为r，并且所述衣壳蛋白中与seq id no:16的氨基酸706相对应的氨基酸为c。在某些实施例中，所述衣壳蛋白包括由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736构成的氨基酸序列。
108.在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的两种或多种：(a)包括由seq id no:1、2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括：(a)具有由seq id no:1、2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸203-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)具有由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸138-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)具有由seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16或17的氨基酸1-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白。
109.在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括与seq id no:8的氨基酸203-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括与seq id no:8的氨基酸138-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括与seq id no:8的氨基酸1-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括由seq id no:8的氨基酸203-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括由seq id no:8的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括由seq id no:8的氨基酸1-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的两种或多种：(a)包括由seq id no:8的氨基酸203-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括由seq id no:8的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括由seq id no:8的氨基酸1-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括：(a)具有由seq id no:8的氨基酸203-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)具有由seq id no:8的氨基酸138-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)具有由seq id no:8的氨基酸1-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白。
110.在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括与seq id no:11的氨基酸203-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括与seq id no:11的氨基酸138-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括与seq id no:11的氨基酸1-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括由seq id no:11的氨基酸203-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括由seq id no:11的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括由seq id no:11的氨基酸1-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的两种或多种：(a)包括由seq id no:11的氨基酸203-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括由seq id no:11的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括由seq id no:11的氨基酸1-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括：(a)具有由seq id no:11的氨基酸203-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)具有由seq id no:11的氨基酸138-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)具有由seq id no:11的氨基酸1-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白。
111.在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括与seq id no:13的氨基酸203-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括与seq id no:13的氨基酸138-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括与seq id no:13的氨基酸1-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括由seq id no:13的氨基酸203-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括由seq id no:13的氨基酸
138-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括由seq id no:13的氨基酸1-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的两种或多种：(a)包括由seq id no:13的氨基酸203-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括由seq id no:13的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括由seq id no:13的氨基酸1-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括：(a)具有由seq id no:13的氨基酸203-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)具有由seq id no:13的氨基酸138-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)具有由seq id no:13的氨基酸1-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白。
112.在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括与seq id no:16的氨基酸203-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括与seq id no:16的氨基酸138-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括与seq id no:16的氨基酸1-736的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的一种或多种：(a)包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括由seq id no:16的氨基酸1-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括以下中的两种或多种：(a)包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)包括由seq id no:16的氨基酸1-736构成的氨基酸序列的衣壳蛋白。在某些实施例中，aav衣壳包括：(a)具有由seq id no:16的氨基酸203-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；(b)具有由seq id no:16的氨基酸138-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白；以及(c)具有由seq id no:16的氨基酸1-736组成的氨基酸序列的衣壳蛋白。
113.可用于本文所公开的aav组合物的raav基因组通常包括可操作地连接到内含子插入性ids编码序列的转录调控元件(tre)。在某些实施例中，raav基因组包括tre和内含子插入性ids编码序列的5'处的5'反向末端重复(5'itr)核苷酸序列以及tre和内含子插入性ids编码序列的3'处的3'反向末端重复(3'itr)核苷酸序列。
114.在某些实施例中，内含子插入性ids编码序列包括ids基因的所有或基本上所有的编码序列。在某些实施例中，raav基因组包括编码seq id no:23的核苷酸序列，并且可以任选地进一步包括内含子插入性ids编码序列的3'处的外源性聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，内含子插入性ids编码序列的编码seq id no:23的核苷酸序列是野生型的(例如，具有seq id no:25中所示的序列)。在某些实施例中，内含子插入性ids编码序列的编码seq id no:23的核苷酸序列是沉默变更的(例如，具有seq id no:27、59或60中所示的序列)。
115.在某些实施例中，内含子插入性ids编码序列编码包括ids蛋白的所有或基本上所有氨基酸序列的多肽。在某些实施例中，内含子插入性ids编码序列编码野生型ids蛋白(例如，人ids蛋白)的氨基酸序列。在某些实施例中，内含子插入性ids编码序列编码突变ids蛋白(例如，人ids蛋白)的氨基酸序列，其中突变ids多肽是野生型ids多肽的功能等同物，即，
可以作为野生型ids多肽起作用。在某些实施例中，功能上等同的ids多肽进一步包括至少一种在野生型ids多肽中未找到的特性，例如，抵抗蛋白质降解的能力。
116.在某些实施例中，可用于本文所公开的aav组合物的raav基因组通常包括可操作地连接到对ids进行编码的内含子插入性编码序列的转录调控元件(tre)。
117.raav基因组可以用于在任何哺乳动物细胞(例如，人细胞)中表达ids。因此，tre可以在任何哺乳动物细胞(例如，人细胞)中是活性的。在某些实施例中，tre在广泛的人类细胞中具有活性。此类tre可以包括组成型启动子和/或增强子元件，包含巨细胞病毒(cmv)启动子/增强子(例如，包括与seq id no:29、40或46至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、sv40启动子、鸡actb启动子(例如，包括与seq id no:47至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、jet启动子(例如，包括与seq id no:30至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、smcba启动子(例如，包括与seq id no:55至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、人延伸因子1α(ef1α)启动子(例如，包括与seq id no:39至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、包括转录因子结合位点的小鼠微小病毒(mvm)内含子(例如，包括与seq id no:33至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、人磷酸甘油酸激酶(pgk1)启动子、人泛素c(ubc)启动子、人β肌动蛋白启动子、人神经元特异性烯醇化酶(eno2)启动子、人β-葡萄糖醛酸酶(gusb)启动子、兔β-珠蛋白元件(例如，包括与seq id no:41至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)、人钙调蛋白1(calm1)启动子(例如，包括与seq id no:44至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)和/或人甲基-cpg结合蛋白2(mecp2)启动子。这些tre中的任一个可以任何顺序组合以驱动有效转录。例如，raav基因组可以包括cmv增强子、cba启动子和来自兔β-珠蛋白基因的外显子3的剪接受体，统称为cag启动子(例如，包括与seq id no:42至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。例如，raav基因组可以包括cmv增强子和cba启动子的杂合体，然后是剪接供体和剪接受体，统称为casi启动子区(例如，包括与seq id no:48至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列)。
