纳米递送系统及其治疗和诊断用途的制作方法

1.本发明属于用于治疗和诊断用途的靶向脑的纳米递送系统领域。


背景技术：

2.治疗神经退行性障碍和疾病中的一个关键问题是难以克服血脑屏障(bbb)以将重要的治疗和诊断药剂递送到脑。bbb是一个高度选择性的半透性边界，将循环血与中枢神经系统(cns)分开。bbb主要用作脑的保护性屏障，防止包括激素、神经递质或神经毒素在内的各种不同要素从血流转移到cns中。尽管位于bbb上的特异性和选择性转运蛋白为cns提供葡萄糖、游离脂肪酸、氨基酸、维生素、矿物质和电解质，但几乎所有的高分子量药物和超过98％的低分子量药物不能跨过bbb。
3.为了克服与bbb相关的限制，正在开发各种不同的基于纳米材料的药物递送系统。
4.us 10,182,986涉及通过向受试者施用具有纳米粒子核心和靶向剂的纳米粒子，将纳米粒子跨过血脑屏障递送到所述受试者的脑的方法。
5.ruan,shaobo等(biomaterials 37(2015):425-435)提供了一种基于金纳米粒子的递送系统，所述系统通过腙这种酸响应性连接物装载有多柔比星(dox)，并用angiopep-2这种低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(lrp1)的特异性配体官能化，这能够介导所述系统穿透血脑屏障并靶向神经胶质瘤细胞。
6.shilo,malka等(nanoscale 6.4(2014):2146-2152)涉及将胰岛素靶向性金纳米粒子(ins-gnp)运输通过血脑屏障，用于成像和治疗应用。
7.对用于将治疗和/或诊断药剂跨过bbb运输并将它们递送到脑中的高效系统，仍存在着未满足的需求。能够将各种不同药剂递送到脑中的通用平台是非常合乎需要的。


技术实现要素：

8.本发明提供了一种用于将具有低血脑屏障(bbb)穿透性的分子递送到脑中的通用平台。所述递送系统是基于一种核心纳米粒子，其通过第一聚合连接物偶联到脑内化转运蛋白组成部分，并进一步偶联到能够结合感兴趣的治疗或诊断药剂的第二聚合连接物。因此，本发明的递送系统可用于治疗和/或诊断广范围的脑相关疾病或障碍。
9.本发明的发明人已显示，包括抗体、肽和小分子在内的各种不同类型的具有不良bbb穿透性的分子，当被偶联到本发明的递送系统时能够高效穿透到小鼠脑中，其中所述核心纳米粒子是金纳米粒子(gnp)或氧化铁纳米粒子，并且所述脑内化转运蛋白组成部分是胰岛素或转铁蛋白。本发明部分是基于下述令人吃惊的发现，即所述第一和第二聚合连接物的相对长度对所述递送系统穿透bbb具有关键影响。具体来说，出人意料地发现，当使用不同尺寸的聚合连接物将胰岛素和抗体偶联到核心纳米粒子时，实现了偶联到胰岛素和所述抗体的gnp的高效bbb穿透。进一步令人吃惊地发现，用于偶联抗体的连接物的相对量影响所述递送系统穿透到脑中的效率。
10.本发明的递送系统的有益特点之一是偶联到所述递送系统的治疗药剂的活性保
持完整，使得不必例如通过使用可切割的连接物在穿过bbb后从所述纳米粒子上脱离下来。具体来说，已出人意料地发现，与本发明的纳米递送系统结合的抗体尽管是通过稳定的、不可切割的共价连接来偶联的，但仍保持其活性和功能。
11.根据一个方面，提供了一种纳米递送系统，其包含：无机纳米粒子，其与第一线性聚合连接物和第二线性聚合连接物结合，其中所述第一和第二线性聚合连接物具有显著不同的长度；脑内化转运蛋白组成部分，其被偶联到所述第一线性聚合连接物；和选自生物活性分子或标记分子的活性药剂，其中所述药剂被偶联到所述第二线性聚合连接物。
12.根据某些实施方式，所述第一和第二聚合连接物在生理条件下不可切割。
13.根据某些实施方式，所述第一和第二线性聚合连接物的相应分子量相差至少约1400da。根据其他实施方式，所述第一和第二线性聚合连接物的分子量在1,000-10,000da的范围内。在某些实施方式中，所述第一线性聚合连接物的分子量高于所述第二线性聚合连接物的分子量。
14.根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物由重复单体单元组成，并且所述第二线性聚合连接物由与所述第一线性聚合连接物相同的重复单体单元组成，并且所述第一线性聚合连接物具有与所述第二线性聚合连接物不同数目的重复单体单元。
15.根据某些实施方式，所述脑内化转运蛋白组成部分通过所述第一线性聚合连接物的第一末端官能团共价偶联到所述连接物，并且所述活性药剂通过所述第二线性聚合连接物的第二末端官能团共价偶联到所述连接物。在其他实施方式中，所述第一末端官能团和第二末端官能团相同。
16.根据某些实施方式，所述无机纳米粒子通过硫键与所述第二线性聚合连接物结合，并且所述活性药剂通过酰胺键偶联到所述第二线性聚合连接物。
17.根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物占与所述无机纳米粒子结合的总聚合连接物的约5％mol至60％mol。
18.根据某些实施方式，所述活性药剂是生物活性分子。所述活性药剂可以选自大分子、肽、小分子、寡核苷酸、反义rna及其任何组合。在某些实施方式中，所述大分子是抗体。在其他实施方式中，所述第一线性聚合连接物占与所述无机纳米粒子结合的总聚合连接物的约10％mol至40％mol。
19.根据某些实施方式，所述第二线性聚合连接物占与所述无机纳米粒子结合的总聚合连接物的约5％mol至60％mol。
20.根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物和第二线性聚合连接物独立地包含选自下述的聚合物：聚醚，聚丙烯酸酯，聚酐，聚乙烯醇，多糖，聚(n-乙烯基吡咯烷酮)，聚甘油(pg)，聚(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)，聚噁唑啉，基于聚(氨基酸)的混杂物，重组多肽，其衍生物及其组合。根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物和第二线性聚合连接物中的至少一者是聚醚。在某些示例性实施方式中，所述聚醚是聚乙二醇(peg)。所述聚乙二醇可以选自硫醇化peg酸(hs-peg-cooh)和硫醇化peg胺(hs-peg-nh2)，其中硫醇化末端与所述无机纳米粒子结合并且酸或胺末端被偶联到所述脑内化转运蛋白组成部分或所述活性药剂。
21.根据某些实施方式，所述纳米递送系统还包含与所述无机纳米粒子结合的第三聚合连接物，其中所述第三聚合连接物是单功能的。根据某些实施方式，所述第三聚合连接物
包含选自下述的聚合物：聚醚，聚丙烯酸酯，聚酐，聚乙烯醇，多糖，聚(n-乙烯基吡咯烷酮)，聚甘油(pg)，聚(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)，聚噁唑啉，基于聚(氨基酸)的混杂物，重组多肽，其衍生物及其组合。在某些示例性实施方式中，所述第三聚合连接物包含聚醚，其中所述聚醚是甲氧基聚乙二醇(mpeg)。
22.根据某些实施方式，所述无机纳米粒子选自金属纳米粒子、金属氧化物纳米粒子、陶瓷纳米粒子及其任何组合。所述金属可以选自金、银、铂、铁及其任何组合。所述金属氧化物可以选自氧化铁、氧化镁、氧化镍、氧化钴、氧化铝、氧化锌、氧化铜、氧化锰及其任何组合。在某些示例性实施方式中，所述无机纳米粒子选自金、氧化铁(iii)和氧化铁(ii,iii)。根据某些实施方式，所述无机纳米粒子具有10-160nm的直径。
23.根据某些实施方式，所述脑内化转运蛋白组成部分选自：胰岛素，特异性针对胰岛素受体的抗体，转铁蛋白，特异性针对转铁蛋白受体的抗体，与转铁蛋白受体特异性结合的多肽，与胰岛素受体特异性结合的多肽，胰岛素样生长因子1，特异性针对胰岛素样生长因子受体1的抗体，与胰岛素样生长因子受体1特异性结合的多肽，载脂蛋白a1、b或e，乳铁蛋白，angiopep-2，低密度脂蛋白，特异性针对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的抗体，与低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性结合的多肽，特异性针对白喉毒素受体的抗体，与白喉毒素受体特异性结合的多肽，bbb穿透性细胞穿透肽(cpp)，及其任何组合。在某些实施方式中，所述脑内化转运蛋白组成部分是胰岛素。
24.根据某些示例性实施方式，所述无机纳米粒子是金纳米粒子，所述第一线性聚合连接物是硫醇化peg5000酸或硫醇化peg5000胺，所述第二线性聚合连接物是硫醇化peg3500酸或硫醇化peg3500胺，并且所述脑内化转运蛋白组成部分是胰岛素。
25.根据某些示例性实施方式，所述无机纳米粒子是氧化铁纳米粒子，所述第一线性聚合连接物是硫醇化peg5000酸或硫醇化peg5000胺，所述第二线性聚合连接物是硫醇化peg3500酸或硫醇化peg3500胺，并且所述脑内化转运蛋白组成部分是胰岛素。
26.根据某些示例性实施方式，所述无机纳米粒子是金纳米粒子，所述第一线性聚合连接物是硫醇化peg1000酸或硫醇化peg1000胺，所述第二线性聚合连接物是硫醇化peg5000酸或硫醇化peg5000胺，并且所述脑内化转运蛋白组成部分是胰岛素。
27.根据某些示例性实施方式，所述无机纳米粒子是金纳米粒子，所述第一线性聚合连接物是硫醇化peg5000酸或硫醇化peg5000胺，所述第二线性聚合连接物是硫醇化peg3500酸或硫醇化peg3500胺，并且所述脑内化转运蛋白组成部分是转铁蛋白。
28.另一方面，提供了一种制备根据上文描述的各种不同实施方式的纳米递送系统的方法，所述方法包括下述顺序步骤：(a)用所述第一线性聚合连接物部分包被所述无机纳米粒子的表面，然后将所述第一线性聚合连接物偶联到所述脑内化转运蛋白组成部分；和(b)用所述第二线性聚合连接物部分包被所述无机纳米粒子的表面，然后将所述第二线性聚合连接物偶联到所述活性药剂，其中步骤(a)和步骤(b)可以以任何顺序进行。
29.根据某些实施方式，所述第一聚合连接物具有被配置以结合所述脑内化转运蛋白组成部分的第一末端官能团，并且所述第二聚合连接物具有被配置以结合所述活性药剂的第二末端官能团，其中所述第一官能团和第二官能团相同。
30.根据某些实施方式，所述方法还包括用第三聚合连接物部分包被所述无机纳米粒子的表面，其中所述聚合连接物是单功能连接物。
31.根据某些实施方式，所述活性药剂是抗体或肽，并且步骤(a)在步骤(b)之前进行。
32.根据某些实施方式，所述活性药剂是小分子，并且步骤(a)在步骤(b)之后进行。
33.根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物和第二线性聚合连接物中的每一者以适合于覆盖所述无机纳米粒子的表面的5％至60％之间的量添加。
34.又一方面，提供了一种药物组合物，其包含根据上文呈现的各种不同实施方式的纳米递送系统和可药用载体。
35.根据某些实施方式，所述药物组合物被配制成用于静脉内(iv)给药、鼻内(in)给药和鞘内(it)给药中的至少一者。根据某些实施方式，所述药物组合物用于在有需要的受试者中预防、治疗和/或监测脑相关疾病或障碍。
36.又一方面，提供了一种在有需要的受试者中预防、治疗和/或监测脑相关疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据上文描述的各种不同实施方式的药物组合物。
37.根据某些实施方式，所述药物组合物通过静脉内(iv)给药、鼻内(in)给药和鞘内(it)给药中的至少一者给予所述受试者。
38.根据某些实施方式，所述方法还包括对所述受试者的脑进行成像，从而评估所述纳米递送系统在所述受试者脑中的积累的步骤。所述成像可以使用选自下述的成像系统来进行：计算机断层扫描成像(ct)，x-射线成像，磁共振成像(mri)，正电子发射断层扫描(pet)，单光子发射计算机断层扫描(spect)，超声波(us)及其任何组合。
39.又一方面，提供了一种纳米递送系统，其包含：无机纳米粒子，其与第一线性聚合连接物和第二线性聚合连接物结合，其中所述第一和第二线性聚合连接物具有显著不同的长度；和脑内化转运蛋白组成部分，其偶联到所述第一线性聚合连接物，其中所述第二聚合连接物具有被配置用于偶联选自生物活性分子或标记分子的活性药剂的游离末端官能团。
40.根据某些实施方式，所述第一和第二聚合连接物在生理条件下不可切割。
41.根据某些实施方式，所述第一和第二线性聚合连接物的相应分子量相差至少约1000da。根据某些实施方式，所述第一和第二线性聚合连接物的相应分子量相差至少约1400da。根据其他实施方式，所述第一和第二线性聚合连接物的分子量在1,000-10,000da的范围内。在某些实施方式中，所述第一线性聚合连接物的分子量高于所述第二线性聚合连接物的分子量。
42.根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物由重复单体单元组成，并且所述第二线性聚合连接物由与所述第一线性聚合连接物相同的重复单体单元组成，并且其中所述第一线性聚合连接物具有与所述第二线性聚合连接物不同数目的重复单体单元。
43.根据某些实施方式，所述脑内化转运蛋白组成部分通过所述第一线性聚合连接物的第一末端官能团共价偶联到所述连接物。根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物的第一末端官能团和所述第二线性聚合连接物的被配置用于偶联活性药剂的末端官能团相同。
44.根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物占与所述无机纳米粒子结合的总聚合连接物的约5％mol至60％mol。在其他实施方式中，所述第一线性聚合连接物占与所述无机纳米粒子结合的总聚合连接物的约10％mol至40％mol。根据某些实施方式，所述第二线性聚合连接物占与所述无机纳米粒子结合的总聚合连接物的约5％mol至60％mol。
45.根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物和第二线性聚合连接物独立地包含选自下述的聚合物：聚醚，聚丙烯酸酯，聚酐，聚乙烯醇，多糖，聚(n-乙烯基吡咯烷酮)，聚甘油(pg)，聚(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)，聚噁唑啉，基于聚(氨基酸)的混杂物，重组多肽，其衍生物及其组合。根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物和第二线性聚合连接物中的至少一者是聚醚。在某些实施方式中，所述聚醚是聚乙二醇(peg)。所述聚乙二醇可以选自硫醇化peg酸(hs-peg-cooh)和硫醇化peg胺(hs-peg-nh2)，其中硫醇化末端与所述无机纳米粒子结合，并且酸或胺末端被偶联到所述脑内化转运蛋白组成部分或被配置以偶联到所述活性药剂。
46.根据某些实施方式，所述纳米递送系统包含与所述无机纳米粒子结合的第三聚合连接物，其中所述第三聚合连接物是单功能的。根据某些实施方式，所述第三聚合连接物包含选自下述的聚合物：聚醚，聚丙烯酸酯，聚酐，聚乙烯醇，多糖，聚(n-乙烯基吡咯烷酮)，聚甘油(pg)，聚(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)，聚噁唑啉，基于聚(氨基酸)的混杂物，重组多肽，其衍生物及其组合。在某些示例性实施方式中，所述第三聚合连接物包含聚醚，其中所述聚醚是甲氧基聚乙二醇(mpeg)。
47.根据某些实施方式，所述无机纳米粒子选自金属纳米粒子、金属氧化物纳米粒子、陶瓷纳米粒子及其任何组合。所述金属可以选自金、银、铂、铁及其任何组合。所述金属氧化物可以选自氧化铁、氧化镁、氧化镍、氧化钴、氧化铝、氧化锌、氧化铜、氧化锰及其任何组合。在某些实施方式中，所述无机纳米粒子选自金、氧化铁(iii)和氧化铁(ii,iii)。根据某些实施方式，所述无机纳米粒子具有10-160nm的直径。
