条件性地表达重组受体的工程化T细胞、相关多核苷酸和方法与流程

本公开文本涉及含有编码重组受体或其一部分的经修饰的t细胞刺激相关基因座的工程化t细胞。在一些方面，编码所述重组受体或其一部分的核酸序列可操作地连接至所述t细胞刺激相关基因座的内源转录调节元件，其在一些情况下通过靶向整合进行工程化。在一些方面，所述工程化细胞条件性地表达所述重组受体，如在t细胞中刺激或激活信号后。还公开了细胞组合物、用于将细胞工程化的核酸、以及用于产生所述工程化细胞的方法和制品。在一些实施方案中，可以将所述工程化细胞与细胞疗法结合使用，包括与包含所述工程化细胞的过继转移的癌症免疫疗法结合使用。

背景技术：

1、利用重组受体(如嵌合抗原受体(car)或重组t细胞受体(tcr))识别与疾病相关的抗原的过继细胞疗法代表了用于治疗癌症和其他疾病的有吸引力的治疗方式。需要改善的策略来工程化t细胞以表达重组受体，如用于在过继免疫疗法中，例如在治疗癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病中使用。提供了用于在满足此类需求的方法中使用的方法、细胞、组合物和试剂盒。

技术实现思路

1、本文提供了工程化t细胞，其包含含有编码重组受体或其一部分的转基因的经修饰的t细胞刺激相关基因座，其中所述转基因与所述t细胞刺激相关基因座的内源转录调节元件可操作地连接，其中所述内源转录调节元件在t细胞中刺激或激活信号后诱导或上调所述可操作地连接的转基因的表达。

2、在任何实施方案的一些实施方案中，所述内源转录调节元件是内源t细胞刺激相关基因座的启动子。在任何实施方案的一些实施方案中，编码所述重组受体或其一部分的转基因存在于所述启动子的下游。

3、在任何实施方案的一些实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达是可诱导的，并且在所述细胞中所述刺激或激活信号之后被诱导。在任何实施方案的一些实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约6小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约12小时内被上调或诱导。在任何实施方案的一些实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约24小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约36小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约48小时内被上调或诱导。

4、在任何实施方案的一些实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达不是永久性的和/或可以随着时间的推移或在不存在所述t细胞的刺激或激活信号的情况下降低。在任何实施方案的一些实施方案中，在表达的上调或诱导之后或在所述t细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达被降低或下调。在任何实施方案的一些实施方案中，在表达的上调或诱导之后或在所述t细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达被降低或下调大于或大于约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。在任何实施方案的一些实施方案中，在表达的上调或诱导之后，在所述t细胞中的所述刺激或激活信号之后为或约1、2、3、4、5、6、7或8天或更长时间之后，所述可操作地连接的转基因的表达被降低或下调。在任何实施方案的一些实施方案中，在所述t细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后小于或小于约6、12、18、24、36或48小时内，所述可操作地连接的转基因的表达被降低或下调。

5、在任何实施方案的一些实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达能够在所述t细胞中进一步刺激或激活信号之后再次被诱导或上调。在任何实施方案的一些实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述进一步刺激或激活信号之后小于或小于约6、12、18、24、36或48小时内被上调或诱导。在任何实施方案的一些实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达是可诱导的，并且在所述细胞中所述刺激或激活信号之后被诱导。在任何实施方案的一些实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述进一步刺激或激活信号之后小于或小于约6小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述进一步刺激或激活信号之后小于或小于约12小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述进一步刺激或激活信号之后小于或小于约24小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述进一步刺激或激活信号之后小于或小于约36小时内被上调或诱导。在一些任何实施方案中，在所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述进一步刺激或激活信号之后小于或小于约48小时内被上调或诱导。

6、在任何实施方案的一些实施方案中，在所述t细胞中所述刺激或激活信号之后，来自内源t细胞刺激相关基因座的开放阅读框的翻译产物在所述细胞中不表达，或者所述内源t细胞刺激相关基因座的功能性内源基因产物不表达。在任何实施方案的一些实施方案中，所述经修饰的t细胞刺激相关基因座包含所述内源t细胞刺激相关基因座的开放阅读框中的缺失、插入、移码突变或无义突变。