118.可替代地，tre可以是组织特异性tre，即，其在特定组织和/或器官中是活性的。组织特异性tre包括一个或多个组织特异性启动子和/或增强子元件，和任选地一个或多个组成型启动子和/或增强子元件。所属领域的技术人员将理解，可通过所属领域中熟知的方法从组织中特异性表达的基因分离组织特异性启动子和/或增强子元件。
119.在某些实施例中，tre是脑特异性的(例如，神经元特异性、神经胶质细胞特异性、星形胶质细胞特异性、少突胶质细胞特异性、小胶质细胞特异性和/或中枢神经系统特异性)。示例性脑特异性tre可以包括一个或多个来自(但不限于)人类胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)启动子、人类突触蛋白1(syn1)启动子、人类突触蛋白2(syn2)启动子、人类金属硫蛋白3(mt3)启动子和/或人类蛋白脂质蛋白质1(plp1)启动子的元件。wo 2016/100575a1中公开了更多脑特异性启动子元件，所述文献的公开内容通过引用整体并入本文。
120.在某些实施例中，raav基因组包括两个或更多个tre，任选地包括上文所公开的tre中的至少一种。所属领域的技术人员将理解，这些tre中的任一个可以任何顺序组合，并且组成型tre和组织特异性tre的组合可驱动有效和组织特异性转录。
121.在某些实施例中，raav载体进一步包括ids编码序列的5'处的或插入其中的内含子。此类内含子可增加转基因表达，例如藉由减少转录沉默和增强从细胞核到细胞质的mrna输出。在某些实施例中，raav基因组从5'至3'包括：非编码外显子、内含子和ids编码序列。在某些实施例中，内含子序列插入ids编码序列中，任选地其中所述内含子插入在连接两个天然外显子的核苷酸间键处。在某些实施例中，在连接原生外显子1与外显子2的核苷酸间键处插入内含子。
122.内含子可以包括ids基因的天然内含子序列、来自不同物种或来自相同物种的不同基因的内含子序列(即，非天然或异源内含子)和/或合成内含子序列。技术人员将理解，可以设计合成内含子序列以通过引入本领域已知的任何共有剪接基序来介导rna剪接(例如，在sibley等人,(2016)《自然评论：遗传学》,17,407-21中，所述文献通过引用整体并入本文)。示例性内含子序列在lu等人(2013)《分子疗法(molecular therapy)》21(5):954-63和lu等人(2017)《人类基因疗法(hum.gene ther.)》28(1):125-34中提供，所述文献通过引用整体并入本文。在某些实施例中，raav基因组包括sv40元件(例如，包括与seq id no:31至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列)或小鼠微小病毒(mvm)内含子(例如，包括与seq id no:33至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，raav基因组包括sv40元件(例如，包括seq id no:31中所示的核苷酸序列)或小鼠微小病毒(mvm)内含子(例如，包括seq id no:33中所示的核苷酸序列)。在某些实施例中，raav基因组包括包含鸡和兔序列组合，部分地包含未转录的鸡actb(cactb)启动子、所有cactb外显子1、部分cactb内含子1、部分兔hbb2(rhbb2)内含子2和部分rhbb2外显子3的嵌合内含子序列(例如，seq id no:32)。在某些实施例中，raav基因组包括嵌合内含子序列(例如，包括与seq id no:32至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，raav基因组包括嵌合内含子序列(例如，包括seq id no:32中所示的核苷酸序列)。
123.在某些实施例中，raav基因组包括包含cmv增强子、cba启动子和嵌合内含子序列的tre(例如，包括与seq id no:36至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列)。在某些实施例中，raav基因组包括包含seq id no:36的tre。
124.在某些实施例中，raav基因组包括包含与seq id no:29至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列的tre。在某些实施例中，raav基因组包括包含seq id no:29的tre。
125.在某些实施例中，本文所公开的raav基因组进一步包括转录终止子(例如，聚腺苷酸化序列)。在某些实施例中，转录终止子位于内含子插入性ids编码序列的3'处。转录终止子可以是有效终止转录的任何序列，并且技术人员将理解，此类序列可以从细胞中表达的任何基因中分离出来，在所述细胞中期望转录内含子插入性ids编码序列。在某些实施例中，转录终止子包括聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列与人ids基因的内源性聚腺苷酸化序列相同或基本上相同。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列是外源性聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列是sv40聚腺苷酸化序列(例如，包括seq id no:34、35或45中所示的核苷酸序列，或与其互补的核苷酸序列)。在某些实施例中，聚腺苷酸化序列包括seq id no:45中所示的序列。
126.在某些实施例中，raav基因组从5'至3'包括：tre、内含子插入性ids编码序列和聚腺苷酸化序列。在某些实施例中，tre与seq id no:29、30、31、32、33、35、36、39、40、41、42、44、46、47、48和/或55中任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；内含子插入性ids编码序列与seq id no:25、27、59或60具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；和/或聚腺苷酸化序列与seq id no:34、35或45中任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
127.在某些实施例中，tre包括seq id no:29中所示的序列；内含子插入性ids编码序列包括seq id no:25中所示的序列；和/或聚腺苷酸化序列包括seq id no:45中所示的序列。
128.在某些实施例中，tre包括seq id no:29中所示的序列；内含子插入性ids编码序列包括seq id no:27中所示的序列；和/或聚腺苷酸化序列包括seq id no:45中所示的序列。
129.在某些实施例中，tre包括seq id no:29中所示的序列；内含子插入性ids编码序列包括seq id no:59中所示的序列；和/或聚腺苷酸化序列包括seq id no:45中所示的序列。
130.在某些实施例中，tre包括seq id no:29中所示的序列；内含子插入性ids编码序列包括seq id no:60中所示的序列；和/或聚腺苷酸化序列包括seq id no:45中所示的序列。
131.在某些实施例中，raav基因组包括与seq id no:37、43、52、54、61、63、65、69、75或77至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:37、43、52、54、61、63、65、69、75或77中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:37、43、52、54、61、63、65、69、75或77中所示的核苷酸序列组成。
在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:37中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:37中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:43中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:43中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:52中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:52中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:54中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:54中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:61中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:61中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:63中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:63中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:65中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:65中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:69中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:69中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:75中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:75中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:77中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:77中所示的核苷酸序列组成。
132.在某些实施例中，本文所公开的raav基因组进一步包括tre的5'处的5'反向末端重复(5'itr)核苷酸序列，以及内含子插入性ids编码序列的3'处的3'反向末端重复(3'itr)核苷酸序列。来自任何aav血清型或其变体的itr序列可以用于本文所公开的raav基因组。5'和3'itr可来自相同血清型的aav或不同血清型的aav。用于本文所公开的raav基因组的示例性itr在本文的seq id no:14、18-21、28、49、51、57和72-74中示出。
133.在某些实施例中，5'itr或3'itr来自aav2。在某些实施例中，5'itr和3'itr两者来自aav2。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:18具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，或者3'itr核苷酸序列与seq id no:14具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:18具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且3'itr核苷酸序列与seq id no:14具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:37、43、52或54中任一个中所示的核苷酸序列、具有seq id no:18的序列的5'itr核苷酸序列以及具有seq id no:14的序列的3'itr核苷酸序列。
134.在某些实施例中，5'itr或3'itr来自aav2。在某些实施例中，5'itr和3'itr两者来自aav2。在某些实施例中，5'itr核苷酸序列与seq id no:18具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，或者3'itr核苷酸序列与seq id no:19具有至少80％、81％、82％、