48.根据某些实施方式，所述脑内化转运蛋白组成部分选自：胰岛素，特异性针对胰岛素受体的抗体，转铁蛋白，特异性针对转铁蛋白受体的抗体，与转铁蛋白受体特异性结合的多肽，与胰岛素受体特异性结合的多肽，胰岛素样生长因子1，特异性针对胰岛素样生长因子受体1的抗体，与胰岛素样生长因子受体1特异性结合的多肽，载脂蛋白a1、b或e，乳铁蛋白，angiopep-2，低密度脂蛋白，特异性针对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的抗体，与低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性结合的多肽，特异性针对白喉毒素受体的抗体，与白喉毒素受体特异性结合的多肽，bbb穿透性细胞穿透肽(cpp)，及其任何组合。在某些实施方式中，所述脑内化转运蛋白组成部分是胰岛素。
49.本发明的其他实施方式和全部适用范围将从下文给出的详细描述变得显而易见。然而，应该理解，所述详细描述和具体实例尽管指示了本发明的优选实施方式，但仅仅作为说明给出，因为从该详细描述，在本发明的精神和范围之内的各种不同改变和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
附图说明
50.图1：金纳米粒子(gnp；1)的示意图，其结合有：i)偶联到胰岛素(3)的第一线性聚合连接物(2)；ii)偶联到生物活性分子(例如抗体；5)的更短的第二线性聚合连接物(4)；和iii)带有惰性末端基团的聚合物组成部分(6)。
51.图2:在各种不同合成步骤之后egfr&ins-gnps的紫外可见光谱：包被前(gnps)；用pegs(～5kda)和胰岛素包被后(gnps+pegs+ins)；用额外的peg连接物包被后(～3.5kda；gnps+pegs+ins+peg)；和最终在偶联egfr ab后(gnps+pegs+ins+peg+ab)。
52.图3：游离胰岛素(游离ins)、游离egfr ab(游离ab)、gnp、peg包被的gnp(gnp+peg)、胰岛素包被的gnp(gnp+peg+ins)和egfr+ins-gnp(gnp+peg+ins+ab)的sds-page。
53.图4a-4c：在下述治疗后5小时小鼠脑的代表性微型ct 3d体积渲染图像：静脉内(iv)施用200μl mpeg-gnps(对照；图4a)；静脉内(iv)施用200μl egfr-ins-gnps(图4b)；和鼻内(in)施用20μl egfr-ins-gnps(图4c)。
54.图5a：在静脉内施用egfr&ins-gnps后的各个不同时间点，小鼠脑组织中发现的au的量的定量(mg)，其通过icp-ms分析测量。
55.图5b：在静脉内施用egfr&ins-gnps后的各个不同时间点，小鼠肾脏和肝脏中发现的au的量的定量(mg)，其通过icp-ms分析测量。
56.图6a：在静脉内施用igg1&ins-gnps或游离荧光igg1抗体后8小时，小鼠脑组织中发现的au的量的定量，其通过icp-ms分析测量(mg au/gr组织)。
57.图6b：用igg1&ins-gnps(右图)或游离荧光抗体(左图)治疗的小鼠的脑切片的代表性共聚焦免疫细胞化学荧光图像。
58.图7a-7b：用anti-iba1&ins-gnps(图7a)或游离荧光anti-iba1(图7b)治疗的小鼠的额叶脑切片的代表性超分辨率显微镜图像。
59.图8：包被前(裸gnps)、用peg包被后的gnps和最终的pep&ins-gnps的紫外可见光谱。
60.图9a-9b：在静脉内(iv)施用pep&ins-gnps后6小时小鼠脑的代表性微型ct图像。图9a：wt小鼠；图9b：5xfad小鼠。
61.图9c：在静脉内施用pep&ins-gnps后6小时wt小鼠(对照)和5xfad小鼠(阿尔茨海默病)的脑组织中发现的au的量的定量，其通过icp-ms分析测量(mg au/gr组织)。
62.图9d：来自于对照小鼠(wt；上方图像)或5xfad小鼠(阿尔茨海默病模型小鼠；下方图像)的海马冠状切片在与荧光标记的pep&ins-gnps温育20小时后的荧光显微镜图像(x20放大倍数；比例尺＝100μm)。图像从左至右：细胞内核定位(dapi染色)；aβ斑块定位(6e10染色)；pep&ins-gnps定位；和合并的荧光图像。
63.图10a：在静脉内施用顺铂+胰岛素-gnps或游离顺铂后8小时小鼠脑组织中发现的au的量的定量，其通过icp-ms分析测量(mg au/gr组织)。
64.图10b：在静脉内施用顺铂+胰岛素-gnps或游离顺铂后8小时小鼠脑组织中发现的pt的量的定量，其通过icp-ms分析测量(mg pt/gr组织)。
65.图11：在与mpeg-gnps(对照粒子)、igg1&trf-gnps或igg1&ins-gnps温育2小时后bmec样细胞(ibmecs)的跨内皮电阻(teer)的降低。
66.图12a：在静脉内施用具有范围在5％至50％之间的不同胰岛素水平的igg1&ins-gnps后8小时，小鼠脑中发现的au的量的定量(mg/gr组织)。
67.图12b：在静脉内施用具有范围在20％至85％之间的不同igg1 ab水平的igg1&ins-gnps后8小时，小鼠脑中发现的au的量的定量(mg/gr组织)。
68.图12c：在静脉内施用使用不同尺寸的peg连接物制备的igg1&ins-gnps后8小时，小鼠脑中发现的au的量的定量(mg/gr组织)。
具体实施方式
69.本发明提供了一种用于将不同类型的具有低bbb穿透性的分子递送到脑中的通用纳米递送系统，以及制备所述系统的方法。所述递送系统基于一种核心纳米粒子，其通过第一聚合连接物偶联到脑内化转运蛋白组成部分，并进一步偶联到能够结合治疗或诊断药剂的第二聚合连接物。不希望受到任何理论或机制限制，假设所述脑内化转运蛋白组成部分促进整个偶联系统穿过bbb进入脑中。因此，本发明的递送系统可用于治疗和/或诊断广范围的脑相关疾病或障碍。本发明还提供了用于治疗和/或诊断用途的药物组合物和方法。
70.本发明部分是基于下述令人吃惊的发现，即偶联到脑内化转运蛋白组成部分(例如胰岛素)和生物活性分子的纳米粒子可以克服血脑屏障的限制机制，并提供用于将诊断和/或治疗药剂靶向递送到脑中的纳米递送系统，而不需在bbb穿透后从所述递送系统释放所述药剂。作为诊断，这种方法在某些实施方式中能够进行神经退行性疾病的早期检测。作为治疗，在某些实施方式中，这种方法能够递送靶向治疗药剂。
71.纳米递送系统
72.根据一个方面，提供了一种纳米递送系统，其包含：
73.(a)纳米粒子，其与第一线性聚合连接物和第二线性聚合连接物结合，其中所述第一和第二线性聚合连接物具有显著不同的长度；
74.(b)脑内化转运蛋白组成部分，其偶联到所述第一线性聚合连接物；和
75.(c)选自生物活性分子或标记分子的活性药剂，其中所述药剂被偶联到所述第二线性聚合连接物。
76.根据另一方面，提供了一种纳米递送系统，其包含：与第一聚合连接物和第二聚合连接物结合的纳米粒子；和偶联到所述第一聚合连接物的脑内化转运蛋白组成部分，其中所述第一和第二聚合连接物具有显著不同的长度，并且其中所述第二聚合连接物具有被配置用于偶联选自生物活性分子或标记分子的活性药剂的游离末端官能团。
77.当在本文中使用时，可以与术语“粒子”或“核壳粒子”互换使用的术语“纳米递送系统”是指一种基于纳米粒子的系统，其能够将选自生物活性物质或标记分子(例如成像剂)的活性药剂递送到靶区域即受试者的脑，或在某些实施方式中递送到受试者脑中的特定区域。根据本发明的原理，所述活性药剂通过聚合连接物偶联到核心纳米粒子的外表面，而不是装载或包封在纳米粒子核心内。
78.在某些实施方式中，本发明提供了一种包含核心和外壳的粒子，其中所述核心包含纳米粒子，并且所述外壳包含聚合物结合的生物活性分子或标记分子和聚合物结合的脑内化转运蛋白组成部分。当在本文中使用时，术语“外壳”是指粒子的外部部分，具有与核心不同的组成。在某些实施方式中，所述脑内化转运蛋白组成部分在外壳中的体积比(v/v)为5至60％。
79.在本文中可互换使用的术语“纳米粒子”和“核心纳米粒子”是指直径在1至1000nm之间的粒子，其构成所述递送系统的中心部分。所述核心纳米粒子被包含至少两种聚合物的聚合物层包被：与脑内化转运蛋白组成部分结合的第一聚合连接物，和具有能够结合生物活性分子或标记分子的游离末端官能团的第二聚合连接物。在某些实施方式中，所述第二聚合物与生物活性分子或标记分子结合。因此，本发明的递送系统可以被视为核壳粒子，其中核心是纳米粒子，外壳包含含有其相应偶联分子的聚合连接物。
150nm、1-200nm、2-50nm、2-100nm、2-150nm、4-50nm、4-100nm、4-150nm或4-200nm的直径。每种可能性代表独立的实施方式。根据某些实施方式，所述粒子具有至少1nm、至少2nm、至少5nm、至少10nm、至少15nm、至少20nm、至少25nm、至少30nm、至少35nm、至少40nm、至少45nm、至少50nm、至少55nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、至少120nm、至少130nm、至少140nm、至少150nm、至少160nm、至少180nm或至少200nm的直径。每种可能性代表独立的实施方式。根据某些实施方式，所述粒子具有至多5nm、至多20nm、至多30nm、至多40nm、至多50nm、至多60nm、至多70nm、至多80nm、至多90nm、至多100nm、至多110nm、至多120nm、至多130nm、至多140nm、至多150nm、至多180nm、至多200nm、至多250nm、至多300nm、至多350nm、至多400nm、至多450nm或至多500nm的直径。每种可能性代表独立的实施方式。
88.根据某些实施方式，所述核心纳米粒子具有1-200nm、1-180nm、1-160nm、1-140nm、1-120nm、1-100nm、1-90nm、1-80nm、1-70nm、1-60nm、1-50nm、1-40nm、2-100nm、2-60nm、2-50nm、2-40nm、2-30nm、2-20nm、2-10nm、3-100nm、3-60nm、3-50nm、3-40nm、3-30nm、3-20nm、4-100nm、4-60nm、4-50nm、4-40nm、5-200nm、6-190nm、7-180nm、8-170nm、10-160nm、20-160nm、10-150nm、10-140nm、10-120nm、10-110nm、10-100nm、10-90nm、10-80nm、12-70nm、14-60nm、15-50nm、15-40nm、15-30nm、20-30nm、15-30nm、20-90nm、20-80nm、20-70nm、20-60m、20-50nm、20-40nm、20-30nm、30-70nm、30-60nm、40-60nm、10-200nm、20-200nm、30-200nm、40-200nm、50-200nm、60-200nm、70-200nm、80-200nm 90-200nm、100-200nm、110-190nm、120-170nm、130-160nm、100-160nm、80-160nm、60-160nm、40-160nm、20-160nm、10-160nm、20-150nm或30-150nm的直径。每种可能性代表独立的实施方式。根据某些实施方式，所述纳米粒子具有至少1nm、至少2nm、至少3nm、至少4nm、至少5nm、至少10nm、至少12nm、至少15nm、至少18nm、至少20nm、至少25nm、至少30nm、至少35nm、至少40nm、至少45nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、至少120nm、至少130nm、至少140nm或至少150nm的直径。每种可能性代表独立的实施方式。根据某些实施方式，所述纳米粒子具有至多5nm、至多10nm、至多15nm、至多20nm、至多30nm、至多40nm、至多50nm、至多60nm、至多70nm、至多80nm、至多90nm、至多100nm、至多120nm、至多140nm、至多160nm、至多180nm或至多200nm的直径。每种可能性代表独立的实施方式。
89.当在本文中使用时，术语粒子/纳米粒子的“直径”可以与术语粒子/纳米粒子的“尺寸”互换使用，并且是指所描述的粒子/纳米粒子的表面上两点之间的最大直线距离。当在本文中使用时，术语“直径”涵盖了球形粒子以及非球形粒子的尺寸，并且可以是指粒子的真实尺寸或其包括来自溶剂化范围的贡献的流体动力学直径。可以使用本领域中已知的任何方法来确定粒子的尺寸，例如透射电子显微术(tem)、扫描电子显微术(sem)和动态光散射(dls)。术语“直径”可以是指通过任何上述技术测量的多个粒子的平均直径。
90.在某些实施方式中，所述核心纳米粒子被聚合物层包被，所述聚合物层包含与所述核心纳米粒子结合的至少两种聚合物组成部分。在某些实施方式中，所述至少两种聚合物组成部分是聚合连接物。
91.当在本文中使用时，术语“包被”意指一个层例如包含多个聚合物组成部分的聚合物层被化学附连到所述核心纳米粒子的表面，从而至少部分覆盖所述核心纳米粒子。“用聚合物层包被的纳米粒子”意味着所述聚合物层中的每个聚合物组成部分通过所述聚合物组
成部分的末端官能团例如硫醇基团化学附连到所述纳米粒子。所述化学附连可以是共价、半共价或非共价的。
92.术语“聚合物组成部分”可以与术语“聚合物”互换使用，并且是指含有以线性、分支、超分支、树枝状或环状顺序或其任何组合连接的两个或更多个重复亚单元的分子。在某些实施方式中，术语“聚合物组成部分”是指含有以线性、分支、超分支、树枝状或环状顺序或其任何组合连接的至少3个重复亚单元的分子。亚单元的实例包括亚烷基、亚芳基、亚杂烷基、氨基酸、核酸、糖类等。聚合物组成部分的实例包括但不限于聚(乙二醇)基团、聚(乙烯胺)基团和聚(氨基酸)基团。术语“聚合物组成部分”和“聚合物”还涵盖聚合连接物。当在本文中使用时，术语“聚合连接物”是指最初包含至少一个能够与物质例如纳米粒子结合的官能团/反应性基团的聚合物组成部分。在某些实施方式中，聚合连接物是双功能聚合物，其具有能够与至少两种物质结合的至少两个官能团/反应性基团，从而在所述至少两种物质之间进行连接。在某些实施方式中，聚合连接物是具有能够与一种物质例如纳米粒子结合的一个官能团/反应性基团的单功能聚合物。应该理解，当在本文中使用时，术语“单功能”、“双功能”、“官能团”等涉及在附连到所述核心纳米粒子和/或脑内化转运蛋白组成部分或活性药剂之前根据其原始形式的聚合连接物。
93.在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物中的至少一者是线性聚合连接物。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物是线性聚合连接物。在某些实施方式中，所述第二聚合连接物是线性聚合连接物。在某些实施方式中，所述线性聚合连接物是双功能线性聚合物，在所述线性聚合物的两个末端上具有两个官能团/反应性基团。在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物均为线性聚合连接物。在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物均为线性双功能聚合连接物，在所述线性聚合物的两个末端上具有两个官能团/反应性基团。
94.当在本文中使用时，术语“线性”聚合物/聚合连接物在某些实施方式中是指其中至少80％的单体单元以线性方式、即以单链聚合物链的形式连接的聚合物/聚合连接物。在其他实施方式中，术语“线性”聚合物/聚合连接物是指其中至少90％的单体单元以线性方式连接的聚合物/聚合连接物。在其他实施方式中，术语“线性”聚合物/聚合连接物是指其中约100％的单体单元以线性方式连接的聚合物/聚合连接物。当在本文中使用时，术语“单链聚合物链”是指包含相连的单体的聚合物链，所述单体的连接方式使得单体单元通过两个原子(每个单体单元上各一个原子)彼此联结。
95.在某些实施方式中，所述核心纳米粒子与第一聚合物结合。在某些实施方式中，所述核心纳米粒子与第二聚合物结合。在某些实施方式中，所述核心纳米粒子与第一和第二聚合物结合。在某些实施方式中，所述核心纳米粒子与第一、第二和第三聚合物结合。在某些实施方式中，所述核心纳米粒子与第一聚合连接物结合。在某些实施方式中，所述核心纳米粒子与第二聚合连接物结合。在某些实施方式中，所述核心纳米粒子与第一和第二聚合连接物结合。在某些实施方式中，所述核心纳米粒子与第一线性聚合连接物结合。在某些实施方式中，所述核心纳米粒子与第二线性聚合连接物结合。在某些实施方式中，所述核心纳米粒子与第一和第二线性聚合连接物结合。在某些实施方式中，所述核心纳米粒子与第一和第二聚合连接物以及额外的聚合物组成部分结合，其中所述额外的聚合物组成部分是单功能的，即最初具有被配置用于将所述聚合物偶联到核心纳米粒子的单一末端官能团。在