7、在任何实施方案的一些实施方案中，所述内源t细胞刺激相关基因座选自pdcd1、cd69、nur77、foxp3和hla-dr基因座。在任何实施方案的一些实施方案中，所述内源t细胞刺激相关基因座是pdcd1基因座。在一些任何实施方案中，所述内源t细胞刺激相关基因座是cd69基因座。在一些任何实施方案中，所述内源t细胞刺激相关基因座是nur77基因座。在任何实施方案的一些实施方案中，所述内源t细胞刺激相关基因座是foxp3基因座。在任何实施方案的一些实施方案中，所述内源t细胞刺激相关基因座是hla-dr基因座。在任何实施方案的一些实施方案中，所述内源转录调节元件包括由在所述刺激或激活信号之后被激活的转录因子识别的一个或多个应答元件。

8、在一些实施方案中，所述重组受体或其部分能够诱导或传递所述t细胞中的所述刺激或激活信号。

9、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体包含细胞内区域，所述细胞内区域含有t细胞受体(tcr)复合物的组分的细胞内信号传导结构域，并且所述t细胞中的所述刺激或激活信号包括通过存在于所述重组受体中的细胞内信号传导结构域的信号。在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体包含细胞内区域，所述细胞内区域含有细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸激活基序(itam)，并且所述t细胞中的所述刺激或激活信号包括通过存在于所述重组受体中的细胞内信号传导结构域的信号。在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体(例如car)的细胞内信号传导结构域可以包含cd3ζ信号传导结构域，并且所述t细胞中的所述刺激或激活信号包括通过存在于所述重组受体(例如car)中的细胞内信号传导结构域的信号。

10、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体是tcr并且能够募集所述t细胞复合物的组分以诱导或刺激所述t细胞中的激活信号。

11、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体包含胞外区域，所述胞外区域含有能够结合或识别药剂(例如靶抗原)的结合结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，在所述重组受体结合或识别所述药剂后，在所述t细胞中诱导了刺激或激活信号。

12、在任何实施方案的一些实施方案中，所述药剂是靶抗原。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原是重组蛋白或在细胞表面上表达的抗原。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，为疾病、障碍或病症的细胞或组织所特有，或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在任何实施方案的一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3、b7-h6、碳酸酐酶9(ca9，也称为caix或g250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1b(ctag，也称为ny-eso-1和lage-2)、癌胚抗原(cea)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白a2、c-c基序趋化因子配体1(ccl-1)、cd19、cd20、cd22、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd123、cd133、cd138、cd171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)、表皮生长因子蛋白(egfr)、表皮生长因子受体iii型突变体(egfr viii)、上皮糖蛋白2(epg-2)、上皮糖蛋白40(epg-40)、肝配蛋白b2、肝配蛋白受体a2(epha2)、雌激素受体、fc受体样蛋白5(fcrl5；也称为fc受体同源物5或fcrh5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿achr)、叶酸结合蛋白(fbp)、叶酸受体α、神经节苷脂gd2、o-乙酰化gd2(ogd2)、神经节苷脂gd3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、g蛋白偶联受体c类5族成员d(gprc5d)、her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-b2)、her3(erb-b3)、her4(erb-b4)、erbb二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原a1(hla-a1)、人白细胞抗原a2(hla-a2)、il-22受体α(il-22rα)、il-13受体α2(il-13rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、l1细胞粘附分子(l1-cam)、l1-cam的ce7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员a(lrrc8a)、lewis y、黑色素瘤相关抗原(mage)-a1、mage-a3、mage-a6、mage-a10、间皮素(msln)、c-met、鼠类巨细胞病毒(cmv)、粘蛋白1(muc1)、muc16、自然杀伤细胞2族成员d(nkg2d)配体、黑色素a(mart-1)、神经细胞粘附分子(ncam)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(prame)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(tpbg，也称为5t4)、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、酪氨酸酶相关蛋白1(trp1，也称为tyrp1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(trp2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或dct)、血管内皮生长因子受体(vegfr)、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)、肾母细胞瘤1(wt-1)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由hiv、hcv、hbv或其他病原体表达的分子。

13、在任何实施方案的一些实施方案中，所述药剂是对所述重组受体的胞外结构域具有特异性的抗独特型抗体。

14、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(car)。在任何实施方案的一些实施方案中，所述car包含含有结合结构域的胞外区域、跨膜结构域和细胞内区域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述胞外区域还包含间隔子。在任何实施方案的一些实施方案中，所述间隔子可操作地连接在所述结合结构域与所述跨膜结构域之间。在任何实施方案的一些实施方案中，所述胞外区域包含结合结构域，所述结合结构域是或包含抗体或其抗原结合片段，例如单链可变片段(scfv)。