no:49中所示的核苷酸序列组成，并且3'itr由seq id no:14中所示的核苷酸序列组成。
138.在某些实施例中，5'itr侧接源自野生型aav2基因组序列的额外的核苷酸序列。在某些实施例中，5'itr侧接源自与野生型aav2 itr相邻的野生型aav2序列的额外的46bp序列。在某些实施例中，额外的46bp序列在5'itr内部。在某些实施例中，46bp序列由seq id no:71中所示的序列组成。在某些实施例中，5'itr包括与seq id no:71至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，5'itr包括seq id no:72或73中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，5'itr的核苷酸序列由与seq id no:72或73至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列组成。在某些实施例中，5'itr的核苷酸序列由seq id no:72或73中所示的核苷酸序列组成。
139.在某些实施例中，3'itr侧接源自野生型aav2基因组序列的额外的核苷酸序列。在某些实施例中，3'itr侧接源自与野生型aav2 itr相邻的野生型aav2序列的额外的37bp序列。参见例如，savy等人,《人类基因疗法方法(human gene therapy methods)》(2017)28(5):277-289(其以全文引用的方式并入本文中)。在某些实施例中，额外的37bp序列在3'itr内部。在某些实施例中，37bp序列由seq id no:56中所示的序列组成。在某些实施例中，3'itr包括与seq id no:28、57或74至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在某些实施例中，3'itr包括seq id no:28、57或74中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，3'itr的核苷酸序列由与seq id no:28、57或74至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列组成。在某些实施例中，3'itr的核苷酸序列由seq id no:28、57或74中所示的核苷酸序列组成。
140.在某些实施例中，raav基因组从5'至3'包括：5'itr；内部元件，所述内部元件从5'至3'包括：如本文所公开的tre、任选地非编码外显子和内含子、内含子插入性ids编码序列和聚腺苷酸化序列；不可解析的itr；与内部元件互补的核苷酸序列；以及3'itr。此类raav基因组可以在感染后和复制前形成aav的自身互补的双链dna基因组。
141.在某些实施例中，raav基因组从5'至3'包括：5'itr、tre、内含子插入性ids编码序列、聚腺苷酸化序列和3'itr。在某些实施例中，5'itr与seq id:18、20、49或73具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；tre与seq id no:29、30、31、32、33、35、36、39、40、41、42、44、46、47、48和/或55中任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；内含子插入性ids编码序列与seq id no:25、27、59或60具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；聚腺苷酸化序列与seq id no:34、35或45中任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；和/或3'itr与seq id:14、19、21、28、51、57或74具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
id no:29中所示的序列；内含子插入性ids编码序列包括seq id no:60中所示的序列；聚腺苷酸化序列包括seq id no:45中所示的序列；和/或3'itr包括seq id no:14中所示的序列或由其组成。
151.在某些实施例中，raav基因组包括与seq id no:38、50、53、58、62、64、66、70、76或78至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的序列。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:38、50、53、58、62、64、66、70、76或78中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:38、50、53、58、62、64、66、70、76或78中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:38中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:38中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:50中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:50中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:53中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:53中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:58中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:58中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:62中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq idno:62中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:64中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:64中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:66中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:66中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:70中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:70中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:76中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:76中所示的核苷酸序列组成。在某些实施例中，raav基因组包括seq id no:78中所示的核苷酸序列。在某些实施例中，raav基因组的核苷酸序列由seq id no:78中所示的核苷酸序列组成。
152.在某些实施例中，所述raav包括：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:51的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:51的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、
野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:51的3'itr)。
153.在某些实施例中，所述raav包括：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)。
154.在某些实施例中，所述raav包括：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)。
155.在某些实施例中，所述raav包括：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的
内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)。
156.在某些实施例中，所述raav包括：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)。
157.在某些实施例中，所述raav包括：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:19的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:19的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的
氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:19的3'itr)。
158.在某些实施例中，所述raav包括：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:59的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:59的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:59的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)。
159.在某些实施例中，所述raav包括：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:60的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:60的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:60的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)。
160.在某些实施例中，所述raav包括：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及包括seq id no:25、27、29、37、38、43、
50、52、53、54、58、60、61、62、63、64、65、66、69、70、75、76、77或78中任一个中所示的核苷酸序列的raav基因组；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及包括seq id no:25、27、29、37、38、43、50、52、53、54、58、60、61、62、63、64、65、66、69、70、75、76、77或78中任一个中所示的核苷酸序列的raav基因组；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及包括seq id no:25、27、29、37、38、43、50、52、53、54、58、60、61、62、63、64、65、66、69、70、75、76、77或78中任一个中所示的核苷酸序列的raav基因组。
161.另一方面，本文提供了包括与seq id no:25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所示的核酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列的多核苷酸。在某些实施例中，所述多核苷酸包括seq id no:25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所示的核酸序列。在某些实施例中，所述多核苷酸的核酸序列由seq id no:25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所示的核酸序列组成。在某些实施例中，所述多核苷酸包括seq id no:25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所示的核酸序列。在某些实施例中，所述多核苷酸的核酸序列由seq id no:25、26、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、76、77或78中所示的核酸序列组成。