某些实施方式中，所述额外的聚合物是单功能连接物。
96.术语“结合”可以与术语“偶联”互换使用。在某些实施方式中，结合是共价偶联。术语“共价附着”、“共价附连”、“共价连接”和“共价键合”在本文中可互换使用，并且是指形成以在原子间共享电子对为特征的化学键合。例如，共价附连的药剂包被是指与基底的官能化表面形成化学键的药剂包被，不同于通过其他手段例如粘附或静电相互作用附着到表面。应该认识到，共价附连到表面的药剂(例如聚合物)也可以通过共价附连之外的手段键合。
97.在某些实施方式中，所述聚合物组成部分和/或连接物通过选自共价附连、半共价附连或非共价附连的化学附连，附连到所述核心纳米粒子的外表面。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述聚合物组成部分和/或连接物通过半共价附连附连到所述核心纳米粒子的外表面。当在本文中使用时，术语“半共价附连”是指配位键，其中形成所述键的共享电子对来自于同一原子。在本公开中，半共价附连可以发生在金属纳米粒子例如金纳米粒子与硫醇基团之间。
98.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物包含选自下述的聚合物：聚醚，聚丙烯酸酯，聚酐，聚乙烯醇，多糖，聚(n-乙烯基吡咯烷酮)，聚甘油(pg)，聚(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)，聚噁唑啉，基于聚(氨基酸)的混杂物，重组多肽，其衍生物及其组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
99.当在本文中使用时，术语“衍生物”是指一种化合物，它的核心结构与母体化合物相同或非常相似，但具有化学或物理修饰，例如不同或额外的基团例如但不限于烷氧基、羧基、胺基、甲氧基和硫醇基团。
100.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物包含聚醚。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物是聚醚。在某些实施方式中，所述聚醚是聚乙二醇(peg)或其衍生物。
101.在适合情况下，将缩略语(peg)与指示所述peg的平均分子量的数字后缀组合使用。peg或peg类物质的一种形式是具有指定平均分子量的peg或peg衍生物。
102.当在本文中使用时，“peg或其衍生物”是指包括至少一个聚乙二醇组成部分的任何化合物。peg以线性形式和包含多臂和/或接枝聚乙二醇的分支形式存在。在本文中使用时，术语“peg衍生物”是指通过末端羟基的烷基化而被修饰的peg。在某些实施方式中，所述末端羟基被直链或支链c1-c6烷基烷基化。peg还可以包含官能团。peg可以是单功能、双功能或多功能聚乙二醇。
103.示例性的官能团包括但不限于羟基、羧基、硫醇、胺、磷酸酯、膦酸酯、硫酸酯、亚硫酸酯、磺酸酯、亚砜、砜、酰胺、酯、酮、醛、氰基、炔烃、叠氮化物和烯烃或其组合。
104.在某些实施方式中，所述脑内化转运蛋白组成部分通过所述第一聚合连接物的第一末端官能团共价偶联到所述连接物，并且所述活性药剂通过所述第二聚合连接物的第二末端官能团共价偶联到所述连接物。在某些实施方式中，所述第一末端官能团和第二末端官能团相同。在其他实施方式中，所述第一末端官能团和第二末端官能团不同。
105.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物包含硫醇(-sh)末端基团。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物通过所述硫醇(-sh)末端基团化学附连到所述纳米粒子。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物通过酰胺键偶联到所述脑内化组成部分。在某些实施方式中，所述纳米粒子通过硫键与所述第一聚合连接物结合，并且所述脑内化转运蛋白组成
部分通过酰胺键偶联到所述第一聚合连接物。在某些实施方式中，所述纳米递送系统中的第一聚合连接物具有结构-s-r-conh-，其中r是由重复单体单元组成的聚合物链。在其他实施方式中，所述纳米递送系统中的第一聚合连接物具有结构-s-r-nhco-，其中r是重复单体单元由组成的聚合物链。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物选自硫醇化peg酸(hs-peg-cooh)和硫醇化peg胺(hs-peg-nh2)。应该理解，所述hs和cooh/nh2末端基团是指在与所述纳米粒子和脑内化转运蛋白组成部分偶联之前的聚合连接物。在某些实施方式中，所述硫醇基团被化学附连到所述核心纳米粒子，并且所述酸或胺基团被共价偶联到所述脑内化转运蛋白组成部分。在某些实施方式中，所述纳米递送系统中的第一聚合连接物具有选自-s-peg-c(o)-和-s-peg-nh-的结构。
106.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物是不可切割的连接物。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物在生理条件下不可切割。
107.当在本文中使用时，术语“不可切割的”是指对酸或碱不敏感、对还原剂或氧化剂不敏感并且对可以在细胞或循环系统中发现的酶不敏感的稳定的键。在某些实施方式中，所述第一和/或第二聚合连接物不含ph敏感的腙。在某些实施方式中，所述第一和/或第二聚合连接物不含二硫键。在某些实施方式中，所述第一和/或第二聚合连接物不含酯键。应该理解，术语“聚合连接物是不可切割的”意在涵盖所述纳米粒子与聚合连接物之间的键，相应的聚合连接物与活性药剂之间的键和相应的聚合连接物与脑内化转运蛋白组成部分之间的键，以及所述聚合连接物自身内部的任何键。
108.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物具有选自500-10,000da、600-9,500da、700-9,000da、800-8,500da、800-6,000da、800-5,000da、800-4,000da、800-3,000da、800-2,000da、900-8,000da、1,000-7,000da、1,500-6,500da、2,000-6,000da、3,000-6,000da、4,000-6,000da、3,400-7,000da、2,000-3,000da、2,000-5,000da、2,000-7,000da、2,000-10,000da、3,000-3,400da、3,000-5,000da、3,000-7,000da、3,000-10,000da、5,000-7,000da、5,000-10,000da、7,000-10,000da的范围内的分子量(mw)。每种可能性代表独立的实施方式。根据某些实施方式，所述第一聚合连接物具有至少1,000da、至少1,500da、至少2,000da、至少2,500da、至少3,000da、至少3,400da、至少4,000da、至少5,000da、至少6,000da、至少7,000da或至少8,000da的mw。每种可能性代表独立的实施方式。根据某些实施方式，所述第一聚合连接物具有至多3,000da、至多4,000da、至多5,000da、至多6,000da、至多7,000da或至多10,000da的mw。每种可能性代表独立的实施方式。
109.在某些实施方式中，所述第二聚合连接物包含选自下述的聚合物：聚醚，聚丙烯酸酯，聚酐，聚乙烯醇，多糖，聚(n-乙烯基吡咯烷酮)，聚甘油(pg)，聚(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)，聚噁唑啉，基于(聚氨基酸)的混杂物，重组多肽，其衍生物及其组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
110.在某些实施方式中，所述第二聚合连接物包含聚醚。在某些实施方式中，所述第二聚合连接物是聚醚。在某些实施方式中，所述聚醚是聚乙二醇(peg)或其衍生物。
111.在某些实施方式中，所述第二聚合连接物包含硫醇(-sh)末端基团。在某些实施方式中，所述第二聚合连接物通过所述硫醇(-sh)末端基团化学附连到所述纳米粒子。在某些实施方式中，所述第二聚合连接物通过酰胺键偶联到所述活性药剂。在某些实施方式中，所述纳米粒子通过硫键与所述第二聚合连接物结合，并且所述活性药剂通过酰胺键偶联到所
述第二聚合连接物。在某些实施方式中，所述纳米递送系统中的第二聚合连接物具有结构-s-r-conh-，其中r是由重复单体单元组成的聚合物链。在其他实施方式中，所述纳米递送系统中的第二聚合连接物具有结构-s-r-nhco-，其中r是由重复单体单元组成的聚合物链。在某些实施方式中，所述第二聚合连接物选自硫醇化peg酸(hs-peg-cooh)和硫醇化peg胺(hs-peg-nh2)。应该理解，所述hs和cooh/nh2末端基团是指在与所述纳米粒子和活性药剂偶联之前的聚合连接物。在某些实施方式中，所述硫醇基团被化学附连到所述核心纳米粒子，并且所述酸或胺基团被共价偶联到所述活性药剂。在某些实施方式中，所述纳米递送系统中的第二聚合连接物具有选自-s-peg-c(o)-和-s-peg-nh-的结构。
112.在某些实施方式中，所述第二聚合连接物是不可切割的连接物。在某些实施方式中，所述第二聚合连接物在生理条件下不可切割。
113.在某些实施方式中，所述第二聚合连接物具有2,000至7,000da之间的分子量(mw)。在某些实施方式中，所述第二聚合连接物具有在选自500-10,000da、600-9,500da、700-9,000da、800-8,500da、800-6,000da、800-5,000da、800-4,000da、800-3,000da、800-2,000da、900-8,000da、1,000-7,000da、1,500-6,500da、2,000-6,000da、3,000-6,000da、4,000-6,000da、1,000-2,000da、1,000-3,000da、1,000-5,000da、1,000-7,000da、1,000-10,000da、2,000-3,000da、2,000-5,000da、2,000-7,000da、2,000-10,000da、3,000-5,000da、3,000-7,000da、3,000-10,000da、5,000-7,000da、5,000-10,000da和7,000-10,000da的范围内的mw。每种可能性代表独立的实施方式。根据某些实施方式，所述第二聚合连接物具有至少1,000da、至少2,000da、至少3,000da、至少4,000da、至少5,000da、至少6,000da或至少7,000da的mw。每种可能性代表独立的实施方式。根据某些实施方式，所述第二聚合连接物具有至多2,000da、至多3,000da、至多4,000da、至多5,000da、至多6,000、至多7,000da或至多10,000da的mw。每种可能性代表独立的实施方式。
114.在某些实施方式中，所述纳米递送系统包含聚合物结合的生物活性分子，其中所述聚合物包含可切割连接物。根据某些实施方式，所述可切割连接物包含对位于脑中或在脑中表达的内源分子的切割敏感的键。在某些实施方式中，所述可切割连接物是peg琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(pegss)。根据某些实施方式，所述内源分子是谷胱甘肽。根据某些实施方式，所述内源分子选自蛋白酶、核酸酶、水合氢离子和还原剂。每种可能性代表独立的实施方式。
115.根据某些实施方式，所述纳米递送系统还包含切割分子诱导物。根据某些实施方式，所述切割分子诱导物选自n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)、谷胱甘肽单酯、γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶。每种可能性代表独立的实施方式。
116.在某些实施方式中，所述内源分子是谷胱甘肽，并且所述切割分子诱导物选自n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)、谷胱甘肽单酯、γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶。
117.根据某些实施方式，所述第一聚合物和第二聚合物是不同的聚合物。在某些实施方式中，所述第一聚合物和第二聚合物包含相同的聚合物。在其他实施方式中，所述第一聚合连接物由重复单体单元组成，并且所述第二聚合连接物由与所述第一线性聚合连接物相同的重复单体单元组成。在某些相关实施方式中，所述第一线性聚合连接物具有与所述第二线性聚合连接物不同数目的重复单体单元。
118.在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物包含相同的聚合物，其选自：聚醚，聚丙烯酸酯，聚酐，聚乙烯醇，多糖，聚(n-乙烯基吡咯烷酮)，聚甘油(pg)，聚(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)，聚噁唑啉，基于聚(氨基酸)的混杂物，重组多肽，其衍生物及其组合。在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物均包含peg。在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物均为peg。在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物均包含硫醇化peg。在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物包含硫醇化peg酸(hs-peg-cooh)或硫醇化peg胺(hs-peg-nh2)。在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物是硫醇化peg酸(hs-peg-cooh)或硫醇化peg胺(hs-peg-nh2)。在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物均为硫醇化peg酸(hs-peg-cooh)。在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物均为硫醇化peg胺(hs-peg-nh2)。
119.在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物是线性的。根据本发明的原理，所述第一和第二线性聚合连接物具有显著不同的长度。
120.在某些实施方式中，术语聚合物组成部分或连接物的“长度”是指所述聚合物的的长度，其取决于其中并入的单体的数量、每个单体单元的长度、聚合物链的结构(例如所述聚合物是线性还是分支的)、空间构象、价角(或结合角)的变形以及拉伸或卷曲程度。
121.聚合物的长度可以如本领域中已知的来计算，例如在《物理聚合物科学简介》(introduction to physical polymer science)第四版，l.h.sperling，第一次出版：2005年11月4日，第3章中所描述的。此外，正如本领域中已知的，可以使用尤其是hyperchem、acd/3d、moe 2010.10或chem3d软件进行的各种不同的计算建模方法，可用于评估聚合物的长度。物理表征方法例如静态光散射，也可用于评估卷曲聚合物的长度。应该理解，在评估第一聚合连接物和第二聚合连接物的长度之差时，必须对两种聚合连接物使用相同的长度定义(或长度测量方法)。