15、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体(例如car)的细胞内区域包含细胞内信号传导结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包含cd3链的细胞内信号传导结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包含cd3-zeta(cd3ζ)链或其信号传导部分。在任何实施方案的一些实施方案中，所述细胞内区域包含一个或多个共刺激信号传导结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述细胞内区域包含cd3-zeta(cd3ζ)链或其信号传导部分以及一个或多个共刺激信号传导区域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个共刺激信号传导结构域包含cd28、4-1bb或icos或其信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述共刺激信号传导区域包含4-1bb的细胞内信号传导结构域。

16、在任何实施方案的一些实施方案中，所述经修饰的t细胞刺激相关基因座编码作为car的重组受体，其中所述car从其n至c末端按顺序包含：所述胞外结合结构域、所述间隔子、所述跨膜结构域和所述细胞内区域。

17、在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因按顺序包含编码以下的核苷酸序列：胞外结合结构域，如scfv；间隔子，如包含来自人免疫球蛋白铰链(如来自igg1、igg2或igg4)或其修饰形式的序列，如还包含ch2区和/或ch3区；和跨膜结构域，如来自人cd28；共刺激信号传导结构域，如来自人4-1bb；以及细胞内信号传导结构域，如cd3ζ链或其一部分。在任何实施方案的一些实施方案中，所述经修饰的t细胞刺激相关基因座按顺序包含编码以下的核苷酸序列：胞外结合结构域，如scfv；间隔子，如包含来自人免疫球蛋白铰链(如来自igg1、igg2或igg4)或其修饰形式的序列，如还包含ch2区和/或ch3区；和跨膜结构域，如来自人cd28；共刺激信号传导结构域，如来自人4-1bb；以及细胞内信号传导结构域，如cd3ζ链或其一部分。

18、在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因编码所述重组受体，如所述重组受体的完整或完全序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体是单链多肽。例如，所述重组受体可以是嵌合抗原受体(car)，并且所述转基因编码所述嵌合抗原受体(car)，例如，所述car的完整或完全序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体是多链多肽，如双链多肽。例如，所述重组受体可以是含有α链和β链的t细胞受体(tcr)，并且所述转基因编码所述tcr的α链和β链，如所述tcr的α和β链的全部或完整序列。在这样的例子中，所述tcr的单独的链可以通过多顺反子元件(如核糖体跳跃元件(例如t2a或p2a))或ires来隔开。

19、在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因编码所述重组受体的一部分。在实施方案中，由所述转基因编码的重组受体的部分在其部分由所述t细胞表达时能够促进或允许所述全长重组受体的相同或相似(即其保留)的功能活性(例如抗原结合和受体信号传导活性)，如在所述t细胞中所述刺激或激活信号之后。在任何实施方案的一些实施方案中，当由所述t细胞表达时，所述重组受体的所述部分可以形成完整重组受体或其部分序列，所述完整受体或其部分序列保留所述重组受体的全长形式的功能活性(例如抗原结合和受体信号传导活性)。在任何实施方案的一些实施方案中，当由所述t细胞表达时，所述重组受体的所述部分能够促进或允许所述重组受体的全部活性的至少75％、85％、90％或100％。在一些例子中，当由所述t细胞表达时，由所述转基因编码的重组受体的所述部分能够与也由所述工程化t细胞表达的重组受体的另一组分(例如所述重组受体的另一条链)形成完整功能性受体。在其他例子中，重组受体可以是单链多肽(例如car)，并且其部分在由所述t细胞表达时可以包含对于所述重组受体的功能活性所需的所述重组受体的连续氨基酸序列。在这样的实施方案中，所述重组受体的其部分可以具有重组受体的连续氨基酸序列，所述重组受体的连续氨基酸序列包含重组受体长度的至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约92％、至少约95％或至少约97％的序列长度，并且编码保留所述重组受体的活性(例如抗原结合和受体信号传导活性)的部分重组受体。