162.本文还提供了包括与seq id no:25、27、59或60中所示的核酸序列至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的核酸序列的多核苷酸。在某些实施例中，所述多核苷酸包括seq id no:25、27、59或60中所示的核酸序列。在某些实施例中，所述多核苷酸的核酸序列由seq id no:25、27、59或60中所示的核酸序列组成。在某些实施例中，所述多核苷酸包括seq id no:25中所示的核酸序列。在某些实施例中，所述多核苷酸的核酸序列由seq id no:25中所示的核酸序列组成。在某些实施例中，所述多核苷酸包括seq id no:27中所示的核酸序列。在某些实施例中，所述多核苷酸的核酸序列由seq id no:27中所示的核酸序列组成。在某些实施例中，所述多核苷酸包括seq id no:59中所示的核酸序列。在某些实施例中，所述多核苷酸的核酸序列由seq id no:59中所示的核酸序列组成。在某些实施例中，所述多核苷酸包括seq id no:60中所示的核酸序列。在某些实施例中，所述多核苷酸的核酸序列由seq id no:60中所示的核酸序列组成。
163.多核苷酸可以包括dna、rna、修饰的dna、修饰的rna或其组合。在某些实施例中，多核苷酸包括在载体，例如，病毒载体或质粒内。本文还提供了包括多核苷酸或载体的重组细胞。
164.在另一方面中，本公开提供一种药物组合物，其包括如本文中所公开的aav和药学上可接受的赋形剂、佐剂、稀释剂、媒剂或载剂或其组合。“药学上可接受的载剂”包含任何在与组合物的活性成分组合时使所述成分保留生物活性并不引起破坏性生理学反应(如不希望的免疫反应)的材料。药学上可接受的载剂包含水、磷酸盐缓冲盐水、乳液(如油/水乳液)和湿润剂。包括此类载剂的组合物通过熟知的常规方法调配，如以下中所阐述的那些方
法：《雷明顿氏医药科学(remington's pharmaceutical sciences)》,当前版,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(mack publishing co.,easton pa.)18042,美国；a.gennaro(2000)“《雷明顿：药物科学与实践(remington:the science and practice of pharmacy)》”,第20版,利平科特
·
威廉斯
·
威尔金斯出版社(lippincott,williams,&wilkins)；《药物剂型和药物递送系统(pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems)》(1999)h.c.ansel等人,第7版,利平科特
·
威廉斯
·
威尔金斯出版社；以及《药物赋形剂手册(handbook of pharmaceutical excipients)》(2000)a.h.kibbe等人,第3版美国医药协会(amer.pharmaceutical assoc.)。
165.iii.使用方法
166.另一方面，本公开提供了用于在细胞中表达ids多肽的方法。所述方法通常包括用如本文中所公开的raav转导细胞。此类方法在恢复ids表达方面非常有效。因此，在某些实施例中，本文中所公开的方法涉及用如本文中所公开的raav转导细胞。
167.本文所公开的方法可以应用于任何携带ids基因中的突变的细胞。技术人员将理解，需要活性内源性ids(例如，内源性i2s活性)的细胞是特别关注的。因此，在某些实施例中，所述方法适用于任何失去内源性i2s活性的细胞。
168.在某些实施例中，将所述方法应用于神经元和/或神经胶质细胞。在某些实施例中，尤其感兴趣的是需要活性内源性ids(例如，内源性i2s活性)的神经元和/或神经胶质细胞。在某些实施例中，所述方法适用于中枢神经系统(cns)细胞和/或外周神经系统(pns)的细胞。在某些实施例中，尤其感兴趣的是需要活性内源性ids(例如，内源性i2s活性)的中枢神经系统的细胞和/或外周神经系统的细胞。在某些实施例中，尤其感兴趣的是前脑、中脑、后脑、脊髓和其任何组合中的细胞。在某些实施例中，尤其感兴趣的是选自由以下组成的组的中枢神经系统区域的细胞：脊髓、运动皮层、感觉皮层、丘脑、海马体、壳核、小脑(例如，小脑核)和其任何组合。在某些实施例中，尤其感兴趣的是脑中的脑桥和髓质、脊髓的上升束和其任何组合中的细胞。在某些实施例中，尤其感兴趣的是需要活性内源性ids(例如，内源性i2s活性)的选自由以下组成的组的中枢神经系统(cns)区域的细胞：脊髓、运动皮层、感觉皮层、丘脑、海马体、壳核、小脑(例如，小脑核)和其任何组合。在某些实施例中，尤其感兴趣的是中枢神经系统(cns)中的运动神经元和星形胶质细胞分布、cns中的少突胶质细胞(上升纤维)、cns中的大脑皮质的细胞群体以及周围神经系统(pns)中之感觉神经元。在某些实施例中，尤其感兴趣的是少突胶质细胞，如脊髓的背束中的细胞。在某些实施例中，尤其感兴趣的是中枢神经系统中的神经胶质分布，包含(但不限于)星形胶质细胞、少突胶质细胞、施万细胞和其任何组合。在某些实施例中，尤其感兴趣的是运动神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、中枢神经系统中的大脑皮质的细胞、周围神经系统中的感觉神经元、周围神经系统中的神经胶质细胞(例如，施万细胞)和其任何组合。
169.在某些实施例中，所述方法应用于肝脏细胞(例如，肝脏细胞)。在某些实施例中，尤其感兴趣的是需要活性内源性ids(例如，内源性i2s活性)的肝脏细胞。在某些实施例中，所述方法应用于心脏细胞(例如，心肌细胞)。在某些实施例中，尤其感兴趣的是需要活性内源性ids(例如，内源性i2s活性)的心脏细胞。在某些实施例中，所述方法应用于肺细胞(例如，气道上皮细胞)。在某些实施例中，尤其感兴趣的是需要活性内源性ids(例如，内源性i2s活性)的肺细胞。在某些实施例中，所述方法应用于肾脏细胞(例如，肾上皮细胞)。在某
些实施例中，尤其感兴趣的是需要活性内源性ids(例如，内源性i2s活性)的肾脏细胞。在某些实施例中，所述方法应用于脾脏细胞(例如，脾脏细胞)。在某些实施例中，尤其感兴趣的是需要活性内源性ids(例如，内源性i2s活性)的脾脏细胞。
170.本文中所公开的方法可体外进行以用于研究目的或可离体或体内进行以用于治疗目的。
171.在某些实施例中，待转导的细胞在哺乳动物受试者中并以可有效转导受试者中的细胞的量向受试者施用aav。因此，在某些实施例中，本公开提供了用于治疗患有与ids基因突变相关的疾病或病症的受试者的方法，所述方法通常包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的raav。受试者可以是人受试者、非人灵长类动物受试者(例如，食蟹猴)或具有ids突变的啮齿动物受试者(例如，小鼠)。与ids基因突变相关的任何疾病或病症都可以使用本文公开的方法进行治疗。合适的疾病或病症包含但不限于亨特综合征。
172.在某些实施例中，前述方法采用包括以下的raav：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:51的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:51的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:51的3'itr)。
173.在某些实施例中，前述方法采用包括以下的raav：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下
遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)。
174.在某些实施例中，前述方法采用包括以下的raav：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)。
175.在某些实施例中，前述方法采用包括以下的raav：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、野生型人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:25的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)。
176.在某些实施例中，前述方法采用包括以下的raav：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元
件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)。
177.在某些实施例中，前述方法采用包括以下的raav：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:19的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:19的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:18的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:27的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:19的3'itr)。
178.在某些实施例中，前述方法采用包括以下的raav：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:59的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:59的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:
45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:59的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)。
179.在某些实施例中，前述方法采用包括以下的raav：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:60的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:60的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及raav基因组，所述raav基因组从5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件(例如，seq id no:49的5'itr)、转录调控元件(例如，包括seq id no:29的序列的tre)、沉默变更的人内含子插入性ids编码序列(例如，seq id no:60的内含子插入性hids编码序列)、sv40聚腺苷酸化序列(例如，seq id no:45的sv40聚腺苷酸化序列)以及3'itr元件(例如，seq id no:14的3'itr)。
180.在某些实施例中，前述方法采用包括以下的raav：(a)aav衣壳蛋白，所述aav衣壳蛋白包括由seq id no:16的氨基酸203-736构成的氨基酸序列，以及包括seq id no:25、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、69或70中任一个中所示的核苷酸序列的raav基因组；(b)包括由seq id no:16的氨基酸138-736构成的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及包括seq id no:25、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、69或70中任一个中所示的核苷酸序列的raav基因组；和/或(c)包括seq id no:16的氨基酸序列的aav衣壳蛋白，以及包括seq id no:25、27、37、38、43、50、52、53、54、58、59、60、61、62、63、64、65、66、69或70中任一个中所示的核苷酸序列的raav基因组。
181.本文所公开的方法特别有利，因为其能够在体内和体外均高效地在细胞中表达ids蛋白。在某些实施例中，在没有ids基因突变的相同类型的细胞中，ids蛋白的表达水平是内源性ids蛋白的表达水平的至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.3％、至少约0.4％、至少约0.5％、至少约0.6％、至少约0.7％、至少约0.8％、至少约0.9％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约100％或其任何中间百分比。在某些实施例中，在没有ids基因突变的相同类型的细胞中，ids蛋白的表达水平是
内源性ids蛋白的表达水平的至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。可以采用测定ids蛋白表达水平的任何方法，包含但不限于elisa、蛋白质印迹、免疫染色和质谱法。