122.术语“长度”在指称线性聚合物时，可以是指不同的长度定义。根据某些实施方式，术语“长度”是指位移长度，在本文中也被称为“端到端”长度，其对于卷曲聚合物来说是聚合物链的两个末端之间的距离。例如，端到端长度可以被表示为flory半径：
123.f＝αn3/5
ꢀꢀ
方程i
124.其中f＝flory半径，a＝单体尺寸，n＝聚合度
125.根据某些实施方式，术语“长度”是指轮廓长度，其是当聚合物被拉伸时所述聚合物链的两个末端之间的距离。轮廓长度可以认为是最大的可能位移长度。轮廓长度(在本文中也被称为“旧轮廓长度”)可以通过用聚合物的mw除以单体单元的mw并乘以单体单元的长度来计算。为了将结合角考虑在内，轮廓长度(在本文中也被称为“新轮廓长度”)可以通过用聚合物的mw除以的单体单元的mw乘以单体单元的长度并且再乘以((结合角θ-180)/2)的余弦来计算。
126.正如上文中解释的，线性聚合物的长度可以在其分子量和单体单元的化学结构的基础上估算。为了评估包含相同聚合物(即由相同类型但不同数量的单体单元组成)的第一线性聚合连接物和第二聚合连接物的长度之差，可以方便地使用所述两种聚合连接物的分子量。因此，在某些实施方式中，所述第一和第二线性聚合连接物具有显著不同的分子量。当在本文中使用时，术语“显著不同”是指至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少12％、至少15％、至少18％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少
40％、至少45％或至少50％的差异。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
127.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物的单体单元和第二聚合连接物的单体单元具有基本上相似的分子量。当在本文中使用时，术语“基本上相似的”是指至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％的相似度。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
128.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物和第二聚合连接物包含相似的聚合物。在某些实施方式中，所述第一线性聚合连接物由重复单体单元组成，并且所述第二线性聚合连接物由与所述第一线性聚合连接物相同的重复单体单元组成，其中所述第一线性聚合连接物具有与所述第二线性聚合连接物不同数量的重复单体单元。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物和第二聚合连接物除了所述第一和所述第二聚合连接物的长度之外是相似的。
129.在某些实施方式中，所述第一和第二线性聚合连接物的相应分子量之差为至少约100da、至少约150da、至少约200da、至少约250da、至少约300da、至少约350da、至少约400da、至少约450da、至少约500da、至少约550da、至少约600da、至少约650da、至少约700da、至少约750da、至少约800da、至少约850da、至少约900da、至少约950da、至少约1000da、至少约1100da、至少约1200da、至少约1300da、至少约1400da或至少约1500da。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
130.在某些实施方式中，所述第一与第二线性聚合连接物的长度之差被配置成能够使所述脑内化转运蛋白组成部分在所述纳米递送系统面朝bbb的外表面上暴露。应该理解，所述活性药剂不是封闭在所述纳米粒子核心内，而是与脑内化组成部分相似通过聚合连接物附连到其外表面，所述脑内化组成部分也通过聚合连接物附连到同一纳米粒子核心的表面。然而，这种可以通过相对简单的制备方法形成的核壳结构遇到出人意料的障碍——当使用相同类型和相同分子量的聚合连接物来偶联所述脑内化组成部分和活性药剂时，此类递送系统的bbb穿透效率非常低。不希望受到理论或作用机制限制，设想了具有相似长度的聚合物链不提供所述脑内化组成部分在递送系统的外表面上的充分暴露。为了克服这一障碍，使用具有不同长度的聚合连接物来偶联所述脑内化组成部分和活性药剂。本发明的发明人已令人吃惊地发现，分子量比第二聚合连接物更高的第一聚合连接物(其中两种聚合连接物均由相同的单体单元组成)允许将包括抗体、肽和小分子在内的结构和尺寸不同的活性药剂递送到脑中。不希望受到理论或作用机制限制，设想了作为第一聚合连接物的更高mw的连接物具有比第二聚合连接物更大的轮廓距离和端到端距离，因此能够暴露所述脑内化转运蛋白组成部分和/或屏蔽所述活性药剂，这提供了对bbb的穿透。因此，包含长度和/或mw比第二聚合连接物更大的第一聚合连接物的纳米递送系统提供了一种用于递送各种不同生物活性分子或标记组成部分的通用的bbb穿透性平台。
131.也不希望受到理论或作用机制限制，设想了不是封闭或包封在纳米粒子核心内的所述活性药剂，尽管与所述递送系统结合，但仍可得并具有活性。已出人意料地发现，通过稳定的不可切割的共价键与所述纳米粒子结合的聚合连接物偶联的抗体保留其活性和功能。甚至更令人吃惊的是，与所述纳米粒子结合的聚合连接物偶联的靶向淀粉样肽-β斑块的肽，尽管至少部分被与比所述肽更长的聚合连接物偶联的胰岛素屏蔽，但仍保留其在脑中的靶向能力。因此，本发明的纳米递送系统的确保形成具有特定层次结构的偶联粒子的
特定组成，不仅允许递送各种不同类型的活性药剂，而且不干扰所述活性药剂的功能，使得在穿过bbb后切割所述活性药剂与纳米粒子之间的连接不是必需的。
132.因此，在某些实施方式中，所述第一聚合连接物的分子量高于所述第二聚合连接物的分子量。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物的分子量高于所述第二聚合连接物的分子量，前提是所述第二聚合连接物的分子量低于4950da。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物的分子量高于所述第二聚合连接物的分子量，前提是所述第二聚合连接物的分子量低于4900da。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物的分子量高于所述第二聚合连接物的分子量，前提是所述第二聚合连接物的分子量低于4800da。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物的分子量高于所述第二聚合连接物的分子量，前提是所述第二聚合连接物的分子量低于4780da。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物是分子量约为5kda的peg衍生物，并且所述第二聚合连接物是分子量约为3500kda的peg衍生物。
133.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物具有比所述第二聚合连接物的分子量更高的分子量。在某些实施方式中，所述第一和第二聚合连接物的mw直接取决于所述生物活性分子和脑内化组成部分的相对分子量。在某些实施方式中，所述生物活性分子具有比所述脑内化组成部分更高的mw，并且所述第一聚合连接物具有比所述第二聚合连接物更高的mw。
134.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物长于所述第二聚合连接物。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物具有比所述第二聚合连接物更长的端到端距离。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物具有比所述第二聚合连接物更长的轮廓距离。
135.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物具有比所述第二聚合连接物更小的mw。在某些相关实施方式中，所述第二聚合连接物具有至少约4000da的mw，并且所述第一聚合连接物与第二聚合连接物的mw之差为至少约2000da。在其他实施方式中，所述第二聚合连接物具有至少约4500da的mw，并且所述第一聚合连接物与第二聚合连接物的mw之差为至少约2500da。在其他实施方式中，所述第二聚合连接物具有至少约4700da的mw，并且所述第一聚合连接物与第二聚合连接物的mw之差为至少约3000da。不希望受到理论或作用机制限制，设想了明显更长的第二连接物允许所述聚合物链的折叠(或更高的卷曲程度)，使得所述生物活性分子与纳米粒子核心之间的实际距离小于所述脑内化组成部分与纳米粒子核心之间的实际距离，使得所述生物活性分子至少部分被在bbb穿透期间暴露在递送系统表面上的脑内化组成部分屏蔽。在某些相关实施方式中，所述第一聚合连接物的端到端距离大于所述第二聚合连接物的端到端距离，尽管所述第二聚合连接物的mw更高。
136.在某些实施方式中，所述生物活性分子与纳米粒子核心之间的距离小于所述脑内化组成部分与纳米粒子核心之间的距离。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物至少一个末端基团与所述第二聚合连接物的至少一个末端基团相似。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物的至少一个末端官能团与所述第二聚合连接物的至少一个末端官能团相似。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物的两个末端基团与所述第二聚合连接物的两个末端基团相似。在某些实施方式中，所述第一聚合连接物的两个末端官能团与所述第二聚合连接物的两个末端官能团相似。
137.在某些实施方式中，所述纳米粒子与额外的第三聚合物结合。在某些实施方式中，所述聚合物是单功能聚合连接物。在某些实施方式中，所述纳米粒子被包含所述第一聚合
连接物、第二聚合连接物和额外的第三聚合连接物的聚合物层包被，其中所述额外的聚合连接物是单功能的。术语“第三聚合物”和“第三聚合连接物”可互换使用。在某些实施方式中，所述第三聚合物起到间隔物组成部分的作用。在某些实施方式中，所述第三聚合连接物是线性聚合连接物。在某些实施方式中，所述第三聚合物选自聚醚、聚丙烯酸酯、聚酐、聚乙烯醇、多糖、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚甘油(pg)、聚(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚噁唑啉、基于聚(氨基酸)的混杂物、重组多肽、其衍生物及其组合。
138.当在本文中使用时，术语“单功能”意味着所述聚合物在被偶联到所述纳米粒子之前仅具有一个被配置以使所述聚合物与纳米粒子结合的官能团。因此，所述单功能聚合连接物既未偶联也不能偶联除了纳米粒子之外的任何组成部分。
139.在某些实施方式中，所述第三聚合物包含与所述第一和/或第二聚合物相同的单体单元。在某些实施方式中，所述第三聚合物通过所述聚合物的硫醇末端基团与所述纳米粒子结合。在某些实施方式中，所述第三聚合物是聚醚。在某些实施方式中，所述聚醚是甲氧基聚乙二醇(mpeg)或其衍生物。在某些实施方式中，所述mpeg被硫醇化(mpeg-sh)，其中所述硫醇化mpeg通过硫醇末端基团与所述核心纳米粒子结合。
140.在某些实施方式中，所述第三聚合物具有1,000至7,000da之间的mw。在某些实施方式中，所述第三聚合物具有500-1,000da、500-3,000da、500-7,000da、500-10,000da、1,000-3,000da、1,000-5,000da、1,000-7,000da、1,000-10,000da、3,000-5,000da、3,000-7,000da、3,000-10,000da、7,000-10,000da的mw。每种可能性代表独立的实施方式。根据某些实施方式，所述第三聚合物具有至少1,000da、至少2,000da、至少3,000da、至少4,000da、至少5,000da、至少6,000da、至少7,000da或至少8,000da的mw。每种可能性代表独立的实施方式。根据某些实施方式，所述第三聚合物具有至多1,000da、至多2,000da、至多3,000da、至多4,000da、至多5,000da、至多6,000da、至多7,000da或至多10,000da的mw。每种可能性代表独立的实施方式。
141.在某些实施方式中，所述第三聚合物在外壳中的v/v比率为10-90％。在某些实施方式中，所述第三聚合物在外壳中的v/v比率为10-20％、10-50％、10-70％、10-90％、20-50％、20-70％、20-90％、50-70％、50-90％、70-90％。每种可能性代表独立的实施方式。在某些实施方式中，所述第三聚合物在外壳中的v/v比率小于20％、小于40％、小于50％、小于70％、小于90％。每种可能性代表独立的实施方式。
142.在某些实施方式中，所述第三聚合物的长度与所述第一聚合连接物或第二聚合连接物的长度基本上相近。在某些实施方式中，所述第三聚合物的长度与所述第一聚合连接物的长度基本上相近。在某些实施方式中，所述第三聚合物的长度与所述第二聚合连接物的长度基本上相近。在某些实施方式中，所述第三聚合物的长度与所述聚合连接物(第一和第二)中长度长于另一聚合连接物的长度基本上相近。在某些实施方式中，所述第三聚合物的分子量与所述第一聚合连接物或第二聚合连接物的分子量基本上相近。在某些实施方式中，所述第三聚合物的分子量与所述第一聚合连接物的分子量基本上相近。在某些实施方式中，所述第三聚合物的分子量与所述第二聚合连接物的分子量基本上相近。在某些实施方式中，所述第三聚合物的分子量与所述聚合连接物(第一和第二)中分子量高于另一聚合连接物的分子量基本上相近。
143.不希望受到理论或作用机制限制，本发明的纳米递送系统的效能也取决于不同聚
合连接物的摩尔比，其中所述比例定义了所述递送系统中脑内化转运蛋白组成部分和活性药剂的密度。
144.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物占与所述纳米粒子结合的总聚合物的约5-70％mol、5-60％mol、8-60％mol、10-60％mol、10-50％mol、10-40％mol、10-30％mol、10-25％mol、10-20％mol、15-50％mol、15-40％mol、15-30％mol、15-25％mol、15-20％mol、2-10％mol、2-20％mol、2-50％mol、2-60％mol、2-70％mol、5-10％mol、5-20％mol、5-70％mol、10-20％mol、10-50％mol、10-70％mol、30-50％mol、30-60％mol、30-70％mol、50-60％mol或50-70％mol。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，第一聚合连接物占与所述纳米粒子结合的总聚合物的至少2％mol、至少4％mol、至少5％mol、至少6％mol、至少8％mol、至少10％mol、至少12％mol、至少15％mol、至少18％mol、至少20％mol、至少25％mol、至少30％mol、至少35％mol、至少40％mol、至少50％mol或至少60％mol。每种可能性代表独立的实施方式。
145.在某些实施方式中，所述第二聚合连接物占与所述纳米粒子结合的总聚合物的约5-70％mol、5-60％mol、10-60％mol、10-55％mol、10-50％mol、10-40％mol、10-30％mol、10-25％mol、10-20％mol、15-60％mol、15-55％mol、15-50％mol、15-45％mol、15-40％mol、15-30％mol、15-25％mol、15-20％mol、2-10％mol、2-20％mol、2-50％mol、2-60％mol、2-70％mol、5-10％mol、5-20％mol、10-20％mol、10-50％mol、10-70％mol、20-50％mol、20-40％mol、30-50％mol、30-60％mol、30-70％mol、50-60％mol或50-70％mol。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述第二聚合连接物占与所述纳米粒子结合的总聚合物的至少2％mol、至少4％mol、至少5％mol、至少6％mol、至少8％mol、至少10％mol、至少12％mol、至少15％mol、至少18％mol、至少20％mol、至少25％mol、至少30％mol、至少35％mol、至少40％mol、至少50％mol或至少60％mol。每种可能性代表独立的实施方式。