20、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体的其部分是所述重组受体的多肽链，例如，在所述重组受体由多条链组成(例如，含有α链和β链的tcr或多链car)的实施方案中。例如，所述重组受体的另一条链由所述工程化t细胞进一步单独表达。在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体包含两条单独的多肽链，其中由所述转基因编码的所述重组受体的部分是所述重组受体的一条链，并且所述工程化t细胞还表达所述重组受体的另一条链。在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体的另一条链由第二转基因编码，所述第二转基因单独地包含在所述t细胞中并且能够由所述t细胞表达。

21、在任何实施方案的一些实施方案中，所述嵌合受体是car，所述car是多链car。在一些例子中，所述转基因编码所述多链car，如所述多链car的完整或整个序列，例如具有两条链的多链car的第一链和第二链。在这样的例子中，所述多链car的单独的链可以通过多顺反子元件(如核糖体跳跃元件(例如t2a或p2a))或ires来隔开。在其他例子中，所述转基因编码所述多链car的一条链，并且所述多链car的另一条链由所述工程化细胞单独编码，例如通过第二转基因编码。在所提供的任何实施方案的一些实施方案中，所述工程化t细胞能够表达保留或展现抗原结合和受体信号传导活性的完全功能性重组多链car，如在所述t细胞中的刺激或激活信号之后。

22、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体是重组t细胞受体(tcr)。在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组tcr包含α(tcrα)链和β(tcrβ)链，并且所述转基因包含编码所述tcrα链的核酸序列和/或编码所述tcrβ链的核酸序列。在一些例子中，所述转基因编码所述tcr，如包含所述tcrα和所述tcrβ链的tcr的完整或整个序列。在这样的例子中，所述tcr的单独的链可以通过多顺反子元件(如核糖体跳跃元件(例如t2a或p2a))或ires来隔开。在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因编码所述tcrα链或所述tcrβ链中的一个，并且所述tcrα链或所述tcrβ链中的另一个由所述工程化细胞单独编码，例如由第二转基因编码。在所提供的任何实施方案的一些实施方案中，所述工程化t细胞能够表达保留或展现抗原结合和受体信号传导活性的完全功能性重组tcr，如在所述t细胞中的刺激或激活信号之后。

23、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体是包含tcrα和tcrβ链的tcr。在任何实施方案的一些实施方案中，所述tcrα链包含含有一个或多个引入的半胱氨酸残基的恒定(cα)区和/或所述tcrβ链包含含有一个或多个引入的半胱氨酸残基的cβ区，其中所述一个或多个引入的半胱氨酸残基能够在所述α链与所述β链之间形成一个或多个非天然二硫桥。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个引入的半胱氨酸残基包括用半胱氨酸残基替代非半胱氨酸残基。在任何实施方案的一些实施方案中，所述cα区包含在对应于位置48的位置处的半胱氨酸，其中编号如seq id no:92所示；和/或所述cβ区包含在对应于位置57的位置处的半胱氨酸，其中编号如seq id no:96所示。

24、在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因包含编码至少一种另外的蛋白质的核苷酸序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述至少一种另外的蛋白质是替代标记物，如用于监测所述工程化t细胞的重组受体表达或充当对于所述工程化t细胞的重组受体表达的替代物的标记物。在任何实施方案的一些实施方案中，所述替代标记物是截短的受体。在任何实施方案的一些实施方案中，所述截短的受体缺少细胞内信号传导结构域和/或在与其配体结合时不能介导细胞内信号传导。

25、在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因还包含一个或多个多顺反子元件。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个多顺反子元件包含编码选自t2a、p2a、e2a或f2a的核糖体跳跃元件或内部核糖体进入位点(ires)的序列。

26、在任何实施方案的一些实施方案中，所述多顺反子元件定位于编码所述car的核苷酸序列与编码所述至少一种另外的蛋白质的核苷酸序列之间。在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体是重组tcr，并且所述多顺反子元件定位于编码所述tcrα的核苷酸序列与编码所述tcrβ的核苷酸序列之间。在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体是多链car，并且所述多顺反子元件定位于编码所述多链car的一条链的核苷酸序列与编码所述多链car的另一条链的核苷酸序列之间。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个多顺反子元件在编码所述重组受体的核苷酸序列的上游。