182.在某些实施例中，用本文中所公开的aav组合物转导细胞可如本文所提供来进行或通过所属领域中的技术人员已知的任何转导方法来进行。在某些实施例中，细胞可以以50,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、或500,000的感染复数(moi)或提供细胞的最佳转导的任何moi与aav接触。
183.可通过任何适当的途径向受试者施用本文中所公开的aav组合物，包含(但不限于)静脉内、鞘内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、局部或皮内途径。在某些实施例中，将组合物调配成用于通过静脉内注射或皮下注射施用。
184.iv.aav包装系统
185.在另一方面中，本公开提供用于本文中所公开的重组腺相关病毒(raav)的重组制备的包装系统。此类包装系统通常包括：编码一个或多个aav rep蛋白的第一核苷酸；编码如本文所公开的aav中的任何aav的衣壳蛋白的第二核苷酸；以及包括如本文所公开的raav基因组中的任何raav基因组的第三核苷酸序列，其中所述包装系统在细胞中是操作性的以将raav基因组围封在衣壳中以形成aav。
186.在某些实施例中，包装系统包括第一载体，其包括编码一个或多个aav rep蛋白的第一核苷酸序列和编码aav衣壳蛋白的第二核苷酸序列，以及第二载体，其包括有包括raav基因组的第三核苷酸序列。如在如本文中所描述的包装系统的上下文中所使用，“载体”是指作为用于将核酸引入到细胞中的媒剂的核酸分子(例如，质粒、病毒、粘粒、人工染色体等)。
187.任何aav rep蛋白均可用于本文中所公开的包装系统中。在包装系统的某些实施例中，rep核苷酸序列编码aav2 rep蛋白。合适的aav2 rep蛋白包含(但不限于)rep 78/68或rep 68/52。在包装系统的某些实施例中，编码aav2 rep蛋白的核苷酸序列包括编码与seq id no:22的aav2 rep氨基酸序列具有最小序列同一性百分比的蛋白质的核苷酸序列，其中跨aav2 rep蛋白的氨基酸序列长度的最小序列同一性百分比为至少70％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％)。在包装系统的某些实施例中，aav2 rep蛋白具有seq id no:22中所示的氨基酸序列。
188.在包装系统的某些实施例中，包装系统进一步包括第四核苷酸序列，所述第四核苷酸序列包括一个或多个辅助病毒基因。在包装系统的某些实施例中，包装系统进一步包括包含第四核苷酸序列的第三载体，例如，辅助病毒载体，所述第四核苷酸序列包括一个或多个辅助病毒基因。第三载体可为独立的第三载体、与第一载体整合在一起或与第二载体整合在一起。
189.在包装系统的某些实施例中，辅助病毒选自由以下组成的群组：腺病毒、疱疹病毒(包含单纯性疱疹病毒(hsv))、痘病毒(如痘苗病毒)、巨细胞病毒(cmv)和杆状病毒。在其中辅助病毒是腺病毒的某些包装系统实施例中，腺病毒基因组包括一种或多种选自由以下组成的群组的腺病毒rna基因：el、e2、e4和va。在其中辅助病毒是hsv的某些包装系统实施例中，hsv基因组包含选自由以下组成的群组的hsv基因中的一个或多个：ul5/8/52、icpo、icp4、icp22和ul30/ul42。
190.在包装系统的某些实施例中，第一载体、第二载体和/或第三载体包含在一个或多个质粒内。在某些实施例中，第一载体和第三载体包含于第一质粒内。在某些实施例中，第二载体和第三载体包含于第二质粒内。
191.在包装系统的某些实施例中，第一、第二和/或第三载体包含于一种或多种重组辅助病毒内。在某些实施例中，第一载体和第三载体包含于重组辅助病毒内。在某些实施例中，第二载体和第三载体包含于重组辅助病毒内。
192.在另一方面中，本公开提供一种用于如本文中所描述的aav的重组制备的方法，其中所述方法包含在可操作以将raav基因组包裹于衣壳中以形成如本文中所描述的raav的条件下，用如本文中所描述的包装系统转染或转导细胞。用于raav的重组制备的示例性方法包含短暂转染(例如，用一种或多种含有如本文所描述的第一载体和第二载体以及任选地第三载体的转染质粒)、病毒感染(例如，用一种或多种重组辅助病毒，如腺病毒、痘病毒(如牛痘病毒)、疱疹病毒(包含hsv、巨细胞病毒或杆状病毒，其含有如本文所描述的第一载体和第二载体以及任选地第三载体)和稳定的生产细胞系转染或感染(例如，用稳定的生产细胞，如哺乳动物或昆虫细胞，其含有如本文所描述的编码一个或多个aav rep蛋白的rep核苷酸序列和/或编码一个或多个aav衣壳蛋白的cap核苷酸序列，并且其中以质粒或重组辅助病毒形式传递如本文所描述的raav基因组)。
193.因此，本公开提供了一种用于制备重组aav(raav)的包装系统，其中所述包装系统包括编码一个或多个aav rep蛋白的第一核苷酸序列；编码本文所描述的aav中的任一个aav的衣壳蛋白的第二核苷酸序列；包括本文所描述的aav中的任一个aav的raav基因组序列的第三核苷酸序列；以及任选地包括一个或多个辅助病毒基因的第四核苷酸序列。
194.v.实例
195.本文中所公开的重组aav载体活体外和活体内介导高效基因转移。以下实例证明使用如本文所公开的基于aav的载体有效恢复ids基因(在某些人类疾病，如亨特综合征中突变)的表达。这些实例以说明性方式而非限制性方式提供。
196.在以下实例5、6和11中，相对于载体基因组中的人ids基因，对2.2e13vg/kg、6.5e13vg/kg和1.1e14vg/kg剂量的aav进行滴定。当在载体基因组中使用sv40 polya序列进行滴定时，aav的等效剂量为2e13vg/kg、6e13vg/kg和1e14vg/kg。在以下实例9、10和12中，相对于载体基因组中的人ids基因，对1.8e14vg/kg剂量的aav进行滴定。当相对于载体基因组中的sv40 polya序列进行滴定时，aav的等效剂量为1e14vg/kg。
197.实例1：人ids转移载体
198.此实例提供用于使人ids(hids)在载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达的人ids转移载体phm-05205、phm-05213、phm-05214、phm-05216和phm-05217。
199.a)phm-05205
200.ids转移载体phm-05205，如图1a中所示，5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件；包括cmv启动子的转录调控元件；野生型人ids内含子插入性编码序列；sv40聚腺苷酸化序列；以及3'itr元件。这些元件的序列阐述于表1中。此载体能够在所述载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达人ids蛋白。
201.b)phm-05213
202.ids转移载体phm-05213，如图1b中所示，5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件；包
括cmv启动子的转录调控元件；野生型人ids内含子插入性编码序列；sv40聚腺苷酸化序列；以及3'itr元件。这些元件的序列阐述于表1中。此载体能够在所述载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达人ids蛋白。
203.c)phm-05214
204.ids转移载体phm-05214，如图1c中所示，5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件；包括cmv启动子的转录调控元件；沉默变更的人ids内含子插入性编码序列；sv40聚腺苷酸化序列；以及3'itr元件。这些元件的序列阐述于表1中。此载体能够在所述载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达人ids蛋白。
205.d)phm-05216
206.ids转移载体phm-05216，如图1d中所示，5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件；包括cmv启动子的转录调控元件；野生型人ids内含子插入性编码序列；sv40聚腺苷酸化序列；以及3'itr元件。这些元件的序列阐述于表1中。此载体能够在所述载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达人ids蛋白。
207.e)phm-05217
208.ids转移载体phm-05217，如图1e中所示，5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件；包括cmv启动子的转录调控元件；沉默变更的人ids内含子插入性编码序列；sv40聚腺苷酸化序列；以及3'itr元件。这些元件的序列阐述于表1中。此载体能够在所述载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达人ids蛋白。
209.表1：人ids转移载体phm-05210、phm-05213、phm-05214、phm-05216和phm-05217中的遗传元件
[0210][0211][0212]
本文所公开的载体可以包装在aav衣壳中，例如，aav进化枝f衣壳，如但不限于aavhsc5、aavhsc7、aavhsc15或aavhsc17衣壳。包装的病毒颗粒可以施用于野生型动物或ids缺陷型动物。
[0213]
实例2：黏多糖贮积症(mps)ii型(亨特综合征)小鼠模型中的ids基因转移
[0214]
亨特综合征是罕见的x连锁遗传病症，主要是影响男性的疾病。所述疾病由溶酶体酶艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(ids)中的基因缺陷引起。ids对于糖胺聚糖(gag)、硫酸乙酰肝
素(hs)和硫酸皮肤素(ds)的逐步降解是必需的。ids主要在中枢神经系统中表达。
[0215]
为了研究体内ids基因转移的效果，使用了mps ii小鼠模型。mps ii小鼠模型b6j.cg-ids
tm1muen
/hmi是包括鼠类ids基因的外显子4和外显子5的一部分的缺失的ids敲除(ids ko)小鼠，从而消除基因表达。参见garcia等人(2007)《遗传性代谢病杂志(j.inherit.metab.dis.)》30(6):924-934。ids ko小鼠缺乏i2s活性并且表现出增加的组织和器官gag水平，以及尿液gag排泄。lamp1表达在ids ko的组织中升高。ids ko小鼠表现出进行性骨骼异常，如足趾增厚和踝关节肿胀。
[0216]
在此实例中，使用7-9周龄的野生型和ids ko半合子(ids ko hemi)雄性。向小鼠静脉内施用单剂量的每公斤体重2e13个载体基因组(vg/kg)的包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205或包装在aaav9衣壳中的phm-05205。给药后4周处死小鼠。
[0217]
发现在ids ko hemi小鼠的脑和肝脏组织中检测到载体基因组和hi2s活性。图2示出了在如所指示的施用raav的野生型ids ko hemi雄性或ids ko hemi雄性的肝脏中检测到的载体基因组(图2a)和i2s活性(图2b)。*指示p《0.05时的统计显著性；***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示与wt相比，p《0.0001时的统计显著性。图3示出了在如所指示的施用raav的野生型ids ko hemi雄性或ids ko hemi雄性的脑中检测到的载体基因组(图3a)和hi2s活性(图3b)。发现与脑相比，肝脏中的载体基因组的量以及hi2s活性更高。在脑中，发现载体基因组水平跨首尾轴是类似的，并且与施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠相比，在施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠中似乎更高。
[0218]
图4示出了施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠与施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠相比肝脏和脑中的hi2s活性。发现施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠与施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠相比在肝脏中检测到的hi2s活性水平对于两者都是超生理的(图4a示出了肝脏中i2s活性占野生型i2s活性水平的百分比；图4b示出了肝脏中i2s活性占正常人i2s活性的百分比)。还发现，与施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠相比，施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠表现出显著更高的hi2s活性。在脑中，发现施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠与施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠相比的hi2s活性水平分别为野生型小鼠的约40％和约45％，并且为成年人的约75％和约82％(图5a示出了脑中i2s活性占小鼠i2s活性水平的百分比；图5b示出了脑中i2s活性占正常人i2s活性的百分比)。*指示p《0.05时的统计显著性。