146.在某些实施方式中，所述第三聚合物占与所述纳米粒子结合的总聚合物的约5-90％mol、5-85％mol、5-80％mol、10-80％mol、20-78％mol、25-75％mol、30-75％mol、40-75％mol、50-75％mol、60-75％mol、60-70％mol、60-80％mol、5-60％mol、10-60％mol、10-55％mol、10-50％mol、10-40％mol、15-60％mol、15-55％mol、15-50％mol、15-45％mol或15-40％mol。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述第三聚合物占与所述纳米粒子结合的总聚合物的60-80％mol之间。在某些实施方式中，所述第三聚合物占与所述纳米粒子结合的总聚合物的50-80％mol之间。在某些实施方式中，所述第三聚合物占与所述纳米粒子结合的总聚合物的至少2％mol、至少4％mol、至少5％mol、至少6％mol、至少8％mol、至少10％mol、至少12％mol、至少15％mol、至少18％mol、至少20％mol、至少25％mol、至少30％mol、至少35％mol、至少40％mol、至少45％mol、至少50％mol、至少55％mol、至少60％mol、至少65％mol或至少70％mol。每种可能性代表独立的实施方式。
147.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物占与所述纳米粒子结合的总聚合物的约15至45％mol，所述第二聚合连接物占约10至45％mol，并且所述第三聚合物占约40至75％mol。
148.应该理解，每种聚合物组成部分的％mol依赖于与所述纳米粒子结合的其他聚合物组成部分，使得所述聚合物的总％mol不超过100％。
149.在某些实施方式中，所述第一聚合连接物、第二聚合连接物和第三聚合物的(w/w/w)比例为至少5:5:90至60:30:30。
150.在某些实施方式中，所述第一聚合物和第二聚合物的(w/w)比例为至少40:60至95:5。
151.根据本发明的原理，所述纳米递送系统包含偶联到所述第一聚合连接物的脑内化转运蛋白组成部分。在本文中可以与术语“脑内化组成部分”互换使用的术语“脑内化转运蛋白组成部分”是指能够与bbb的细胞组分表达的受体或表面蛋白特异性结合的分子。合在一起形成bbb的脑微血管的三种主要细胞元件是脑内皮细胞、星形胶质细胞终足和周细胞(pcs)。在某些实施方式中，所述脑内化转运蛋白组成部分可以与脑内皮细胞表达的受体或表面蛋白结合。在某些实施方式中，所述脑内化转运蛋白组成部分可以与星形胶质细胞终足表达的受体或表面蛋白结合。在某些实施方式中，所述脑内化转运蛋白组成部分可以与周细胞(pcs)表达的受体或表面蛋白结合。不希望受到任何理论或机制限制，假定所述脑内化组成部分促进整个纳米递送系统通过bbb的运输，这可能是通过受体介导的转胞吞作用(rmt)或受体介导的胞吞作用(rme)机制。
152.在某些实施方式中，所述脑内化组成部分选自但不限于胰岛素、特异性针对胰岛素受体的抗体、转铁蛋白、特异性针对转铁蛋白受体的抗体、与转铁蛋白受体特异性结合的多肽、与胰岛素受体特异性结合的多肽、胰岛素样生长因子1、特异性针对胰岛素样生长因子受体1的抗体、与胰岛素样生长因子受体1特异性结合的多肽、载脂蛋白a1、b或e、乳铁蛋白、angiopep-2、特异性针对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的抗体、与低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性结合的多肽、特异性针对白喉毒素受体的抗体、与白喉毒素受体特异性结合的多肽和bbb穿透性细胞穿透肽(cpp)。每种可能性代表本发明的独立实施方式。当在本文中使用时，术语“细胞穿透肽(cpp)”是指具有增强的跨过细胞膜双层的能力而不引起显著致死性膜损伤的肽。术语“bbb穿透性cpp”是指能够跨过bbb细胞的膜并因此能够穿透到脑中的细胞穿透肽(zou,li-li等，current neuropharmacology 11.2(2013):197-208，和stalmans,sofie等，plos one 10.10(2015):e0139652.)。
153.本领域中已知的能够促进转胞吞作用的其他细胞蛋白质也可以用作脑内化组成部分。在某些实施方式中，所述脑内化组成部分选自胰岛素、转铁蛋白、低密度脂蛋白、载脂蛋白a1、b或e和乳铁蛋白。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述脑内化组成部分选自胰岛素和转铁蛋白。在某些实施方式中，所述脑内化组成部分是胰岛素。在某些实施方式中，所述胰岛素的分子量(mw)为约5千道尔顿(kd)。
154.在某些实施方式中，所述外壳中脑内化组成部分(例如胰岛素)的v/v比率在2-10％、2-20％、2-50％、2-60％、2-70％、5-10％、5-20％、5-50％、5-60％、5-70％、10-20％、10-50％、10-60％、10-70％、30-50％、30-60％、30-70％、50-60％、50-70％之间。在某些实施方式中，所述外壳中胰岛素的v/v比率在5-60％之间。在某些实施方式中，所述外壳中胰岛素的v/v比率为至少2％、至少5％、至少10％、至少30％、至少50％、至少60％、至少70％。每种可能性代表独立的实施方式。
155.根据本发明的原理，所述第二聚合连接物被偶联到选自生物活性分子和标记分子的活性药剂。当在本文中使用时，术语“活性药剂”是指旨在递送到受试者的脑中并且能够用作治疗或诊断药剂的药剂。根据某些实施方式，所述活性药剂的特征在于不良的bbb穿透
性。根据某些实施方式，在穿过bbb后，所述活性药剂可以将所述纳米递送系统进一步靶向脑中的特定区域，例如海马、纹状体、小脑和皮质。根据某些实施方式，在穿过bbb后，所述活性药剂可以将所述纳米递送系统靶向脑内的特定细胞群体，例如胶质瘤细胞、小胶质细胞和神经元细胞。
156.在某些实施方式中，所述活性药剂是大分子。正如本文中所定义的，术语“大分子”是指通常通过单体的聚合形成的非常大的分子。在某些实施方式中，所述大分子是蛋白质。在某些实施方式中，所述大分子是酶。
157.在某些实施方式中，所述大分子是抗体。当在本文中使用时，术语“抗体”是指包括至少一个结合结构域的多肽或一组多肽，所述结合结构域由多肽链折叠形成，具有内表面形状和电荷分布与抗原的抗原决定簇的特性互补的三维结合空间。抗体通常具有四聚体形式，包括相同的两对多肽链，每一对具有一条“轻”链和一条“重”链。每个轻链/重链对的可变区形成抗体的结合部位。抗体可以是寡克隆、多克隆、单克隆、嵌合、骆驼化、cdr移植、多特异性、双特异性、催化、人源化、全人类、抗独特型抗体，和可以标记为可溶或结合形式的抗体，以及片段包括表位结合片段、其变体或衍生物，其是单独的或与其他氨基酸序列组合。抗体可以来自于任何物种。术语抗体也包括结合片段，包括但不限于fv、fab、fab'、f(ab')2、单链抗体(svfc)、二聚化可变区(双链抗体(diabody))和二硫键连接的可变区(dsfv)。具体来说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合部位的分子。抗体片段可以融合也可以不融合到另一个免疫球蛋白结构域，包括但不限于fc区或其片段。专业技术人员将会进一步认识到，可以产生其他融合产物，包括但不限于scfv-fc融合体、可变区(例如vl和vh)～fc融合体和scfv-scfv-fc融合体。
158.在某些实施方式中，所述偶联到第二聚合连接物的活性药剂是生物活性分子。在某些实施方式中，所述生物活性分子与所述第二聚合连接物毗邻。当在本文中使用时，术语“生物活性分子”是指能够引发或改变系统中的生物学响应的化合物或分子。在某些实施方式中，所述生物活性分子是治疗药剂。在某些实施方式中，所述生物活性分子具有治疗应用。在某些实施方式中，所述生物活性分子具有诊断应用。在某些实施方式中，所述生物活性分子同时具有治疗和诊断应用。
159.在某些实施方式中，所述生物活性分子包含小分子、大分子、寡核苷酸、反义rna肽或其任何组合。在某些实施方式中，所述生物活性分子选自大分子、肽和小分子。在某些实施方式中，所述生物活性分子选自抗体、肽和小分子。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
160.当在本文中使用时，术语“肽”是指通过一个d-或l-氨基酸的α-羧基与另一个d-或l-氨基酸的α-氨基之间形成酰胺键而产生的任何聚合化合物。
161.当在本文中使用时，术语“小分子”是指合成或自然界中发现的有机或无机分子，通常具有小于1000da的分子量。术语“小分子”还涵盖肽、蛋白质或抗体的任何片段，包括落入上述分子量范围内的天然序列和变体。
162.在某些实施方式中，所述生物活性分子是在治疗脑相关疾病或障碍中有效的治疗药剂。在某些实施方式中，所述生物活性分子是用于脑相关疾病的治疗或诊断的抗体。
163.当在本文中使用时，术语“脑相关疾病或障碍”是指引起脑或其任何细胞的机能障碍的任何疾病或障碍。脑相关疾病和障碍的非限制性实例是神经退行性障碍例如帕金森
病、阿尔茨海默病、亨廷顿病和痴呆；神经肌肉疾病例如肌萎缩侧索硬化症(als)和运动神经元病；神经发育疾病例如自闭症谱系障碍和注意力缺陷多动障碍(adhd)；自身免疫脑相关疾病例如多发性硬化(ms)，神经精神障碍例如精神分裂症、药物成瘾、吸烟成瘾、进食障碍、强迫症、各种形式的抑郁症、焦虑症、认知障碍和情感障碍；癫痫性障碍例如癫痫；疼痛障碍例如偏头痛；脑血管疾病包括创伤性脑损伤和中风；脑相关癌症例如脑和神经肿瘤、脑转移瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤(gbm)和胶质肉瘤(gs)，神经遗传疾病例如亨廷顿病、肯尼迪病、代谢障碍、溶酶体贮积症和杜兴氏病，以及神经传染疾病。
164.在某些实施方式中，活性药剂是标记分子。当在本文中使用时，术语“标记分子”是指能够产生适合的检测手段可检测的信号的分子，例如但不限于放射活性分子和荧光分子。在某些实施方式中，所述标记分子具有诊断应用。在某些实施方式中，所述标记分子是诊断药剂。在某些实施方式中，所述标记分子包含小分子、大分子、寡核苷酸、反义rna、肽或其任何组合。在某些实施方式中，所述标记分子是小分子。在某些实施方式中，所述标记分子是抗体。
165.在某些实施方式中，所述活性药剂是具有100-120kd、100-150kd、100-200kd、100-250kd、150-200kd、150-250kd、200-250kd的分子量(mw)的抗体。每种可能性代表独立的实施方式。在某些实施方式中，所述抗体具有至少100kd、至少110kd、至少120kd、至少130kd、至少140kd、至少150kd、至少160kd、至少180kd、至少200kd、至少250kd的mw。每种可能性代表独立的实施方式。在某些实施方式中，所述抗体具有150-200kd的mw。在某些实施方式中，所述抗体具有130-180kd的mw。在某些实施方式中，所述抗体具有140-160kd的mw。
166.在某些实施方式中，所述抗体具有150-200kd的mw，并且所述第二聚合连接物(peg)具有至少2,000da、至少2,500da或至少3,000da的mw。在某些实施方式中，所述抗体具有150-200kd的mw，并且所述第二聚合连接物(peg)具有至多2,000da、至多2,500da、至多3,000da、至多3,500da、至多4,000da、至多5,000da或至多6,000da的mw。在某些此类实施方式中，所述脑内化组成部分是具有5-6kd的mw的胰岛素，并且所述第一聚合连接物具有至少2,000da、至少2,500da、至少3,000da、至少3,400da、至少4,000da或至少4,500da的mw。
167.在某些实施方式中，所述抗体在外壳中的v/v比率在2-10％、2-20％、2-30％、2-40％、5-10％、5-20％、5-30％、5-40％、10-20％、10-30％、10-40％、20-30％、20-40％、30-40％之间。在某些实施方式中，所述抗体在外壳中的v/v比率在5-30％之间。在某些实施方式中，所述抗体在外壳中的v/v比率为至少2％、至少5％、至少10％、至少30％、至少40％。每种可能性代表独立的实施方式。
168.在某些实施方式中，所述大分子在外壳中的v/v比率在2-10％、2-20％、2-30％、2-40％、5-10％、5-20％、5-30％、5-40％、10-20％、10-30％、10-40％、20-30％、20-40％、30-40％之间。在某些实施方式中，所述大分子在外壳中的v/v比率在5-30％之间。在某些实施方式中，所述大分子在外壳中的v/v比率为至少2％、至少5％、至少10％、至少30％、至少40％。每种可能性代表独立的实施方式。
169.在某些实施方式中，所述活性药剂具有小于1,000道尔顿(da)的mw。在某些实施方式中，所述活性分子具有10-50da、10-100da、10-500da、10-1,000da、50-100da、50-500da、50-1,000da、100-300da、100-500da、100-800da、100-1,000da、500-800da、500-1,000da、800-1,000da的mw。每种可能性代表独立的实施方式。
170.在某些实施方式中，所述活性药剂具有小于1,000da、小于900da、小于800da、小于700da、小于600da、小于500da、小于400da、小于300da、小于200da、小于100da的mw。每种可能性代表独立的实施方式。在某些实施方式中，所述活性药剂具有大于100da、大于200da、大于300da、大于400da、大于500da、大于600da、大于700da、大于800da、大于900da的mw。每种可能性代表独立的实施方式。
171.在某些实施方式中，所述活性药剂是小分子。在某些实施方式中，所述生物活性分子是小分子。在某些实施方式中，所述生物活性分子是寡核苷酸。在某些实施方式中，所述生物活性分子是反义rna。在某些实施方式中，所述生物活性分子是肽。在某些实施方式中，所述生物活性分子是药物。
172.在某些实施方式中，所述生物活性分子在外壳中的v/v比率为40-95％。在某些实施方式中，所述v/v比率在30-40％、30-50％、30-70％、30-90％、30-95％、30-98％、40-50％、40-70％、40-90％、40-95％、40-98％、60-70％、60-90％、60-95％、60-98％、70-90％、70-95％、70-98％、80-90％、80-95％、80-98％之间。每种可能性代表独立的实施方式。
173.根据某些实施方式，所述无机纳米粒子是金纳米粒子。根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物是硫醇化peg5000酸或硫醇化peg5000胺。根据某些实施方式，所述第二线性聚合连接物是硫醇化peg3500酸或硫醇化peg3500胺。根据某些实施方式，所述脑内化转运蛋白组成部分是胰岛素。所述纳米递送系统还可以包括选自抗体、肽和小分子的活性药剂。
174.根据某些实施方式，所述无机纳米粒子是氧化铁纳米粒子。根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物是硫醇化peg5000酸或硫醇化peg5000胺。根据某些实施方式，所述第二线性聚合连接物是硫醇化peg3500酸或硫醇化peg3500胺。根据某些实施方式，所述脑内化转运蛋白组成部分是胰岛素。所述纳米递送系统还可以包括选自抗体、肽和小分子的活性药剂。
