包含六氧化四砷的用于预防或治疗冠状病毒感染症的药物组合物的制作方法

1.本发明涉及一种包含六氧化四砷的用于预防或治疗冠状病毒感染症的组合物。


背景技术：

2.冠状病毒是一种rna病毒，其宿主范围较广，如人类、鸟类、啮齿类以及哺乳类等，基因组的大小约为30kb，是所有rna病毒中最大的病毒。之所以将其命名为冠状病毒，是因为病毒表面的蛋白质突起类似于冠状物(corona)或王冠(crown)。
3.已知七种感染人并诱发疾病的冠状病毒，其中，四种(hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63以及hku1)也被称为社区获得性呼吸道感染(community-acquired respiratory hcov，car hcov)，在全世界任何地方，在温度和气候方面，往往比夏季和秋季，在冬季和春季频繁发生，并且已知这些为成人上呼吸道感染的10～30％的原因。此外，已知诱发2003年流行的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，sars)和2012年流行的中东呼吸综合征(middle east respiratory syndrome，mers)的冠状病毒(sars-cov和mers-cov)，其作为一种从动物传播到人的种类，通过感染下呼吸道来诱发严重的呼吸综合征。近年来，发现了一种新型冠状病毒，其被正式命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2)，并且由该毒株诱发的感染症被世界卫生组织(who)命名为2019冠状病毒病(coronavirus disease2019，covid-19)(在韩国命名为韩文名称
“‑
19”和其缩写
“‑
19”)。
4.如同sars和mers冠状病毒，sars-cov-2是一种源自蝙蝠的β冠状病毒系统，经分析基因碱基序列的结果，证实了它与源自蝙蝠的相似冠状病毒的同源性最高(89.1％)。covid-19主要通过呼吸道感染，在几乎没有症状的感染初期表现出传染性强的特征，感染后经过咽痛、高烧、咳嗽、呼吸困难等的症状，发展为肺炎。随着covid-19在全球范围内扩散，世界卫生组织(who)于2020年3月11日宣布该疾病为大流行病(pandemic)，并且截至2020年5月，全球covid-19患者数约达470万例，死亡数约30万例，随着covid-19急速扩散，迫切需要开发一种能够治疗或预防covid-19的治疗剂或疫苗。
5.因此，本发明人们对能够治疗包括covid-19在内的冠状病毒感染症的治疗剂进行深入研究的结果，确认了六氧化四砷(as4o6)对冠状病毒感染症具有优异的治疗效果，从而完成了本发明。
6.作为现有技术文献，韩国授权专利第272835号公开了六氧化四砷(as4o6)在对子宫癌、膀胱癌、肺癌、上颌窦癌以及肾癌等的晚期癌症患者进行给药时，具有优异的抗癌治疗效果，但是对于冠状病毒感染症的治疗效果则完全没有公开。
7.中国公开专利第101433548号公开了二硫化二砷(as2s2)、三硫化二砷(as2s3)、四硫化四砷(as4s4)以及三氧化二砷(as2o3)等砷化合物能够用于抗病毒药物的制造，并且作为具体的实施例，公开了混合有二硫化二砷(as2s2)、硫化汞(hgs)、牛黄、羚羊角粉、珍珠、黄
cov-2)的感染引起的2019冠状病毒病(covid-19)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)的感染引起的严重急性呼吸综合征(sars)以及中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)的感染引起的中东呼吸综合征(mers)组成的组，更优选地，可以为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的感染引起的2019冠状病毒病(covid-19)。
26.本发明的作为有效成分的六氧化四砷，尤其对诱发2019冠状病毒病的sars-cov-2表现出显著的抗病毒活性，从而在2019冠状病毒病的治疗中表现出优异的效果。与其他如二硫化二砷(as2s2)或三氧化二砷(as2o3)的砷化合物相比，本发明的六氧化四砷对sars-cov-2具有更优异的增殖抑制活性。
27.根据感染sars-cov-2的vero e6细胞的转录组分析结果，确认了六氧化四砷通过如下机理对sars-cov-2病毒具有抗病毒效果：增加作为抑制细胞增殖并且防御由病毒增殖引起的细胞凋亡的基因的bag3、hspa1b、cryab、hmox1、hsph1等的表达以及作为缓解细胞内砷毒性的基因的zfand2a的表达，抑制作为诱导由病毒感染引起的炎症性反应的细胞因子基因的csf1、pdgfa、pdgfb、cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl8、cxcl10、ccl2、ccl20等的表达。