27、在任何实施方案的一些实施方案中，所述经修饰的t细胞刺激相关基因座是通过将编码所述重组受体的转基因整合至所述内源t细胞刺激相关基因座中产生的，如通过使用同源定向修复的基因编辑来产生。在任何实施方案的一些实施方案中，通过以下方式进行整合：a)在内源t细胞刺激相关基因座处或附近的一个或多个靶位点处诱导基因破坏；以及b)引入多核苷酸以用于同源定向修复(hdr)。

28、在任何实施方案的一些实施方案中，将编码所述重组受体的转基因整合在所述t细胞刺激相关基因座中的至少一个靶位点处或附近。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过特异性结合至、识别或杂交至所述靶位点的锌指核酸酶(zfn)、tal效应物核酸酶(talen)或crispr-cas9组合实现的。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过crispr-cas9组合实现的，并且所述crispr-cas9组合包含具有与所述至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导rna(grna)。在任何实施方案的一些实施方案中，所述crispr-cas9组合是包含所述grna和cas9蛋白的核糖核蛋白(rnp)复合物。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过经由电穿孔引入多个t细胞中的rnp实现的。

29、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是pdcd1。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过包含grna的crispr-cas9组合实现的，并且所述grna具有与pdcd1基因中的靶位点互补的靶向结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:75和104-109中任一个所示的序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:75所示的序列。

30、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是cd69。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过包含grna的crispr-cas9组合实现的，并且所述grna具有与cd69基因中的靶位点互补的靶向结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:116-121中任一个所示的序列。

31、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是nur77。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过包含grna的crispr-cas9组合实现的，并且所述grna具有与nur77基因中的靶位点互补的靶向结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:122-127和134-136所示的序列。

32、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是foxp3。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过包含grna的crispr-cas9组合实现的，并且所述grna具有与foxp3基因中的靶位点互补的靶向结构域。

33、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是hla-dr基因座。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过包含grna的crispr-cas9组合实现的，并且所述grna具有与hla-dr基因中的靶位点互补的靶向结构域。

34、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞还包含内源t细胞受体α恒定区(trac)基因和/或内源t细胞受体β恒定区(trbc)基因处的基因破坏。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞还包含内源t细胞受体α恒定区(trac)基因处的基因破坏。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞还包含内源t细胞受体α恒定区(trbc)基因处的基因破坏。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞还包含内源t细胞受体α恒定区(trac)基因和内源t细胞受体β恒定区(trbc)基因处的基因破坏。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过特异性地结合至、识别或杂交至至少一个靶位点(如所述trac基因或trbc基因(trbc1或trbc2基因)内的至少一个靶位点)的锌指核酸酶(zfn)、tal效应物核酸酶(talen)或crispr-cas9组合实现的。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过crispr-cas9组合实现的，并且所述crispr-cas9组合包含具有与所述至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导rna(grna)。在任何实施方案的一些实施方案中，所述crispr-cas9组合是包含所述grna和cas9蛋白的核糖核蛋白(rnp)复合物。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过经由电穿孔引入多个t细胞中的rnp实现的。

35、在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过包含grna的crispr-cas9组合实现的，并且所述grna具有与所述trac基因或trbc基因(trbc1或trbc2基因)内的至少一个靶位点互补的靶向结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna具有与trac基因中的靶位点互补的靶向结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:77和188-218中任一个所示的序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:77所示的序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna具有与trbc基因中的靶位点互补的靶向结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:219-276中任一个所示的序列。

36、在任何实施方案的一些实施方案中，与包含存在于所述t细胞的基因组中的不同位置处或存在于所述t细胞的基因组中的随机位置处的编码相同重组受体的转基因的工程化t细胞相比，在所述t细胞中不存在刺激或激活信号的情况下，通过编码的重组受体的细胞内信号传导结构域的信号传导活性降低大于或大于约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或更多。

37、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞是cd8+t细胞或cd4+t细胞或其亚型。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞是源自受试者的原代t细胞。在任何实施方案的一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述t细胞是源自人受试者的原代t细胞。在一些实施方案中，所述t细胞是原代人t细胞。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞源自多潜能或多能细胞。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞源自ipsc。

38、还提供了含有多种任何所提供的工程化细胞的组合物。在任何实施方案的一些实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约6、12、18、24、36或48小时内在所述组合物中的一个或多个细胞中被上调或诱导。在任何实施方案的一些中，在所述t细胞中的刺激或激活信号之后，在所述组合物中的细胞中表达所述可操作地连接的转基因的细胞的频率大于或大于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。在任何实施方案的一些实施方案中，在表达的上调或诱导之后或在所述t细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述组合物中的一个或多个细胞中被降低或下调。