175.根据某些实施方式，所述无机纳米粒子是金纳米粒子。根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物是硫醇化peg5000酸或硫醇化peg5000胺。根据某些实施方式，所述第二线性聚合连接物是硫醇化peg3500酸或硫醇化peg3500胺。根据某些实施方式，所述脑内化转运蛋白组成部分是转铁蛋白。所述纳米递送系统还可以包括选自抗体、肽和小分子的活性药剂。
176.根据某些实施方式，所述无机纳米粒子是金纳米粒子。根据某些实施方式，所述第一线性聚合连接物是硫醇化peg1000酸或硫醇化peg1000胺。根据某些实施方式，所述第二线性聚合连接物是硫醇化peg5000酸或硫醇化peg5000胺。根据某些实施方式，所述脑内化转运蛋白组成部分是胰岛素。所述纳米递送系统还可以包括选自抗体、肽和小分子的活性药剂。
177.制备方法
178.根据另一方面，提供了一种制备如上所述的所有实施方式中的本发明的纳米递送系统的方法，所述方法包括下述顺序步骤：
179.a)用所述第一线性聚合连接物部分包被所述无机纳米粒子的表面，然后将所述第一线性聚合连接物偶联到所述脑内化转运蛋白组成部分；和
180.b)用所述第二线性聚合连接物部分包被所述无机纳米粒子的表面，然后将所述第
二线性聚合连接物偶联到所述活性药剂，
181.其中步骤(a)和步骤(b)可以以任何顺序进行。
182.当在本文中使用时，术语“部分包被”是指将多个相应的聚合连接物偶联到纳米粒子的表面，使得所述多个连接物以低于所述裸露的纳米粒子的饱和水平的密度水平部分覆盖所述纳米粒子的表面。
183.可以使用本领域中已知的任何方法来确定实现纳米粒子的全密度(即100％)包被所需的聚合物的量，以及因此部分包被所需的量。例如，向所述纳米粒子溶液添加不同量的聚合物并在离心后测量上清液中游离聚合物的浓度，是一种广泛使用的方法。或者，可以使用对包被密度的变化敏感的任何表征方法，例如zeta电位和dls。此外，可以根据所述纳米粒子的表面积进行理论计算以确定实现完全包被所需的聚合物的量。例如，以前已显示，硫醇-peg分子在金纳米粒子表面上占据0.35nm2的足迹面积(qian,ximei等，nature biotechnology 26.1(2008):83-90)。因此，覆盖100％金纳米粒子表面所需的硫醇-peg连接物的量可以基于gnp的平均直径来计算。
184.在某些实施方式中，所述第一线性聚合连接物和第二线性聚合连接物中的每一者以适合于覆盖所述无机纳米粒子表面的5％至60％之间的量添加。
185.在某些实施方式中，步骤(a)包括包被所述无机纳米粒子表面的5％-60％、10-60％、10-50％、10-40％、10-30％、10-25％、10-20％、15-50％、15-40％、15-30％、15-25％、15-20％、2-10％、2-20％、2-50％、2-60％、2-70％、5-10％、5-20％、5-70％、10-20％、10-50％、10-70％、30-50％、30-60％、30-70％、50-60％或50-70％之间。(校者注：原文多了mol)
186.在某些实施方式中，步骤(b)包括包被所述无机纳米粒子表面的5％-60％、10-60％、10-50％、10-40％、10-30％、10-25％、10-20％、15-50％、15-40％、15-30％、15-25％、15-20％、2-10％、2-20％、2-50％、2-60％、2-70％、5-10％、5-20％、5-70％、10-20％、10-50％、10-70％、30-50％、30-60％、30-70％、50-60％或50-70％之间。(校者注：原文多了mol)
187.在某些实施方式中，所述方法还包括用第三聚合连接物部分包被所述无机纳米粒子的表面，其中所述聚合连接物是单功能连接物。
188.在某些实施方式中，步骤(a)在步骤(b)之前进行。在某些实施方式中，所述方法在步骤(a)与步骤(b)之间还包括离心。在其他实施方式中，步骤(a)在步骤(b)之后进行。在某些实施方式中，所述方法在步骤(b)与步骤(a)之间还包括离心。在某些实施方式中，所述活性药剂是抗体或肽，并且步骤(a)在步骤(b)之前进行。在某些实施方式中，所述活性药剂是小分子，并且步骤(a)在步骤(b)之后进行。
189.适合在所述制备方法中使用的纳米粒子、第一聚合连接物、第二聚合连接物、脑内化转运蛋白组成部分和活性药剂是上文中结合纳米递送系统的各个不同方面和实施方式描述的那些。
190.药物组合物
191.另一方面，提供了一种药物组合物，其包含根据上文中描述的各种不同实施方式的纳米递送系统和可药用载体。
192.当在本文中使用时，“可药用制剂”、“药物组合物”或“可药用组合物”可以包括多
种载体中的任一者，例如溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐类、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等类似材料及其组合，正如本领域普通技术人员会知道的(remington's,1990)。含有本文描述的纳米粒子作为活性成分的药物组合物可以按照常规药物复合技术来制备。参见例如《remington制药学》(remington's pharmaceutical sciences)，第18版，mack publishing co.,easton,pa.(1990)。也参见《remington药学科学与实践》(remington:the science and practice ofpharmacy)，第21版，lippincott williams&wilkins,philadelphia,pa.(2005)。
193.取决于组合物将要以固体、液体还是气溶胶形式给药，以及对于例如注射的给药途径来说是否需要无菌，组合物可以包含不同类型的载体。本领域普通技术人员会熟悉用于产生用于注射或通过任何其他途径施用的无菌溶液的技术。无菌可注射溶液通过将活性化合物以所需的量与本领域技术人员熟悉的各种不同其他成分一起并入到适合的溶剂中来制备。
194.以本文提出的药物组合物的重量计，所述载体可以总共占约0.1％至约99.99999％。
195.根据某些实施方式，所述药物组合物被配制成用于系统给药。根据某些实施方式，所述药物组合物被配制成用于选自静脉内和鼻内给药的系统给药。根据某些实施方式，所述药物组合物被配制成用于静脉内给药。根据某些实施方式，所述药物组合物被配制成用于鼻内给药。根据某些实施方式，所述药物组合物被配制成用于鞘内给药。
196.本文设想的组合物可以采取溶液、悬液、乳液、气溶胶、其组合或本领域中通常已知的任何其他可药用组合物的形式。
197.在某些实施方式中，所述载体是溶剂。作为非限制性实例，所述组合物可以配置在所述溶剂中。这种溶剂包括本领域中已知的任何适合的溶剂，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水。
198.所述组合物的配方可以随着给药途径而变。例如，对于在水性溶液中的肠胃外给药来说，如果需要应该将所述溶液适合地缓冲，并首先使用足够的盐水或葡萄糖使所述液体稀释剂等渗。根据本公开，可以使用的无菌水性介质对于本领域技术人员来说将是已知的。
199.也可以在所述组合物中并入补充性活性成分。对于人类给药来说，制剂应该满足fda生物制剂标准办公室所需的无菌性和总体安全和纯度标准。可以通过任何已知的途径给药。
200.在某些实施方式中，药物组合物包括至少约0.001g至约1g本文公开的粒子/千克受试者。
201.所述药物组合物可以包含各种不同的抗氧化剂以延迟一种或多种组分的氧化。此外，可以通过防腐剂来防止微生物的作用，例如各种不同的抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。所述组合物在制造和储存条件下必须是稳定的，并能抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。应该认识到，外毒素污染至少应保持在安全水平下，例如小于0.5ng/mg蛋白质。
202.在组合物是液体形式的实施方式中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂类(例如甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合。在许多情况下，包括等渗剂例如糖类、氯化钠或其组合将是优选的。
203.在其他实施方式中，可以使用鼻溶液或喷剂、气溶胶或吸入剂。鼻溶液通常是被设计成以滴剂或喷雾剂形式施用到鼻通道的水性溶液。
204.也设想了用于口服给药的固体组合物。在这些实施方式中，所述固体组合物可以包括例如溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、颊组合物、锭剂、酏剂、混悬剂、糖浆或其组合。
205.无菌可注射溶液通过将活性化合物(例如纳米粒子)以所需量与上文列举的各种不同其他成分一起并入到适合的溶剂中来制备。如果需要，可以将液体介质适合地缓冲，并在注射之前首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。
206.可以根据需要重复给药，正如由本领域普通技术人员所确定的。因此，在本文阐述的方法的某些实施方式中，设想了单剂。在其他实施方式中，设想了两剂或更多剂。当向受试者给药超过一剂时，多剂之间的时间间隔可以是由本领域普通技术人员确定的任何时间间隔。
207.组合物的治疗和诊断用途
208.根据某些实施方式，所述药物组合物用于在有需要的受试者中预防疾病。根据某些实施方式，所述药物组合物用于在有需要的受试者中治疗疾病。根据某些实施方式，所述药物组合物用于在有需要的受试者中监测疾病。在某些实施方式中，所述疾病是脑相关疾病或障碍。
209.在某些实施方式中，所述疾病是中枢神经系统疾病。根据某些实施方式，所述障碍是脑障碍。
210.在某些实施方式中，所述药物组合物用于治疗脑相关疾病或障碍。在某些实施方式中，所述脑相关疾病或障碍选自脑相关癌症、神经退行性障碍、神经肌肉疾病、神经发育疾病、自身免疫脑相关疾病、神经精神障碍、癫痫症、疼痛障碍、脑血管疾病、神经遗传疾病和神经传染疾病。
211.在某些实施方式中，所述脑相关疾病是脑相关癌症。当在本文中使用时，术语“脑相关癌症”涵盖原发性脑肿瘤和转移性脑肿瘤。在某些实施方式中，所述脑相关癌症选自但不限于脑和神经肿瘤、脑转移瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤(gbm)和胶质肉瘤(gs)。在某些实施方式中，所述脑相关疾病是神经退行性障碍。在某些实施方式中，所述神经退行性障碍选自帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病和痴呆。在某些实施方式中，所述脑相关疾病是神经肌肉疾病。在某些实施方式中，所述神经肌肉疾病选自肌萎缩侧索硬化症(als)和运动神经元病。在某些实施方式中，所述脑相关疾病是神经发育疾病。在某些实施方式中，所述神经发育疾病选自自闭症谱系障碍和注意力缺陷多动障碍(adhd)。在某些实施方式中，所述脑相关疾病是多发性硬化(ms)。在某些实施方式中，所述脑相关疾病是神经精神障碍。在某些实施方式中，所述神经精神障碍选自精神分裂症、药物成瘾、吸烟成瘾、进食障碍、强迫症、各种不同形式的抑郁症、焦虑症、认知障碍和情感障碍。在某些实施方式中，所述脑相关疾病是癫痫性障碍。在某些实施方式中，所述癫痫性障碍是癫痫症。在某些实施方式中，所述脑相关疾病是疼痛障碍。在某些实施方式中，所述脑相关疾病是脑血管疾病。在某些实施方式
中，所述脑血管疾病选自创伤性脑损伤和中风。在某些实施方式中，所述脑相关疾病是神经遗传疾病。在某些实施方式中，所述神经遗传疾病选自亨廷顿病、肯尼迪病、代谢障碍、溶酶体贮积症和杜兴氏病。在某些实施方式中，所述脑相关疾病是神经传染疾病。
212.在某些实施方式中，所述脑相关疾病是阿尔茨海默病。在某些实施方式中，所述脑相关疾病是帕金森病。根据某些实施方式，所述脑相关疾病是亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、运动神经元病(lou gehrig’s病)或脊髓性肌萎缩症。根据某些实施方式，所述脑相关疾病是朊病毒病。
213.当在本文中使用时，术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长动物、啮齿动物等(例如将要作为特定治疗的接受者)。通常，术语“受试者”和“患者”可互换使用，除非本文中另有指明。
214.在某些实施方式中，所述受试者是人类受试者。在某些实施方式中，所述受试者具有患脑相关疾病、障碍或医学病症的风险。在某些实施方式中，所述受试者被诊断为患有脑相关疾病、障碍或医学病症。在某些实施方式中，所述受试者被诊断为患有脑相关遗传障碍。在某些实施方式中，所述受试者具有患神经退行性疾病的风险。在某些实施方式中，所述受试者被诊断为患有神经退行性疾病。在某些实施方式中，所述受试者被诊断为患有阿尔茨海默病。在某些实施方式中，所述受试者被诊断为患有帕金森病。
215.当在本文中使用时，具有患疾病、障碍或医学病症的风险的受试者是表现出指示疾病、障碍或医学病症的一种或多种体征或症状或正在筛查疾病、障碍或医学病症(例如在例行体检期间)的受试者。具有患疾病、障碍或医学病症的风险的受试者也可能具有一种或多种风险因素。具有患疾病、障碍或医学病症的风险的受试者涵盖以前尚未测试过所述疾病、障碍或医学病症的个体。然而，具有患疾病、障碍或医学病症的风险的受试者也涵盖已接受初步诊断但尚未进行确认性测试(例如活检和/或组织学)或所述疾病、障碍或医学病症的阶段未知的个体。所述术语还包括曾经患有所述疾病、障碍或医学病症的人(例如缓解中的个体)。
216.具有患脑相关疾病、障碍或医学病症的风险的受试者可能被诊断为患有或被发现未患有所述脑相关疾病、障碍或医学病症。
217.当在本文中使用时，被诊断为患有脑相关疾病、障碍或医学病症的受试者可以使用任何适合的方法来诊断，包括但不限于活检、x-射线、验血和本发明的诊断方法。“初步诊断”是仅仅基于视觉(例如ct扫描或肿块的存在)和抗原测试的诊断。
218.在某些实施方式中，所述受试者患有脑相关疾病、障碍或医学病症，并且使用所述成像方法确定所述疾病、障碍或医学病症的阶段。在某些实施方式中，用药物治疗所述患有脑相关疾病、障碍或医学病症的受试者，并使用所述成像方法进行所述治疗的跟踪。
219.当在本文中使用时，术语疾病、障碍或病症的“治疗”或“改善”是指其至少一种症状的减轻、其严重程度的降低或其进展的抑制。治疗不一定意味着所述疾病、障碍或病症被完全治愈。本文中的有用组合物只需降低疾病、障碍或病症的严重程度、降低与其相关的症状的严重程度或提供患者或受试者生活质量的改善，即可成为有效的治疗。
220.在某些实施方式中，本发明提供了一种在有需要的受试者中施用活性药剂以预防、治疗和/或监测脑相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含本发明的所有实施方式中的纳米递送系统的药物组合物。根据某些目前优选的实施方式，所述方法包括
将所述活性药剂递送到所述受试者的脑部区域。
221.在某些实施方式中，所述方法还包括对所述受试者的脑部区域进行成像，从而评估所述纳米递送系统在所述受试者脑中的积累的步骤。在某些实施方式中，所述成像使用选自下述的成像系统来进行：计算机断层扫描成像(ct)，x-射线成像，磁共振成像(mri)，正电子发射断层扫描(pet)，单光子发射计算机断层扫描(spect)，超声波(us)及其任何组合。
222.在某些实施方式中，本发明提供了一种治疗诊断学方法。所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的药物组合物并对所述受试者的靶位点进行成像，以确定所述纳米粒子是否在所述受试者的靶位点中积累的步骤。在某些实施方式中，所述靶位点是所述受试者脑中的位点。