28.本发明的药物组合物可以分别通过常规方法被剂型化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服剂型、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形态而使用。所述药物组合物中可以包含的载体、赋形剂以及稀释剂可以列举乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁以及矿物油。在进行制剂化时，使用常规使用的填充剂、膨胀剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂以及表面活性剂等稀释剂或赋形剂而制备。用于口服的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂在本发明的作为有效成分的六氧化四砷中至少混合一种以上的如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等赋形剂而制备。此外，除了简单的赋形剂之外，也使用硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。作为用于口服的液状制剂相当于悬浮剂、内溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除了经常使用的作为简单稀释剂的水、液体石蜡之外，还可以包括多种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。作为非口服给药的制剂，包括无菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制剂、栓剂。作为非水性溶剂、悬浮剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油这样的植物性油；油酸乙酯等可注射的酯等。作为栓剂的基材，可以使用witepsol、macrogol、吐温(tween)61、可可脂、三月桂酸甘油酯、甘油明胶等。
29.本发明的六氧化四砷的给药量将根据受治对象的年龄、性别、体重以及所治疗的特定疾病或病理状态、疾病或病理状况的严重程度、给药途径以及开药者的判断而有所不同。基于这种因素的给药量的确定在本领域普通技术人员的水平范围内，通常的给药量在0.01mg/kg/天～约100mg/kg/天的范围。更优选的给药量在0.05mg/kg/天～10mg/kg/天的范围，进一步更优选的给药量在0.05mg/kg/天～1mg/kg/天的范围。可以一天给药一次，也可以分成数次给药。从任何方面来说，所述给药量不是为了限定本发明的范围。
30.本发明的药物组合物可以通过多种途径给药。给药的所有方式是可以预想的，例如，可以通过口服、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内粘膜或脑血管内注射来进行给药。
31.此外，根据另一方面，本发明提供一种用于预防或改善冠状病毒感染症的保健功能食品组合物。
32.在本说明书中，“保健功能食品”意指使用具有对人体有用的功能性的原料或成分
而进行制造和加工的食品，并且本说明书的所述“功能”意指对于人体的结构和功能，调节营养素或者以生理学的作用，对保健用途有用的效果。
33.所述保健功能食品的种类没有特别限制，其形态可以为选自由粉末、颗粒、片剂、胶囊、糖果、口香糖、果冻以及饮料组成的组中的形式，包括常规意义上的所有的保健功能食品。所述保健功能食品还可以包括食品学上可接受的食品辅助添加剂。可用于本发明的食品学上可接受的食品辅助添加剂包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糊精、环糊精这样的糖类，以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等的糖醇这样的天然碳水化合物；索马甜、甜叶菊提取物等天然甜味剂；糖精、阿斯巴甜等合成甜味剂；着色剂、果胶酸或其盐、海藻酸或其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸化剂等，但不限于此。有效成分的混合量可以根据使用目的适当地确定，并且相对于100重量份的保健功能食品组合物，以10重量份以下的量添加，优选以5重量份以下的量添加。但是，在出于健康目的而长期摄取的情况下，可以为低于所述范围的量。
34.发明效果
35.本发明的用于预防或治疗冠状病毒感染症的组合物对冠状病毒具有优异的抑制活性，从而能够有效地应用于covid-19等的冠状病毒感染症的治疗。
附图说明
36.图1的(a)为示出通过六氧化四砷的处理来抑制由sars-cov-2感染引起的细胞病变效应的图，图1的(b)为示出通过阴性对照组的未经试验物质处理来sars-cov增殖而细胞病变的图。
37.图2为示出利用热图(heat map)，对感染sars-cov-2的vero e6细胞中经六氧化四砷处理而改变的转录组进行聚类(clustering)分析结果的图。
38.图3为示出在感染sars-cov-2的vero e6细胞中经六氧化四砷处理的基因本体(gene ontology)分析结果的图。
39.图4为示出利用转录组分析，对感染sars-cov-2的vero e6细胞中经六氧化四砷处理而增加的基因(bag3、hspa1b、cryab、hmox1、zfand2a、hsph1)表达分析结果的图。
40.图5为示出利用转录组分析，对感染sars-cov-2的vero e6细胞中经六氧化四砷处理而减少的细胞因子基因(csf1、pdgfa、pdgfb、cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl8、cxcl10、ccl2、ccl20)表达分析结果的图。