[0219]
发现与未处理的ids ko hemi小鼠(用媒剂处理的ids ko hemi小鼠)相比，施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠和施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠的脑、肝脏和尿液中的gag水平降低。图6示出了野生型(wt)、ids ko hemi小鼠(mps ii)、施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(aav9-hids)、施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(hsc15-hids)和/或代表性的人的肝脏(图6a)、脑(图6b)和尿液(图6c)中的gag水平。发现与野生型水平相比，施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠和施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko小鼠的肝脏和脑中的gag水平下降。在尿液中，发现施用包装在
aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠的gag水平显著低于野生型小鼠的gag水平。*指示p《0.05时的统计显著性，并且**指示p《0.01时的统计显著性。
[0220]
图7示出了在野生型(wt)、ids ko hemi小鼠(mps ii)、施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(aav9-hids)、施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(hsc15-hids)和/或代表性的人的肝脏(图7a)和脑(图7b)中检测到的hids的mrna表达。
[0221]
在给药后12周的肝脏组织和尿液中，施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠表现出持久性和表型挽救。图8a示出了在如所指示的时间的尿液样品中的gag水平挽救到野生型水平：野生型小鼠(wt)、ids ko hemi小鼠(mps ii)和施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(hsc15-hids)。***指示p《0.001时的统计显著性。图8b示出了肝脏中的gag水平挽救到野生型水平：野生型小鼠(wt)、ids ko hemi小鼠(mps ii)和施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(hsc15-hids)。****指示p《0.0001时的统计显著性。图8c示出肝脏中的i2s活性增加：野生型小鼠(wt)和施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(hsc15-hids)。****指示p《0.0001时的统计显著性。另外，发现施用包装在aavhsc15中的phm-05205的ids ko hemi小鼠的肝脏组织中的lamp1减少，如使用抗lamp1抗体通过免疫组织化学所检测。
[0222]
在给药后12周的脑中，施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠显示出持久性和表型挽救。图9a示出了脑中的gag水平挽救到野生型水平：野生型小鼠(wt)、ids ko hemi小鼠(mps ii)和施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(hsc15-hids)。*指示p《0.05时的统计显著性，并且**指示p《0.01时的统计显著性。在野生型小鼠(wt)和施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(图9b和图9c)的脑中检测到hi2s活性。*指示p《0.05时的统计显著性。
[0223]
实例3：人ids转移载体
[0224]
此实例提供用于使人ids(hids)在载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达的人ids转移载体t-004、t-005和t-006。
[0225]
a)t-004
[0226]
ids转移载体t-004，如图10a中所示，5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件；包括cmv启动子的转录调控元件；沉默变更的人ids内含子插入性编码序列；sv40聚腺苷酸化序列；以及3'itr元件。这些元件的序列阐述于表2中。此载体能够在所述载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达人ids蛋白。
[0227]
b)t-005
[0228]
ids转移载体t-005，如图10b中所示，5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件；包括cmv启动子的转录调控元件；沉默变更的人ids内含子插入性编码序列；sv40聚腺苷酸化序列；以及3'itr元件。这些元件的序列阐述于表2中。此载体能够在所述载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达人ids蛋白。
[0229]
c)t-006
[0230]
ids转移载体t-006，如图10c中所示，5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件；包括cmv启动子的转录调控元件；沉默变更的人ids内含子插入性编码序列；sv40聚腺苷酸化序列；以及3'itr元件。这些元件的序列阐述于表2中。此载体能够在所述载体被转导到的细胞
(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达人ids蛋白。
[0231]
表2：人ids转移载体t-004、t-005和t-006中的遗传元件
[0232][0233]
本文所公开的载体可以包装在aav衣壳中，例如，aav进化枝f衣壳，如但不限于aavhsc5、aavhsc7、aavhsc15或aavhsc17衣壳。包装的病毒颗粒可以施用于野生型动物或ids缺陷型动物。
[0234]
实例4：黏多糖贮积症(mps)ii(亨特综合征)小鼠模型中的ids基因转移
[0235]
在此实例中，使用6-9周龄的野生型和ids ko半合子(ids ko hemi，也被称为mps ii)雄性小鼠。向小鼠静脉内施用单剂量的2e13vg/kg的包装在aavhsc15衣壳或aav9衣壳中的phm-05205、t-004、t-005或t-006。给药后4周处死小鼠。
[0236]
图11示出了在以下小鼠的尿液中检测到的gag的水平(图11a)以及以下小鼠的血清i2s活性(图11b)：四只野生型小鼠(wt)；四只ids ko hemi小鼠(mps ii)；四只施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(aav9-hids)；四只施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(hsc15-hids)；八只施用包装在aavhsc15衣壳中的t-004的ids ko hemi小鼠(hsc15-t-004)；四只施用包装在aavhsc15衣壳中的t-005的ids ko hemi小鼠(hsc15-t-005)；以及四只施用包装在aavhsc15衣壳中t-006的ids ko hemi小鼠(hids-t-006)。如图11a所示，与未处理的ids ko hemi小鼠(用媒剂处理的ids ko hemi小鼠)相比，经处理的ids ko hemi小鼠的尿液中的gag水平降低。如图11b所示，在施用包装在aavhsc15衣壳中的t-004、t-005或t-006的ids ko hemi小鼠中可检测到血清i2s活性。*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。
[0237]
图12示出了在以下小鼠的脑和肝脏中检测到的gag的水平(图12a和图12b)以及以下小鼠的脑和肝脏中的i2s活性(图12c和图12d)：野生型小鼠(wt)；ids ko hemi小鼠(mps ii)；施用包装在aav9衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(aav9-hids)；施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05205的ids ko hemi小鼠(hsc15-hids)；施用包装在aavhsc15衣壳中的t-004的ids ko hemi小鼠(hsc15-t-004)；施用包装在aavhsc15衣壳中的t-005的ids ko hemi小鼠(hsc15-t-005)；和/或施用包装在aavhsc15衣壳中t-006的ids ko hemi小鼠(hids-t-006)。如所示出的，与未处理的ids ko hemi小鼠(用媒剂处理的ids ko hemi小鼠)相比，经处理的ids ko hemi小鼠的脑(图12a)和肝脏(图12b)中的gag水平降低。如所示出的，在施用包装在aavhsc15衣壳中的t-004、t-005或t-006的ids ko hemi小鼠的脑(图12c)和肝脏(图12d)中可检测到i2s活性。*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的
统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。
[0238]
实例5：黏多糖贮积症(mps)ii(亨特综合征)小鼠模型中的ids基因转移
[0239]
在此实例中，使用7-10周龄的野生型和ids ko半合子(ids ko hemi，也被称为mps ii)雄性。向小鼠静脉内施用包括2.2e13vg/kg、6.5e13vg/kg和1.1e14vg/kg的剂量范围的包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217，每组5只小鼠。给药后4周处死小鼠。在此实例中，未处理的小鼠是指施用媒剂的小鼠。
[0240]
为了研究包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的安全性，研究了将病毒施用于野生型小鼠的效果。当跨剂量和随时间推移没有观察到体重下降的迹象时，证明了包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的耐受性(图13a和图13b)。如图13a和图13b所示，使用包装在aavhsc15中的phm-05217处理的野生型和ids ko hemi小鼠均未示出体重随时间推移下降的证据。在图13a中，第1组：ids ko hemi小鼠对照；第2组：以2.2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的ids ko hemi小鼠；第3组：以6.5e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的ids ko hemi小鼠；第4组：以1.1e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的ids ko hemi小鼠；以及第5组：野生型小鼠。在图13b中，第5组：野生型小鼠；第6组：以2.2e13vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的野生型小鼠；以及第7组：以1.1e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的野生型小鼠。
[0241]
发现野生型小鼠中的i2s活性依赖于施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的剂量。在血清中，在给药后两周(图14a)和四周(图14b)，以所指示的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的野生型小鼠表现出i2s活性的剂量依赖性增加。未处理的野生型(wt)小鼠和ids ko半合子(mps ii)小鼠用作对照。在肝脏中，在给药后四周(图14c)，以所指示的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的野生型小鼠表现出i2s活性的剂量依赖性增加。这证明人i2s活性在野生型小鼠中是可检测到的，并且野生型小鼠中超过正常水平的i2s活性增加不影响体重。
[0242]