223.在某些实施方式中，将组合物给予受试者可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法来进行。给药方式可以随着应用而变。例如，给药方式可以随着待成像的具体细胞、脑部区域或受试者而变。例如，组合物的给药可以静脉内、脑内、颅内、鞘内、脑室内、黑质或黑质区内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、气管内、鼻内、肌肉内、腹膜内、皮下、口服、局部、通过吸入(例如气溶胶吸入)、注射、输注、蛛网膜下输注、经粘膜输注、颈动脉内输注、连续输注、直接浸浴靶细胞的局部灌注、通过导管、通过灌洗或通过其他方法或上述方法的任何组合来进行，正如本领域普通技术人员已知的。
224.在某些实施方式中，所述药物组合物通过系统给药途径给予所述受试者。在某些实施方式中，所述系统给药选自静脉内(iv)给药和鼻内(in)给药。在某些实施方式中，所述药物组合物通过鞘内(it)给药给予所述受试者。
225.在某些实施方式中，所述粒子被静脉内给药。在某些实施方式中，所述粒子被鼻内给药。
226.在配制后，组合物将以与剂量配方相容的方式并以有效的量给药。例如，所述纳米粒子可以以对所需特定成像应用有效的量给药。
227.药物组合物的有效量根据预期目标来确定，例如根据成像方法和待成像的受试者或受试者的部分。待给药的量也可能随着待使用的具体给药途径而变。所述组合物优选地以“安全有效的量”给药。当在本文中使用时，术语“安全有效的量”是指足以达到预期目标(例如成像)而没有过多不良副作用(例如毒性、刺激性或过敏反应)的组合物的量。
228.在某些实施方式中，靶位点的成像通过利用穿透性辐射的成像技术来进行。根据某些实施方式，所述成像技术选自磁共振成像(mri)、计算机断层扫描成像(ct)、x-射线成像、正电子发射断层扫描(pet)、单光子发射计算机断层扫描(spect)和超声波(us)。
229.在某些实施方式中，所述成像步骤在给药步骤后0.5至96小时进行。在某些实施方式中，所述成像步骤在给药步骤后0.5至48小时进行。在某些实施方式中，所述成像步骤在给药步骤后0.5至24小时进行。在某些实施方式中，所述成像步骤在给药步骤后0.5至12小时进行。在某些实施方式中，所述成像步骤在给药步骤后1至12小时进行。在某些实施方式中，所述成像步骤在给药步骤后1至6小时进行。在某些实施方式中，所述成像步骤在从给药步骤起96小时内进行。在某些实施方式中，所述成像步骤在从给药步骤起48小时内进行。在某些实施方式中，所述成像步骤在从给药步骤起24小时内进行。在某些实施方式中，所述成像步骤在从给药步骤起12小时内进行。在某些实施方式中，所述成像步骤在从给药步骤起6小时内进行。
230.在某些实施方式中，所述方法包括确定所述纳米粒子是否在所述受试者的靶位点中积累的步骤。在某些实施方式中，治疗决定可能是不给予治疗。在某些实施方式中，使用所述成像数据的分析来决定对所述患者适合的治疗途径。在某些实施方式中，决定对患者适合的治疗途径取决于例如所述疾病、障碍或医学病症的阶段以及所述患者的健康状态。在某些实施方式中，所述治疗途径包括选自下述的一种或多种治疗方案：静脉内，鼻内，腹膜内，肌肉内和皮下，以及旨在治疗的任何其他生物或无机产物。在某些实施方式中，在所述成像后给予治疗。在某些实施方式中，治疗在对所述受试者成像的同时实时给予所述受试者。
231.在某些实施方式中，所述受试者的成像和治疗同时进行。在某些实施方式中，可以在成像后将所述生物活性分子在所述受试者的靶位点中激活。
232.药剂盒
233.在某些实施方式中，本发明提供了包含本文公开的一种或多种组合物的药剂盒。在某些实施方式中，本发明提供了可用于本文公开的方法的药剂盒。例如，药剂盒可以包括具有容纳本文公开的任何组合物的无菌储库的容器。在某些实施方式中，所述药剂盒还包括说明书。例如，药剂盒可以包括将所述组合物给予受试者的说明书(例如适应症、剂量、方法等)。在又一个实例中，所述药剂盒可以包括将本发明的组合物和方法应用于成像系统的说明书，例如计算机断层扫描(ct)、超声波(us)、磁共振成像(mri)。
234.本发明的各种不同实施方式的描述是出于说明的目的而呈现的，但并不旨在穷举或限于所公开的实施方式。在不背离所描述的实施方式的范围和精神的情况下，许多修改和变化对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。本文使用的术语经过挑选以最好地解释实施方式的原理、实际应用或与市场中发现的技术相比的技术改进，或使本领域的其他普通技术人员能够理解本文公开的实施方式。
235.本文中叙述的任何浓度范围、百分率范围或比例范围应该理解为包括所述范围内任何整数的浓度、百分率或比例及其分数，例如整数的十分之一或百分之一，除非另有指明。
236.本文中叙述的与任何物理特点例如聚合物亚单元、尺寸或厚度相关的任何数字范围，应该理解为包括所叙述的范围内的任何整数，除非另有指明。
237.当在本文中使用时，术语“约”在与值组合时，是指所述参考值的加或减10％。例如，约1000da的分子量是指1000da+-100da的分子量。
238.应该指出，当在本文和随附的权利要求书中使用时，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数指称物，除非上下文明确叙述不是如此。因此，例如，对“多核苷酸”的指称包括多个这样的多核苷酸，并且对“多肽”的指称包括对一个或多个多肽及其本领域技术人员已知的等同物的指称，等等。还应该指出，权利要求项可以起草成排除任何可选要素。因此，这个声明旨在充当与权利要求项要素的叙述相结合使用诸如“唯一”、“仅仅”等的排他性术语或使用“否定”限制的先行基础。
239.术语“多个”意味着“两个或更多个”，除非明确规定不是如此。
240.在使用类似于“a、b和c等中的至少一者”的惯用语的情况下，一般来说，这种结构意在本领域技术人员能够理解所述惯用语的意义(例如，“具有a、b和c中的至少一者的系统”将包括但不限于具有单独的a、单独的b、单独的c、a和b一起、a和c一起、b和c一起和/或
a、b和c一起等的系统)。本领域技术人员还将进一步理解，实际上呈现两个或更多个可选项的任何转折连词和/或短语，不论是在说明书、权利要求书还是附图中，均应理解为考虑了包括所述项之一、任一所述项或两项的可能性。例如，短语“a或b”将理解为包括“a”或“b”或“a和b”的可能性。
241.应该理解，为清楚起见而在独立实施方式的上下文中描述的本发明的某些特点，也可以组合提供在单个实施方式中。相反，为简洁起见而在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种不同特点，也可以单独地或以任何适合的子组合形式提供。属于本发明的实施方式的所有组合均被本发明具体地包含并在本文中公开，如同每一个组合被单独且明确地公开。此外，各种不同实施方式及其要素的所有子组合也被本发明具体地包含并在本文中公开，如同每一个这样的子组合被单独且明确地公开。
242.对于本领域普通技术人员来说，本发明的其他目的、优点和新颖特点在检查了下述不旨在限制的实施例后将变得显而易见。此外，如上文中所述和下面的权利要求书部分中所要求保护的本发明的各种不同实施方式和方面中的每一者，均在下面的实施例中找到实验支持。
243.如上文中所述和下面的权利要求书部分中所要求保护的本发明的各种不同实施方式和方面，均在下面的实施例中找到实验支持。
244.实施例
245.一般来说，本文中使用的命名和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组dna技术。文献中充分解释了此类技术。参见例如《分子克隆实验室手册》(molecular cloning:a laboratory manual)，sambrook等，(1989)；《分子生物学现代方法》(current protocols in molecular biology)，第i-iii卷，ausubel,r.m.主编，(1994)；ausubel等，《分子生物学现代方法》(current protocols in molecular biology)，john wiley和sons,baltimore,maryland(1989)；perbal，《分子克隆实用指南》(a practical guide to molecular cloning)，john wiley&sons,new york(1988)；watson等，《重组dna》(recombinant dna)，scientific american books,new york；birren等主编，《基因组分析：实验室手册系列》(genome analysis:a laboratory manual series)，第1-4卷，cold spring harbor laboratory press,new york(1998)；在美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中阐述的方法；《细胞生物学实验室手册》(cell biology:a laboratory handbook)，第i-iii卷，cellis,j.e.主编(1994)；《动物细胞培养—基本技术手册》(culture of animal cells-a manual of basic technique)，freshney,wiley-liss,n.y.(1994)，第三版；《免疫学现代方法》(current protocols in immunology)，第i-iii卷，coligan j.e.主编(1994)；stites等主编，《基础和临床免疫学》(basic and clinical immunology)(第8版)，appleton&lange,norwalk,ct(1994)；mishell和shiigi主编，《蛋白质纯化和表征策略—实验室课程手册》(strategies for protein purification and characterization-a laboratory course manual)，cshl press(1996)；所有这些文献通过参考并入。其他普通参考文献在本文件中各处提供。
246.实施例1：用胰岛素和egfr抗体包被的金纳米粒子(gnps)(egfr&ins-gnps)的制备和表征
247.图1示出了粒子的非限制性实例的示意图，示出了用聚合物层包被的金纳米粒子
(gnp)，所述聚合物层包含偶联到胰岛素的第一聚合连接物(例如-s-peg-c(o)-，～5kda)、偶联到生物活性分子(例如抗体)的第二聚合连接物(例如-s-peg-c(o)-，～3.5kda)以及单功能的第三聚合物组成部分(例如-s-peg-o-ch3～5kda)。
248.gnp合成
249.通过柠檬酸盐还原haucl4来制备20nm球形gnps。将含总共414μl的50％w/vhaucl4溶液的200ml蒸馏水在加热板上的油浴中煮沸并同时搅拌。在沸腾后，添加4.04ml10％柠檬酸钠溶液，并将所述混合物在煮沸的同时搅拌另外10分钟。将溶液从所述板上取下，并在冷却至室温后将所述溶液离心，直至纳米粒子沉淀。
250.peg5000和胰岛素与gnps的偶联
251.首先用mpeg-sh(～5kda；70％的粒子表面)和异功能的hs-peg-cooh(～5kda；15％的粒子表面)部分包被gnps(85％的粒子表面)。所述部分包被所需的mpeg-sh和hs-peg-cooh的量根据下述发现从理论计算推衍：硫醇-peg分子在金纳米粒子表面上占据0.35nm2的足迹面积(qian,ximei等，nature biotechnology 26.1(2008):83-90)。通过向gnp溶液添加hs-peg-cooh(145μl，50mg/ml)和mpeg-sh(677μl，50mg/ml)的混合物并混合两小时来进行偶联。然后将所述溶液以15,000rpm超速离心20分钟，然后以20,000rpm再次超速离心15分钟。将所述含有peg包被的gnps(总共85％包被)的沉淀物转移到小瓶。然后通过在冰上添加过量的胰岛素连同edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺hcl)和nhs(n-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐)后混合两小时，将胰岛素共价偶联到hs-peg-cooh的羧基。然后将所述溶液以14,000rpm离心30分钟(维持在冷却温度下)，并将含有ins-peg-gnps的下层相转移到小瓶中。
252.peg3500和egfr ab与gnps的偶联
253.为了进一步将egfr ab偶联到所述gnps，向所述部分包被的gnps添加102μlhs-peg-cooh(～3.5kda)溶液(50mg/ml)，以包被剩余15％的粒子表面。然后将所述溶液在4℃下混合2小时，然后以14,000rpm离心30分钟。然后通过添加过量的egfr ab连同edc和nhs，将egfr ab共价偶联到hs-peg-cooh(～3.5kda)的游离羧基。然后将所述溶液在4℃下搅拌2小时，然后离心直至达到30mg/ml au的终浓度。
254.在每个制备步骤后使用紫外可见光谱对egfr&ins-gnps进行表征(图2)。在不同包被水平后uv-vis信号的迁移确认了成功的包被。
255.通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)测定法确认所述peg连接物与胰岛素和egfr ab之间的共价偶联。通过sds-page(在120v下运行60分钟)分析了游离胰岛素、游离egfr ab、gnp、peg包被的gnp(gnp+peg)、胰岛素包被的gnp(gnp+peg+ins)和egfr&ins-gnp(gnp+peg+ins+ab)。正如可以在图3中看到的，在电泳过程中胰岛素和egfr ab均不与gnps分开，表明了稳定的共价偶联。
256.实施例2：egfr&ins-gnps在小鼠脑中的递送
257.将每只体重为20-25g的13只雄性balb/c小鼠分成3组。第一组中的小鼠(对照；n＝3)用对照gnps(200μl；30mg/ml)iv给药。所述对照gnps通过用5kda mpeg-sh的层包被20nm球形gnps来制备(mpeg-gnps)。第二组中的小鼠(n＝5)用200μl30mg/ml egfr-ins-gnps静脉内给药到尾静脉中。第三组中的小鼠(n＝5)用20μl egfr-ins-gnps鼻内给药。在给药后5小时将所有小鼠麻醉并处死。对小鼠进行灌注以除去存在于血管内的所有粒子。
258.在处死后，通过微型ct扫描仪扫描小鼠脑部。正如可以在图4a中看到的，在接受非靶向mpeg-gnps的对照小鼠的脑中未观察到gnp积累。相反，来自于第二和第三组的小鼠脑部的微型ct图像(分别为图4b和4c)显示出清晰可见的egfr&ins-gnp积累。
259.通过小鼠脑样品的icp-ms分析进一步定量测量小鼠脑中的gnps积累，显示出在静脉内给药后脑中的总量为13.45μg au(根据理论计算大约1.6646e+14个粒子)和鼻内给药后脑中的总量为0.42μg au(根据理论计算大约5.19772e+12个粒子)。
260.总的来说，所述结果表明胰岛素配体促进gnp复合物通过bbb的运输，导致egfr&ins-gnp在静脉内或鼻内给药后显著穿透到脑中，其中通过iv给药穿透到脑中的粒子的量更高。然而，微型ct图像显示当通过iv或in途径给药时，所述粒子到达不同位置。因此，所述结果进一步表明egfr&ins-gnps可以充当ct造影剂，用于标记它们在其中积累的特定脑区域。
261.实施例3：egfr&ins-gnps的生物分布和药代动力学特征
262.为了检查脑中egfr&ins-gnps的量以及全身生物分布，将egfr&ins-gnps静脉内注射到雄性balb/c小鼠的尾静脉中。在各个不同时间点直至注射后一个月将小鼠处死(每个时间点n＝3)，并获取小鼠的脑、肾脏和肝脏用于icp-ms分析，以定量随时间推移器官中的金的量。
263.正如在图5a中证实的，egfr&ins-gnps在脑中快速积累，并保持在高浓度下直至注射后5小时。随后观察到粒子从脑中的逐渐清除，在注射后1周时金的量可忽略，并在注射后1个月完全清除。
264.此外，正如可以在图5b中看到的，egfr&ins-gnps在肾脏和肝脏中积累直至注射后24小时，然后从这些器官中清除直至注射后1个月。