41.图6为示出利用rt-pct，对感染sars-cov-2的vero e6细胞中经六氧化四砷处理而增加的基因(bag3、zfand2a、cryab、hsph1、hmox1)表达分析结果的图。
42.图7为示出利用rt-pct，对vero e6细胞中经六氧化四砷处理而剂量依赖性地增加的基因(bag3、zfand2a、cryab、hsph1、hmox1)表达分析结果的图。
具体实施方式
43.以下，对本发明的优选实施例进行详细说明。但是，本发明并不限定于此处说明的实施例，也可以具体化为其他方式。是为了使得在此介绍的内容非常完整，向本领域技术人员充分地传递本发明的思想而提供的。
44.《实施例1：对冠状病毒的抗病毒活性的确认》
45.为了确认本发明的六氧化四砷化合物对冠状病毒的影响，实施了比较感染细胞的生存率的细胞病变效应(cytopathic effect，cpe)分析。
46.实施例1-1：vero细胞的培养
47.在96孔(well)板中，以1
×
104个细胞/孔的密度分装来源于非洲绿猴肾细胞的vero e6细胞，并且在dmem(dulbecco’s modified eagle’s medium)培养基中添加葡萄糖、10％的fbs(fetal bovine serum)、1％的ps(penicillin+streptomycin)、1％的l-谷氨酰胺(glutamin)200mm、1％的丙酮酸钠(sodium pyruvate)100mm以及非必需氨基酸(nonessential amino acids)的培养液中培养1天，然后用pbs溶液清洗。
48.实施例1-2：细胞毒性的确认试验
49.为了观察细胞毒性，进行了mtt实验。mtt实验是一种测定细胞毒性或生存率的实验方法，是根据脱氢酶的作用，使黄色水溶性底物mtt四唑盐(mtt tetrazolium)渗入到细胞内，在线粒体中还原为呈红紫色的非水溶性甲臜反应产物(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)的线粒体的能力的检测法。
50.具体而言，将所述培养的vero e6细胞分装于96孔板中后，将溶解于蒸馏水的1％(w/v)的六氧化四砷(as4o6)溶液用dmem培养液稀释1000～20000倍(25.27μm～1.26μm的as4o6)，并按照每个稀释倍数分别处理2个孔，并培养48小时。之后，去除上清液，每孔加入5mg/ml的mtt溶液20μl，然后在37℃孵育4小时以形成甲臜晶体。在孵育之后，再次去除上清液，向所有孔中分别添加100μl的dmso并混合以完全溶解甲臜晶体。在室温放置15分钟，以使所有晶体完全溶解，并在波长570nm(a
570nm
)处，用微型板仪器测定了吸光度。
51.mtt实验结果，确认了直至1％(w/v)的六氧化四砷(as4o6)溶液的1000倍的稀释浓度为止，存在细胞毒性引起的细胞凋亡问题，但稀释2000倍以上时的六氧化四砷的浓度开始，细胞不会凋亡而生存，从而确认了稀释2000倍以上时的浓度为能够用于试验的适当浓度。
52.实施例1-3：抗病毒功效的评价试验
53.将实施例1-1中培养的vero e6细胞以约2～5
×
105个细胞的密度分装于8孔板中，然后由韩国疾病管理本部提供的诱发covid-19的冠状病毒sars-cov-2以10
1.5
～10
2.5
tcid
50
/ml的浓度分别接种100μl后，在co2培养箱中感染冠状病毒1小时。然后，将培养液用pbs溶液清洗后，将1％(w/v)的六氧化四砷(as4o6)溶液用dmem培养液稀释2000倍、3000倍以及4000倍(12.64μm、8.42μm以及6.32μm)，分别添加200μl。作为阴性对照组，添加了未包含试验物质的dmem培养液。之后，在培养箱中培养3天后，确认了细胞病变效应(cytopathic effect，cpe)，并确认了试验物质的有效浓度。cpe示出由病毒感染引起的细胞形态的变化(morphological change)，已知细胞形态的退行性变化与病毒感染有关。
54.抗病毒功效的评价结果，如下证实了本发明的六氧化四砷对于sars-cov-2增殖的抑制作用优异。
55.[表1]
sample preparation kit，illumina，美国)制作了文库。首先，利用附有oligo-dt的磁珠(oligo-dt-attached magnetic beads)纯化包含poly-a的mrna分子，并将切割的rna片段利用逆转录酶和随机引物，逆转录为与第一链(first-strand)互补的dna(complementary dna，cdna)。之后，利用dna聚合酶i和rnaseh(invitrogen)合成第二链(second-strand)cdna。所述cdna片段通过添加单个a碱基和接头(adapters)连接(ligation)进行了末端修复过程(end repair process)。通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)纯化和浓缩所述产物，从而制备了最终的cdna文库。
[0064]
实施例2-2：rna测序
[0065]