施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的野生型小鼠中的gag水平与未治疗的野生型小鼠中的gag水平类似，并且未发现进一步降低到低于野生型水平。在脑(图15a)和肝脏(图15b)中，发现经处理的ids ko hemi小鼠的gag水平与野生型未处理小鼠(对照)相当。***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。
[0243]
发现脑和肝脏中的表达依赖于施用包装在aavhsc15中的phm-05217的剂量。图16a示出了以所指示的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko hemi小鼠的脑表达，证明表达随剂量增加而增加。图16b示出了以所指示的剂量施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko hemi小鼠的肝脏表达，证明表达随剂量增加而增加。通常，发现肝脏具有比脑更高量的沉默变更的ids表达。*指示p《0.05时的统计显著性，并且***指示p《0.001时的统计显著性。
[0244]
为了研究包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的功效，研究了将病毒施用于ids ko hemi小鼠的效果。在两周时(图17a)在施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的ids ko hemi小鼠中检测到血清i2s活性，并且在给药后四周时保持一致(图17b)。在四周时，发现血清i2s活性是剂量依赖性的，至多6.5e13vg/kg的剂量。**指示p《0.01时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。
[0245]
包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217也示出肝脏中的剂量依赖性i2s活性。图18示出了施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的ids ko hemi小鼠的肝脏i2s活性。**指示p《0.01时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。
[0246]
发现在给药后两周(图19a)和给药后四周(图19b)，就所有剂量而言，施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko hemi小鼠的尿液中的gag水平均降低到野生型水平。发现在给药后四周，施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko半合子小鼠的尿液中的gag硫酸乙酰肝素(gag-hs)(图19c)和gag硫酸皮肤素(gag-ds)(图19d)水平降低到野生型水平。通过质谱法测定gag水平，并且相对于每个尿液样品中的肌酐水平归一化。使用双向方差分析(anova)进行统计分析：ns指示无统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。
[0247]
发现在给药后四周，就所有剂量而言，施用包装在aavhsc15中的phm-05217的ids ko hemi小鼠的肝脏(图20a)、心脏(图20b)、肺(图20c)、脑(图20d)、肾脏(图20e)和脾脏(图20f)中的gag水平均降低到野生型水平。*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且****指示p《0.0001时的统计显著性。
[0248]
实例6：黏多糖贮积症(mps)ii(亨特综合征)小鼠模型中的ids基因转移
[0249]
在另一个实例中，在成年野生型和ids ko半合子小鼠(ids ko hemi；也被称为mps ii)中进行了为期4周的单次静脉内剂量范围发现研究。向小鼠静脉内施用2.2e13vg/kg、6.5e13vg/kg和1.1e14vg/kg的包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217，每组4-5只小鼠。给药后4周处死小鼠。在这些实验中，发现包装在aavhsc15中的phm-05217穿过血脑屏障并转导脑的细胞，从而导致脑中的i2s的表达减少、硫酸乙酰肝素显著减少以及剂量依赖性lamp1减少。还发现血清和肝脏i2s活性是剂量依赖性的。在所有剂量下，发现所有测试的外周组织中硫酸乙酰肝素水平降低。基于mps ii或wt经处理的动物中缺乏体重减轻，发现至多1.1e14vg/kg的包装在aavhsc15中的phm-05217的剂量是可耐受的。
[0250]
发现包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的单次静脉内施用使载体基因组(图21a)和关键鼠外周和中枢器官中的hids转录物(图21b)的水平呈剂量依赖性增加。图21b示出了相对于野生型hids转录物归一化的沉默变更的hids转录物的百分比。发现在所有剂量下，所有器官中的硫酸乙酰肝素(图21c)、硫酸皮肤素(图21d)和/或总gag水平降低。在图21c和21d中，*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，****指示p《0.0001时的统计显著性，并且ns指示不显著。
[0251]
在给药后4周，施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的mps ii小鼠表现出脑中载体基因组水平(图22a)、相对于人野生型hids转录物归一化的沉默变更的hids转录物的百分比(图22b)和i2s活性(图22c)的剂量依赖性增加。发现在给药后四周，就所有剂量而言，施用包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠的脑中的硫酸乙酰肝素水平降低(图22d)。如图22a-22d中所展示的，包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217穿过血脑屏障，转导脑组织，表达沉默变更的hids，实现在脑中可检测到的i2s活性，并且减少脑组织特异性gag。在图22a-22d中，*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且ns指示不显著。
[0252]
为了进一步评估施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217对脑病理学的影响，通过免疫组织化学(ihc)测定了小脑(图23a)、脊髓(图23b)和海马体(图23c)的溶酶体相关膜
蛋白1(lamp1)。lamp1的存在是溶酶体负荷的证据。使用兔多克隆抗lamp1抗体(艾博抗公司(abcam)，ab24170)通过免疫组织化学(ihc)进行lamp1的检测。简而言之，将福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)样品在4μm或6μm下切片并安装到带电的载玻片上。使用自动染色器处理和加工载玻片，并用抗lamp1一级抗体染色30分钟(0.25μg/ml)，并用抗兔标记的聚合物-hrp染色30分钟。拍摄染色切片的图像，并分析像素平均灰度值(pixel mean gray value)，从而允许在切片中的每个切片中半定量报告lamp1的表达。如图23a-23c所示，包装在aavhsc15中的phm-05217穿过血脑屏障，并且导致经处理的mps ii小鼠的cns中lamp1减少的剂量依赖性趋势。在图23a-23c中，*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，****指示p《0.0001时的统计显著性，并且ns指示不显著。
[0253]
还通过ihc分析关键器官(包含肝脏、脾脏、心脏、肾脏和肺)中的lamp1表达。对以1.1e14vg/kg的剂量施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的mps ii小鼠的定性分析证明，与未处理的mps ii小鼠(施用媒剂的mps ii小鼠)相比，经处理的mps ii小鼠的肝脏、脾脏、心脏、肾脏和肺中的lamp1表达减少。
[0254]
在给药后四周，施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的mps ii小鼠示出血清(图24)和肝脏(图25)中i2s活性的剂量依赖性增加。在图24和图25中，**指示p《0.01时的统计显著性，****指示p《0.0001时的统计显著性，并且ns指示不显著。
[0255]
实例7：野生型与沉默变更的hids转移载体之间的比较
[0256]
此实例提供用于人ids(hids)在载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中的表达的人ids转移载体phm-05205。此实例提供hids转移载体t-006与phm-05205的功效之间的比较。t-006在实例3中描述，并且phm-05205在下文描述。
[0257]
phm-05205
[0258]
ids转移载体phm-05205，如图26a中所示，5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件；包括cmv启动子的转录调控元件；野生型人ids内含子插入性编码序列；sv40聚腺苷酸化序列；以及3'itr元件。这些元件的序列阐述于表3中。此载体能够在所述载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达人ids蛋白。
[0259]
表3：人ids转移载体phm-05205中的遗传元件
[0260][0261]
为了测试包括野生型hids编码序列的hids转移载体(phm-05205)和包括沉默变更的hids编码序列的hids转移载体(t-006)的功效，将t-006和phm-05205各自包装在aavhsc15中，并且以6e13vg/kg的剂量施用于mps ii小鼠。给药后4周处死小鼠，并且测量血
清(图26b)和肝脏(图26c)中的i2s活性，以及相对于鼠类g蛋白途径抑制因子1(gps1)的表达归一化的hids转录物的相对表达(图26d)。如图26b和26c所示，在经处理的mps ii小鼠中，与施用野生型hids转移载体(phm-05205；“sc wt”)相比，施用沉默变更的hids转移载体(t-006；“sc sa”)分别使血清和肝脏中的i2s活性显着更高。图26d示出与在经处理的mps ii小鼠中施用野生型hids转移载体相比，施用沉默变更的hids转移载体使脑组织中的hids转录物的相对表达显著更高。使用媒剂处理的mps ii小鼠用作对照。在图26b-26d中，****指示p《0.0001时的统计显著性，并且ns指示不显著。
[0262]
实例8：单链和自身互补的hids转移载体之间的比较
[0263]
此实例提供用于使人ids(hids)在载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达的人ids转移载体phm-05211。此实例提供hids转移载体phm-05205与phm-05211之间的比较。phm-05205在实例7中描述，并且phm-05211在下文描述。
[0264]
phm-05211
[0265]
ids转移载体phm-05211，如图27a中所示，5'至3'包括以下遗传元件：5'itr元件；包括cmv启动子的转录调控元件；野生型人ids内含子插入性编码序列；sv40聚腺苷酸化序列；以及3'itr元件。这些元件的序列阐述于表4中。此载体能够在所述载体被转导到的细胞(例如，人细胞或小鼠细胞)中表达人ids蛋白。
[0266]
表4：人ids转移载体phm-05211中的遗传元件
[0267][0268]
进行了单链hids转移载体(phm-05211；“ss wt”)与自身互补的hids转移载体(phm-05205；“sc wt”)之间的比较。图27b示出了在以2e13vg/kg的剂量施用各自包装在aavhsc15衣壳中的phm-05211或phm-05205的mps ii小鼠中检测到的血清hi2s活性的水平。如所指示的，在给药后6周或8周测量血清hi2s活性。在单链和自身互补的hids转移载体诱导血清hi2s活性的能力之间没有发现显著差异。图27c示出了在用单链或自身互补的转移载体处理的mps ii小鼠中，相对于鼠类g蛋白途径抑制因子1(gps1)的表达归一化的hids转录物的相对表达。如所指示的，在给药后2周或8周处死小鼠，并且在每个队列中的单链或自身互补的转移载体处理的小鼠之间未检测到hids转录物的相对表达之间的差异。ns指示不显著。
[0269]
分析性超离心沉降速度(auc)是基于沉降系数对大分子进行定量的分析方法。对于raav样品的分析，可以使用auc来测定含dna衣壳(完整衣壳和部分完整衣壳)和空衣壳的相对百分比。测定单链和自身互补的转移载体的auc曲线。与自身互补的转移载体的auc曲线相比，单链转移载体的auc曲线展示出更高的完整衣壳百分比。自身互补的转移载体
(phm-05205)产生31.7％的完整包装的衣壳，并且单链转移载体(phm-05211)产生85.0％的完整包装的衣壳。
[0270]
实例9：黏多糖贮积症(mps)ii(亨特综合征)小鼠模型中的hids基因转移