265.实施例4：igg1&ins-gnps在小鼠脑中的递送
266.如实施例1中所述合成了用荧光抗体igg1(小鼠单克隆igg 1alexa fluor 488同种型，克隆11711)和胰岛素包被的gnps(igg1&ins-gnps)，其中存在下述差异：
267.1)使用荧光igg1抗体代替egfr ab。
268.2)hs-peg-cooh(～5kda)：添加193μl而不是145μl(～20％的粒子表面)。
269.3)mpeg-sh(～5kda)：添加580μl而不是677μl(～60％的粒子表面)。
270.4)hs-peg-cooh(～3.5kda)：添加136μl而不是102μl(～20％的粒子表面)。
271.使用200μl30mg/ml igg1&ins-gnps(n＝5)或等同量(0.4mg)的游离荧光igg1抗体(n＝3)对小鼠进行iv注射。在注射后8小时，提取小鼠脑并使用icp-ms(n＝3)或免疫细胞化学(n＝2)进行分析。
272.正如图6a中证实的，定量icp-ms分析表明igg1&ins-gnps成功穿透到脑中(图6a)。
273.对于免疫细胞化学荧光(ihc f)来说，使用的固定和通透化方法(fpm)是fpm13，并且切片取自大脑皮层区域。使用cryostat制备7um脑冷冻切片并进行免疫染色。将4
′
,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)用于核dna标记。使用共聚焦显微镜检测荧光抗体信号并获取照片。所有照片在相同的曝光条件下拍摄。正如可以在图6b中看到的，在用igg1&ins-gnps处理的小鼠的脑切片中观察到高荧光(右图)，而在用游离荧光抗体处理的小鼠的脑切片中除了dapi信号之外没有看到荧光(左图)。结果表明，所述靶向gnp系统促进跨bbb运输能力天然受限的抗体的脑穿透。
274.实施例5：anti-iba1&ins-gnps在小鼠脑中的递送
275.使用荧光anti-iba1(兔单克隆抗体
–
alexa fluor 647)代替igg1 ab，如实施例4中所述合成了用胰岛素和anti-iba1荧光抗体(小胶质细胞的抗体)包被的gnps。
276.用200μl30mg/ml anti-iba1&ins-gnps或等同量(0.1mg)的游离荧光anti-iba1对小鼠进行iv注射。在注射后7小时，将小鼠处死并进行灌注。然后，将小鼠脑切片并使用超分辨率显微镜成像。将血管肌肉用alexa fluor 568染色，将bbb内皮细胞用cd31
–
alexa fluor 488染色。
277.正如可以在图7a和7b中看到的，超分辨率显微镜图像显示了anti-iba1&ins-gnps在脑中的迁移(7a)，而游离抗体被阻断在脑血管内(7b)。
278.实施例6：抗体在共价偶联到gnp穿梭物后的功能
279.为了确保抗体在偶联到gnp穿梭物时保持功能，使用抗tgf-β抗体非苏木单抗进行了体外实验。在非苏木单抗与癌细胞分泌的tgf-β细胞因子结合后，免疫系统的活性增强，正如通过肿瘤坏死因子(tnf)-a的升高所表示的。
280.使用非苏木单抗代替egfr ab，如实施例1中所述合成了非苏木单抗&ins-gnps。
281.向f4-t细胞与具有可溶性tgfβ的skmel23癌细胞的共培养物添加1μm非苏木单抗&ins-gnps。在温育过夜后，使用elisa对tnf-a分泌进行定量，并与不含非苏木单抗&ins-gnps的对照细胞进行比较。
282.有趣的是，与未处理的细胞相比，对用非苏木单抗&ins-gnps处理的细胞观察到更高浓度的tnf-a，表明尽管通过共价偶联到peg连接物而被固定到gnp复合物，但所述抗体保持其活性。
283.实施例7：肽&ins-gnps在脑中的递送
284.为了检查所述纳米平台将肽递送到脑中的能力，使用了靶向阿尔茨海默病患者脑中存在的淀粉样肽-β(aβ)斑块的环状肽(具有下文呈现的结构)。
285.(环状d,l-α-肽；us 2017/0088585)
286.将所述环状肽(pep)偶联到ins-gnps以形成pep&ins-gnps。合成过程如实施例1中所述来进行，使用环状d,l-α-肽代替egfr-ab。
287.在不同的偶联步骤后，使用紫外可见光谱(图8)、动态光散射(dls)和zeta电位测量对粒子进行表征。
288.表1示出了裸gnps、gnps+peg(在第一个偶联步骤后)和用胰岛素和肽包被的最终粒子的zeta电位和流体动力学直径。
289.表1：包含环状肽作为活性药剂的合成粒子的物理表征
290.粒子size(nm)zeta电位(mv)裸gnp23.4-38.7
gnp+peg45.1-5.95gnp+pegs+ins+肽56.3-0.1
291.在粒子包被后zeta电位值降低到几乎中性水平以及粒子直径的增加确认了化学包被。此外，对不同包被水平观察到扩展且迁移的紫外可见光信号(图8)。
292.对于体内实验来说，使用了阿尔茨海默病的5xfad小鼠模型(ad，4月龄)。
293.将pep&ins-gnps静脉内注射(200μl，25mg/ml)到5xfad小鼠(n＝5)和wt小鼠(n＝5)的尾静脉中。在iv注射后6小时，将小鼠处死，进行灌注，并使用微型ct扫描仪进行扫描(图9a和9b)。可以看到，在iv给药后pep&ins-gnps穿透到健康和患病小鼠两者的脑中，并且与健康脑(图9a)相比，在患病脑中的积累明显更高(图9b)。
294.通过小鼠脑样品的icp-ms分析进一步定量测量了pep&ins-gnps在小鼠脑中的积累(图9c)。结果显示，pep&ins-gnps在ad小鼠的脑中的积累为健康脑中的4倍高，表明这些粒子从健康脑中逐渐清除，但由于靶向aβ斑块的偶联肽而在ad小鼠的脑中保留更长时间。
295.为了进一步研究所述环状肽的靶向能力，使用罗丹明b标记的肽合成了荧光标记的pep&ins-gnps。将荧光标记的pep&ins-gnps与来自于wt或5xfad小鼠的未固定的海马冠状切片在4℃温育20小时。然后将所述切片用识别aβ斑块的抗aβ抗体6e10和用于染色细胞核的dapi共染色。来自于ad小鼠的脑切片显示出明显的pep&ins-gnps染色，其与aβ斑块的染色共定位(图9d)，
296.表明所述肽尽管被偶联到gnp载体，但仍保留其功能和靶向能力。
297.实施例8：cispt-ins-gnps在小鼠脑中的递送
298.使用顺铂(cispt)这种具有不良bbb穿透性的化学治疗剂，研究了所述gnp平台将生物活性小分子递送到脑中的能力。
299.顺铂+胰岛素-gnps的合成
300.首先用mpeg-sh(5kda；60％的粒子表面)和异功能的hs-peg-cooh(1kda；20％的粒子表面)部分包被(80％的粒子表面)20nm球形gnps(如实施例1中所述合成)。通过向所述gnp溶液添加hs-peg-cooh(39μl，50mg/ml)和mpeg-sh(580μl，50mg/ml)的混合物并混合3小时来进行偶联。然后将所述溶液以14,000g离心30分钟。将含有peg包被的gnps(80％包被)的沉淀物转移到小瓶。然后通过添加过量的顺铂以及edc和nhs，然后在4℃混合3小时，将顺铂共价偶联到hs-peg-cooh的羧基。然后将所述溶液在4℃下以14,000g离心30分钟，并将含有顺铂-gnps的下层相转移到小瓶中。
301.为了将胰岛素进一步偶联到所述gnps，向所述部分包被的gnps添加hs-peg-cooh(5kda)(194μl，50mg/ml)以包被剩余的20％的粒子表面。然后将所述溶液在4℃下混合3小时，随后在4℃下以14,000g离心30分钟。然后通过添加过量胰岛素连同edc和nhs，将胰岛素共价偶联到hs-peg-cooh(5kda)的游离羧基。然后将所述溶液在4℃下搅拌3小时，然后离心，直至达到25mg/ml au的终浓度。
302.体内实验
303.使用200μl顺铂+胰岛素-gnps(根据pt浓度的icp-ms测量大约0.1mg顺铂)(n＝3)或等同剂量的游离顺铂(100μl，1mg/ml)(n＝3)，通过尾静脉对6-7周龄雄性balb/c小鼠进行静脉内给药。在给药后8小时将小鼠处死。使用20ml盐水对小鼠进行灌注，以除去存在于血管内的所有粒子。
304.在处死和灌注后，提取小鼠脑并称重，然后进行icp-ms分析以定量脑中的au和pt的量。
305.正如可以在图10a和10b中看到的，在用顺铂+胰岛素-gnps给药的小鼠的脑中同时发现了金和铂，表明所述gnps成功递送到脑。此外，图10b显示，与给予等同剂量的游离顺铂后相比，在用顺铂+胰岛素-gnps给药的小鼠的脑中发现的pt的量明显更高，表明所述gnp平台增强小分子顺铂对bbb的穿透。
306.使用用胰岛素和代替顺铂作为小分子药物的pj34包被的类似gnps(pj34-ins-gnps)进行了另外的实验。在这些粒子的静脉内给药后24小时小鼠脑的离体微型ct扫描显示pj34-ins-gnps高效穿透到脑，为使用所述gnp平台将小分子治疗药剂递送到脑的可能性提供了进一步证据。
307.实施例9：igg1&ins包被的氧化铁纳米粒子在小鼠脑中的递送
308.用葡聚糖包被的50nm球形氧化铁纳米粒子ionps购自chemicell。首先通过添加双蒸水(ddw)并以12,000rpm离心30分钟，从所述粒子除去葡聚糖包衣。
309.然后分别通过hs-peg-cooh(～5kda)和hs-peg-cooh(～3.5kda)，将所述ionps用胰岛素和igg1抗体包被。
310.首先使用mpeg-sh(～5kda；70％的粒子表面)和异功能的hs-peg-cooh(～5kda；15％的粒子表面)将所述ionp部分包被(85％的粒子表面)。部分包被所需的mpeg-sh和hs-peg-cooh的量根据粒子直径和表面积从理论计算来推衍。通过向所述ionp溶液添加hs-peg-cooh(58μl，50mg/ml)和mpeg-sh(271μl，50mg/ml)的混合物并混合两小时来进行偶联。然后将所述溶液离心，并将含有peg包被的ionps(总共85％包被)转移到小瓶。然后通过在冰上添加过量胰岛素连同edc和nhs后混合两小时，将胰岛素共价偶联到hs-peg-cooh的羧基。然后将所述溶液离心，并将含有ins-peg-ionps的下层相转移到小瓶。
311.对于接下来的包被步骤来说，向所述部分包被的ionps添加hs-peg-cooh(～3.5kda)(41μl，50mg/ml)以包被剩余的15％的粒子表面。然后将所述溶液在4℃下混合2小时，然后离心。然后通过添加过量的igg1连同edc和nhs，将igg1共价偶联到hs-peg-cooh(～3.5kda)的游离羧基。然后将所述溶液在4℃下搅拌2小时，然后离心，直至达到25mg/ml fe的终浓度。
312.体内实验
313.将igg1&ins-ionps(200μl；25mg/ml)静脉内注射给雄性balb/c小鼠(n＝3)。8小时后，将小鼠处死并进行灌注，以除去存在于血管内的粒子。然后提取小鼠脑，并通过使用icp-ms分析定量测量fe浓度来评估粒子的积累。
314.结果表明，在注射后8小时，igg1&ins-ionps高效穿透到脑中，fe浓度为0.0047mg fe/gr脑组织。因此可以得出结论，不同纳米粒子类型、特别是ionps，可以用作所述递送系统的纳米粒子核心。
315.实施例10：用抗体(igg1)和作为脑内化组成部分的转铁蛋白包被的gnp的bbb穿透
316.使用igg1抗体代替egfr ab并使用人类全转铁蛋白代替胰岛素，如实施例1中所述合成了用igg1和转铁蛋白包被的gnps(igg1&trf-gnps)。
317.为了研究它们的bbb穿透性，使用了体外bbb模型。分化成bmec样细胞(ibmecs)的人类诱导多能干细胞(ipscs)为人类bbb模型提供了强大的来源。ibmecs表现出近似于人类
脑血管系统的分子、结构和功能bbb特性，包括跨内皮电阻(teer)。这些bbb模型使用了2维(2d)transwell插板(vatine,gad d.等，cell stem cell 20.6(2017):831-843；和lippmann,ethan s.等，scientific reports 4.1(2014):1-10)。校者注：第二句ghuman疑似打字错误，应为human
318.将50万个细胞在transwells中培养并生长至它的teer值达到约3500ωxcm2。测量teer，然后将igg1&trf-gnps、igg1&ins-gnps或mpeg-gnps(对照粒子)引入到上层培养基中(0.25mg/1百万个细胞；每组n＝2)。两小时后，再次测量teer值并计算teer的降低(与添加粒子前的初始值相比)。teer值的降低意味着电阻更小并表明通过紧密细胞层的渗透性提高。
319.图11表示了三个组的teer降低。发现与对照gnps相比，igg1&trf-gnps(gnps+igg1+trf)和igg1&ins-gnps(gnps+igg1+ins)都表现出通过紧密细胞层的渗透性提高，指向这些粒子由于偶联的脑内化组成部分即胰岛素或转铁蛋白而具有在体内穿透到脑中的潜力。然而，与转铁蛋白偶联的粒子相比，胰岛素偶联的粒子显示出显著增强的渗透性。
320.实施例11：胰岛素水平、抗体水平和连接物尺寸对纳米递送系统跨过bbb的能力的影响
321.为了研究连接物尺寸和每种包被分子的覆盖百分数对纳米递送系统跨过bbb的能力的影响，合成了用胰岛素和igg1 ab包被的各种不同的脑靶向金纳米粒子。所有粒子的合成均如实施例1中所述进行，除了所使用的peg连接物的mw或它们的相对量(即覆盖百分数)。表2指定了制备和研究的不同粒子。
322.表2：使用不同连接物尺寸和相对量合成的粒子
323.[0324][0325]
将表1中列出脑靶向粒子静脉内注射(200μl，30mg/ml)到雄性balb/c小鼠(每组n＝2)的尾静脉中。注射后8小时，将小鼠处死并进行灌注。然后提取脑并通过icp-ms分析以定量穿过bbb的金的量。
[0326]
图12a演示了胰岛素水平对粒子穿透到脑中的能力的影响。可以看到，用胰岛素以5％至10％的覆盖度包被gnp不足以将显著量的给药的粒子递送到脑中。然而，用胰岛素以15％或20％的覆盖度包被粒子导致了显著的脑穿透。令人吃惊的是，用更高浓度即50％的胰岛素包被的gnps表现出明显更低的在脑中的穿透。据推测这个结果可以归因于位阻干扰和结构约束。
[0327]
图12b演示了纳米递送系统中的抗体水平对其穿透到脑中的能力的影响。可以看到，在具有不同抗体水平的粒子中，具有20％抗体包被的gnps显示出最高的脑穿透，而具有更高抗体水平的粒子表现出更低的脑穿透。然而应该指出，尽管40％的抗体包被与20％的抗体包被相比导致gnps更低的穿透，但由于每个粒子的抗体浓度更高，使用这些粒子时穿
透到脑中的抗体的总量更高。
[0328]
图12c演示了连接物长度对粒子穿透到脑中的能力的影响。可以看到，将peg5000和peg3500分别用于胰岛素和ab偶联时获得最高的脑穿透。有趣的是，当具有相近尺寸的连接物用于胰岛素和ab偶联时(包括相对低mw和高mw的连接物，即mw＝458da、1000kda和3500kda peg连接物)，获得低的脑穿透。同样，当将peg1000和peg3500分别用于胰岛素和ab偶联时，获得了低的脑穿透。这些结果表明为了实现穿过bbb高效穿透到脑中，充当脑内化组成部分的胰岛素应该暴露到整个纳米递送系统的表面上(即应该存在于粒子外壳的外表面上)。由于胰岛素显著小于抗体(5kda相比于150kda)，因此为了保持暴露到纳米递送系统表面上并且不被抗体屏蔽，它必须偶联到比用于与抗体结合的连接物更长的连接物。
[0329]
有趣的是，当抗体和胰岛素分别偶联到5kda peg连接物和1kda peg连接物时，获得了显著的脑穿透(然而低于使用ins-peg5000-ab-peg3500获得的)。不希望受到理论或作用机制限制，这个结果可以通过5kda peg连接物的潜在折叠，使得它的实际长度(即端到端距离)更短，从而能够暴露出胰岛素组成部分来解释。
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尽管本发明已结合其特定实施方式进行了描述，但显然许多替代、修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，旨在涵盖落于随附的权利要求书的精神和广阔范围内所有此类替换、修改和改变。