利用所述cdna文库和illumina仪器(illumina hiseq 2000sequencer，illumina)进行了双端测序(paired-end sequencing)。从总共15个样本中生成了68万读长，并利用fastqc和trimmomatic(0.32版本)过滤了所述双端读长。之后，将干净读长(clean reads)利用hisat2(2.0.5版本)-cufflinks-cuffmerge-cuffdiff(2.2.1版本)管道，根据tuxedo协议对齐并评价了数目。将所述读长映射到从ensembl(www.ensembl.org/chlorocebus_sabaeus/)下载的非洲绿猴参考基因组(reference genome：chlsab1.1)。rna测序结果，共检测到27085个单基因。
[0066]
实施例2-3：热图(heat map)聚类分析
[0067]
对每个试验组进行了转录组分析，在培养感染sars-cov-2病毒的vero e6细胞的阴性对照组(sars-cov-2(36小时)或者sars-cov-2(72小时))和在感染sars-cov-2病毒的vero e6细胞中处理六氧化四砷并进行培养的六氧化四砷处理组(sars-cov-2+as4o6(36小时)和sars-cov-2+as4o6(72小时))的转录组中，与未对vero e6细胞作任何处理的正常对照组(control)转录组相比，统计学上的q值(q value)为0.05以下，并且在基因表达上具有2倍以上的差异的具有相似功能的基因利用热图(heat map)进行了聚类(clustering)。其结果，根据基因功能的相似性，共分类为7组，并分析出第1组有147个基因、第2组有209个基因、第3组有219个基因、第4组有106个基因、第5组有39个基因、第6组有34个基因、第7组有67个基因(图2)。
[0068]
实施例2-4：对于感染sars-cov-2病毒的vero e6细胞中的反应基因的基因本体(gene ontology)分析结果
[0069]
基于所述实施例2-3的聚类(clustering)，对相似的基因进行了基因本体(gene ontology term，go term)分析。对于图2中分类的每个组的上位基因本体(go term)进行分析的结果，确认了与缺氧(hypoxia)、胆固醇自稳(cholesterol homeostasis)、通过nfkb发出tnf-α信号(tnf-a signaling via nfkb)、活性氧物种通路(reactive oxygen species pathway)、炎症反应(inflammatory response)、发出il6-jak-stat3信号(il6-jak-stat3signaling)以及干扰素α反应(interferon alpha response)相关的go基因在感染sars-cov-2时受六氧化四砷的调节(图3)。
[0070]
实施例2-5：在感染sars-cov-2病毒的vero e6细胞中的代表性反应基因的表达模式分析
[0071]
通过转录组分析和基因本体(go term)分析，确认了在感染sars-cov-2时，六氧化四砷的处理能够调节对病毒感染反应的基因，从而确认了对病毒感染反应的代表性基因的表达模式。其结果，增加了当感染病毒时，因病毒抑制细胞凋亡的bag3、hspa1b、cryab、
hmox1、hsph1基因的表达以及减轻细胞内砷毒性的zfand2a基因的表达(图4)，并且显著降低了当感染病毒时，诱导炎症反应的csf1、pdgfa、pdgfb、cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl8、cxcl10、ccl2、ccl20细胞因子基因的表达(图5)。
[0072]
实施例2-6：利用逆转录聚合酶链式反应(reversetranscription polymerase chainreaction，rt-pct)的验证分析
[0073]
为了确认对于通过rna测序(rna sequencing)鉴定的基因的再现性，使用了同样用于转录组分析的rna样品，通过rt-pcr，对bag3、cryab、hsph1、hmox1以及zfand2a基因进行了验证。
[0074]
具体而言，利用下表2中的引物、使用逆转录酶合成的互补dna(complementary dna)以及pcr仪器(takara tp350、takara)进行了rt-pcr。
[0075]
[表2]
[0076][0077]
将共1μg的rna逆转录为cdna，用无菌蒸馏水稀释4倍，然后将所述cdna 2μl、taq聚合酶(taq polymerase)1μl、10x缓冲液2μl、每种引物2μl以及无菌蒸馏水11μl混合，从而制造了共20μl的反应溶液。rt-pctr反应以在95℃5分钟后，以在58℃30秒和72℃10分钟的循环进行了30次。以18s rrna的表达水平，进行了靶基因表达的标准化。
[0078]
其结果，确认了与转录组分析相同地，增加了抑制病毒诱导的细胞凋亡和病毒增殖的细胞保护作用(cytoprotection)有关的bag3、cryab、hsph1以及hmox1基因的表达以以及减轻细胞内砷毒性的zfand2a基因的表达(图6)。此外，在未感染sars-cov-2病毒的vero e6细胞中，六氧化四砷以剂量依赖性地增加了所述基因的表达(图7)。通过这样的结果，确认了六氧化四砷通过抑制病毒增殖，并且防御由病毒增殖引起的细胞凋亡的基因的表达，并且抑制由病毒感染引起的炎症反应的细胞因子基因表达的机理，对sars-cov-2病毒具有抗病毒效果。