39、在任何实施方案的一些实施方案中，在表达的上调或诱导之后或在所述t细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后，在组合物中的细胞中表达所述可操作地连接的转基因的细胞的频率降低大于或大于约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。在任何实施方案的一些实施方案中，在表达的上调或诱导之后，在所述t细胞中的所述刺激或激活信号之后为或约1、2、3、4、5、6、7或8天或更长时间之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述组合物中的一个或多个细胞中被降低或下调。

40、在任何实施方案的一些实施方案中，在所述t细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后小于或小于约6、12、18、24、36或48小时内，在所述组合物中的一个或多个细胞中所述可操作地连接的转基因的表达被降低或下调。在任何实施方案的一些实施方案中，在所述t细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后，在所述组合物中的细胞中表达所述重组受体的细胞的频率小于或小于约50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％或更少。

41、在任何实施方案的一些实施方案中，所述组合物包含cd4+t细胞和/或cd8+t细胞。在任何实施方案的一些实施方案中，所述组合物包含cd4+和cd8+t细胞，并且cd4+与cd8+t细胞的比率是从或从约1:3至3:1。在任何实施方案的一些实施方案中，1:1。

42、还提供了多核苷酸，所述多核苷酸包含(a)编码重组受体或其一部分的转基因，和(b)与所述转基因连接的一个或多个同源臂，其中所述一个或多个同源臂包含与t细胞中的内源t细胞刺激相关基因座的一个或多个区域同源的序列。

43、在任何实施方案的一些实施方案中，当所述重组受体由引入了所述多核苷酸的细胞表达时，所述重组受体或其一部分由含有编码所述重组受体或其一部分的转基因的经修饰的t细胞刺激相关基因座编码。在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因是对于t细胞的内源t细胞刺激相关基因座的开放阅读框而言外源的或异源的序列。

44、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞是原代人t细胞。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞是源自受试者的t细胞。在任何实施方案的一些实施方案中，所述受试者是人。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞是人t细胞。

45、在任何实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个同源臂包含5'同源臂和/或3'同源臂。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5’同源臂和所述3'同源臂包含与靶位点周围的核酸序列同源的核酸序列，其中所述靶位点在所述t细胞刺激相关基因座内。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶位点位于所述t细胞刺激相关基因座的内源转录调节元件的下游。

46、在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸包含结构[5'同源臂]-[转基因]-[3'同源臂]。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与所述至少一个靶位点周围的核酸序列同源的核酸序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂的长度独立地在为或约50与为或约750个核苷酸之间、为或约50与为或约500个核苷酸之间、为或约50与为或约250个核苷酸之间、为或约50与为或约100个核苷酸之间、为或约100与为或约750个核苷酸之间、为或约100与为或约500个核苷酸之间、为或约100与为或约250个核苷酸之间、为或约250与为或约750个核苷酸之间、为或约250与为或约500个核苷酸之间。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂的长度独立地是为或约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400或500个核苷酸，或任何前述值之间的任何值。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂的长度独立地小于或小于约100个核苷酸。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂的长度独立地是为或约50、60、70、80或90个核苷酸，或任何前述值之间的任何值。

47、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座选自pdcd1、cd69、nur77、foxp3和hla-dr基因座。

48、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是pdcd1。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与pdcd1的一个或多个区域同源的序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂包含：a)含有与seq idno:66所示的序列展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列的为或至少为或至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个连续核苷酸的序列；b)含有seq id no:66所示的序列的为或至少为或至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个连续核苷酸的序列；或c)seq id no:66所示的序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述3'同源臂包含：a)含有与seq id no:67所示的序列展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列的为或至少为或至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个连续核苷酸的序列；b)含有seq id no:67所示的序列的为或至少为或至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个连续核苷酸的序列；或c)seq id no:67所示的序列。

49、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是cd69。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与cd69的一个或多个区域同源的序列。

50、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是nur77。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与nur77的一个或多个区域同源的序列。

51、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是foxp3。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与foxp3的一个或多个区域同源的序列。

52、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是hla-dr基因座。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与hla-dr基因座的一个或多个区域同源的序列。