[0271]
此实例描述了在成年野生型和ids ko半合子小鼠(ids ko hemi；也被称为mps ii小鼠)中进行的52周单次静脉内给药时间过程、持久性和功效研究。向小鼠静脉内施用1.8e14vg/kg剂量的包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217，每组3-5只小鼠。
[0272]
发现与对照经媒剂处理的mps ii小鼠相比，向mps ii小鼠静脉内施用单剂量1.8e14vg/kg的包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217产生显著的血清i2s活性(图28a)。到给药后52周可检测到血清i2s活性。
[0273]
在给药后52周，维持载体基因组和表达。到给药后52周，检测经转移载体处理的mps ii小鼠的脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺组织中的载体基因组(图28b)和hids转录物(图28c)的水平。发现在给药1.8e14vg/kg的包装在aavhsc15中的phm-05217后52周，与用媒剂处理的mps ii小鼠相比，脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺组织中的糖胺聚糖硫酸乙酰肝素(gag-hs)水平降低(图28d)。
[0274]
在脑中，在给药后52周观察到lamp-1染色减少，如通过ihc在脊髓(图28e)和海马体(图28f)中所测定。在海马体中，与用媒剂处理的mps ii小鼠相比，在经转移载体处理的mps ii小鼠中lamp-1染色显著减少。在图28e和28f中，*指示p《0.05时的统计显著性，并且ns指示不显著。
[0275]
为了评估血液神经屏障(bnb)的杂交和外周神经系统(pns)的转导，从动物中采集三叉神经节。与用媒剂处理的mps ii小鼠和野生型小鼠相比，在给药后39周，在使用1.8e14vg/kg剂量的包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的mps ii小鼠中检测到载体基因组(图28g)。如图28g所示，发现包装在aavhsc15中的phm-05217穿过bnb并转导pns的细胞。
[0276]
在施用1.8e14vg/kg剂量的包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的mps ii小鼠中检测到肝脏和脑组织特异性i2s酶活性。在给药后12周、24周、39周和52周(图28h)检测到肝脏特异性i2s酶活性，并且在给药后12周(图28i)、24周(图28j)、39周(图28k)和52周(图28l)检测到脑特异性i2s酶活性。在图28j-28l中，正常成年人脑组织用作额外的对照。
[0277]
发现至多在给药后至少52周，与用媒剂处理的mps ii小鼠相比，在施用1.8e14vg/kg的包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠的尿液中检测到的gag-hs的水平降低(图28m)。通过质谱法测定尿液gag-hs水平，并且相对于每个尿液样品中的肌酐水平归一化。在图28m中，数据呈现为每个剂量队列的平均水平(n＝每组3-5只小鼠)。
[0278]
mps ii小鼠的特征在于小脑中浦肯野细胞神经元的进行性变性。在给药后52周，对施用1.8e14vg/kg的包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠进行浦肯野细胞层(pcl)细胞线性密度量化。在用苏木精和伊红(h&e)共染色的矢状脑切片上进行浦肯野细胞线性密度的定量。采集小脑的图像，并对沿浦肯野细胞层(pcl)的400μm长的区域的浦肯野细胞体的总数进行手动计数。每个切片对三个pcl区域进行随机采样(n＝每只动物1个切片)。发现与用媒剂处理的mps ii小鼠相比，施用1.8e14vg/kg的包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠减轻了浦肯野细胞变性(图28n)。在图28n中，**指示p《0.01时的统计显著性，如通过单向方差分析(anova)检验计算的。
[0279]
与野生型动物相比，mps ii小鼠的特征在于骨骼异常，包含颧弓增厚、脚趾增厚和
后爪增大。使用卡尺在动物的去皮头骨上评估颧弓基部形态学测量。发现与用媒剂处理的mps ii小鼠相比，施用1.8e14vg/kg剂量的包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的mps ii小鼠的颧弓厚度减少(图28o)。在图28o中，***指示p《0.01时的统计显著性，并且ns指示不显著。
[0280]
在给药后52周，用1.8e14vg/kg的包装在aavhsc15中的phm-05217处理的mps ii小鼠与未处理的mps ii小鼠(施用媒剂的mps ii小鼠)相比显示出减少的后爪和脚踝增大。脚踝和爪测量是使用数字卡尺并根据图29a中提供的示意图在麻醉小鼠上进行的。如图29b和29c所示，与经媒剂处理的mps ii对照小鼠相比，经转移载体处理的mps ii小鼠表现出改善的爪增厚，如通过爪宽度(图29b)和深度(图29c)两者随时间推移测得的。如图29d和29e所示，与经媒剂处理的mps ii对照小鼠相比，经转移载体处理的mps ii小鼠表现出改善的踝关节肿胀，如通过脚踝宽度(图29d)和深度(图29e)两者随时间推移测得的。
[0281]
实例10：黏多糖贮积症(mps)ii(亨特综合征)小鼠模型中的ids基因转移
[0282]
此实例描述了在成年野生型和ids ko半合子小鼠(ids ko hemi；也被称为mps ii)中进行的8周单次静脉内给药生物动力学研究。向小鼠静脉内施用1.8e14vg/kg剂量的包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217，每组4-5只小鼠。
[0283]
发现与对照经媒剂处理的mps ii小鼠相比，向mps ii小鼠静脉内施用单剂量1.8e14vg/kg的包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217产生显著的血清i2s活性，最早可在给药后一天测量(图30a)。在所有测试的时间点在静脉内施用单次1.8e14vg/kg剂量的包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的mps ii小鼠的脑、心脏、肝脏和脾脏组织中检测到载体基因组(图30b)和表达(图30c)水平。在给药后8周，在静脉内施用单次1.8e14vg/kg剂量的包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217的mps ii小鼠中检测到肝脏组织(图30d)和脑组织(图30e)特异性i2s活性。发现与用媒剂处理的mps ii小鼠相比，在给药1.8e14vg/kg的包装在aavhsc15中的phm-05217后8天(图31a)、2周(图31b)和8周(图31c)时间点处，脑、心脏、肝脏和脾脏组织中的糖胺聚糖硫酸乙酰肝素(gag-hs)水平降低。发现在给药后3天以及至多在给药后至少8周，与用媒剂处理的mps ii小鼠相比，在施用1.8e14vg/kg的包装在aavhsc15中的phm-05217的mps ii小鼠的尿液中检测到的gag-hs的水平从基线水平降低(图31d)。在图30a-31d中，*指示p《0.05时的统计显著性，**指示p《0.01时的统计显著性，***指示p《0.001时的统计显著性，并且ns指示无统计显著性。
[0284]
实例11：黏多糖贮积症(mps)ii(亨特综合征)小鼠模型中的ids基因转移
[0285]
使用高效液相色谱质谱法，通过在肝素酶消化后测量csf样品中的硫酸乙酰肝素特异性二糖来测定小鼠的脑脊髓液(csf)中的糖胺聚糖硫酸乙酰肝素(gag-hs)水平。在给药后12周，在野生型(wt)小鼠、用媒剂处理的mps ii小鼠以及通过以6e13vg/kg(mps ii 6e+13)、1e14vg/kg(mps ii 1e+14)或2e14vg/kg(mps ii 2e+14)的剂量静脉内施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217处理的mps ii小鼠的csf中测量gag-hs水平，如图32a中所指示的。与用媒剂处理的mps ii小鼠相比，在所有测试的剂量下均观察到csf gag-hs水平降低。在图32a中，每组有三个csf样品，汇集自总共五只小鼠。使用单向方差分析(anova)进行统计分析。*指示p《0.05时的统计显著性，并且**指示p《0.01时的统计显著性。在给药后12周，野生型(wt)小鼠、用媒剂处理的mps ii小鼠以及通过以6e13vg/kg(mps ii 6e+13)、1e14vg/kg(mps ii 1e+14)或2e14vg/kg(mps ii 2e+14)的剂量静脉内施用包装在
aavhsc15衣壳中的phm-05217处理的mps ii小鼠的脑组织中的gag-hs水平，如图32b中所指示的。如图32b所示，与用媒剂处理的未处理的mps ii小鼠相比，在所有测试的剂量下均观察到脑gag-hs水平降低。使用单向方差分析(anova)进行统计分析。****指示p《0.0001时的统计显著性。
[0286]
在给药后12周，在野生型(wt)小鼠、mps ii小鼠以及用以6e13vg/kg(mps ii 6e+13)、1e14vg/kg(mps ii 1e+14)或2e14vg/kg(mps ii 2e+14)的剂量静脉内施用包装在aavhsc15衣壳中的phm-05217处理的mps ii小鼠的脑组织中检测到i2s活性，如图32c中所指示的。正常成年人脑组织用作额外对照。使用单向方差分析(anova)测试进行统计分析。*指示p《0.05时的统计显著性，并且***指示p《0.001时的统计显著性。
[0287]
实例12：ids基因转移交叉校正
[0288]
为了研究从aav基因转移载体表达的i2s的交叉校正能力，向mps ii小鼠静脉内施用1.8e14vg/kg的包装在aavhsc15中的phm-05217，并测定血清。
[0289]
艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶是翻译后修饰的。通过添加甘露糖6-磷酸(m6p)部分，将初始73-78kda ids蛋白转化为90kda磷酸化前体。然后将90kda前体通过各种中间体的蛋白水解切割加工成主要的55kda中间体，并释放18kda多肽。通过硫醇蛋白酶的进一步蛋白水解切割产生45kda成熟形式，含有杂合型和复合型寡糖链。
[0290]
简而言之，在给药后8天，培养ids ko hela细胞并与从用1.8e14vg/kg的包装在aavhsc15中的phm-05217处理的mps ii小鼠获得的小鼠血清一起温育。在存在或不存在m6p的情况下，将细胞与经处理的小鼠血清一起温育48小时。用山羊抗hids一级抗体探测并使用驴抗山羊二级抗体检测的蛋白质印迹证实了以下：(1)通过包装在aavhsc15中的phm-05217制备的hids蛋白以90kda前体形式在经处理的mps ii小鼠的血清中循环；(2)90kda形式是催化活性的；并且(3)90kda形式由ids ko hela细胞通过m6p依赖性途径摄取，并且在ids ko hela细胞的溶酶体中加工成中间55kda蛋白和成熟45kda蛋白。
[0291]
在ids ko hela细胞与从经处理的mps ii小鼠获得的小鼠血清一起温育之后，将细胞离心并去除上清液。然后裂解沉淀细胞并测定hi2s活性。图33示出了在ids ko细胞(对照)、与无m6p的经处理的mps ii小鼠血清一起温育的ids ko细胞和与经处理的含m6p的mps ii小鼠血清一起温育的ids ko细胞中检测到的i2s活性的水平。如图33所示，在使用1.8e14vg/kg的包装在aavhsc15中的phm-05217后8天，在用从mps ii小鼠获得的血清处理的ids ko hela细胞的裂解物中可检测到i2s活性。发现当存在m6p时，i2s活性较低，这表明，不受任何理论束缚，m6p竞争m6p受体，因此在体外，hi2s摄取由m6p受体途径介导。*指示p《0.05时的统计显著性，并且***指示p《0.001时的统计显著性。
[0292]
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本发明不应限于本文所描述的具体实施例的范围。实际上，根据前文的描述和附图，除了所描述的修改之外，本发明的各种修改对于所属领域技术的人员来说也将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
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本文所引用的全部参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)均通过引用并且出于所有目的整体并入本文，其程度如同每个单独的参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)出于所有目的被具体地或单独地指示通过引用整体并入一样。其它实施例处于以下权利要求内。