53、在一些实施方案中，所述重组受体或其部分能够诱导或传递所述t细胞中的所述刺激或激活信号。

54、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体包含细胞内区域，所述细胞内区域含有所述t细胞受体(tcr)复合物的组分的细胞内信号传导结构域，并且所述t细胞中的所述刺激或激活信号包含通过所述重组受体中存在的细胞内信号传导结构域的信号，或者所述重组受体包含细胞内区域，所述细胞内区域含有包含免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的细胞内信号传导结构域，并且所述t细胞中的所述刺激或激活信号包含通过所述重组受体中存在的细胞内信号传导结构域的信号。

55、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体包含胞外区域，所述胞外区域含有能够结合或识别药剂的结合结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，在所述药剂结合后，在所述t细胞中诱导了刺激或激活信号。

56、在任何实施方案的一些实施方案中，所述药剂是靶抗原。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原是重组蛋白或在细胞表面上表达的抗原。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，为疾病、障碍或病症的细胞或组织所特有，或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在任何实施方案的一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3、b7-h6、碳酸酐酶9(ca9，也称为caix或g250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1b(ctag，也称为ny-eso-11和lage-12)、癌胚抗原(cea)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白a2、c-c基序趋化因子配体1(ccl-11)、cd19、cd20、cd22、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd123、cd133、cd138、cd171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)、表皮生长因子蛋白(egfr)、表皮生长因子受体iii型突变体(egfr viii)、上皮糖蛋白2(epg-12)、上皮糖蛋白40(epg-40)、肝配蛋白b2、肝配蛋白受体a2(epha2)、雌激素受体、fc受体样蛋白5(fcrl5；也称为fc受体同源物5或fcrh5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿achr)、叶酸结合蛋白(fbp)、叶酸受体α、神经节苷脂gd2、o-乙酰化gd2(ogd2)、神经节苷脂gd3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、g蛋白偶联受体c类5族成员d(gprc5d)、her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-b2)、her3(erb-b3)、her4(erb-b4)、erbb二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原a1(hla-a1)、人白细胞抗原a2(hla-a2)、il-122受体α(il-122rα)、il-113受体α2(il-113rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、l1细胞粘附分子(l1-cam)、l1-cam的ce7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员a(lrrc8a)、lewisy、黑色素瘤相关抗原(mage)-a1、mage-a3、mage-a6、mage-a10、间皮素(msln)、c-met、鼠类巨细胞病毒(cmv)、粘蛋白1(muc1)、muc16、自然杀伤细胞2族成员d(nkg2d)配体、黑色素a(mart-11)、神经细胞粘附分子(ncam)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(prame)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(tpbg，也称为5t4)、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、酪氨酸酶相关蛋白1(trp1，也称为tyrp1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(trp2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或dct)、血管内皮生长因子受体(vegfr)、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)、肾母细胞瘤1(wt-11)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由hiv、hcv、hbv或其他病原体表达的分子。

57、在任何实施方案的一些实施方案中，所述药剂是抗独特型抗体。

58、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(car)。在任何实施方案的一些实施方案中，所述car包含胞外区域、跨膜结构域和细胞内区域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述胞外区域包含间隔子。在任何实施方案的一些实施方案中，所述间隔子可操作地连接在所述结合结构域与所述跨膜结构域之间。在任何实施方案的一些实施方案中，所述胞外区域包含结合结构域，所述结合结构域是或包含抗体或其抗原结合片段。

59、在任何实施方案的一些实施方案中，所述细胞内区域包含细胞内信号传导结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包含cd3链的细胞内信号传导结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，cd3-zeta(cd3ζ)链或其信号传导部分。在任何实施方案的一些实施方案中，所述细胞内区域包含一个或多个共刺激信号传导结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个共刺激信号传导结构域包含cd28、4-1bb或icos或其信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述共刺激信号传导区域包含4-1bb的细胞内信号传导结构域。

60、在任何实施方案的一些实施方案中，所述经修饰的t细胞刺激相关基因座编码作为car的重组受体，其中所述car从其n至c末端按顺序包含：所述胞外结合结构域、所述间隔子、所述跨膜结构域和细胞内区域。

61、在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因按顺序包含编码以下的核苷酸序列：胞外结合结构域，如scfv；间隔子，如包含来自人免疫球蛋白铰链(如来自igg1、igg2或igg4)或其修饰形式的序列，如还包含ch2区和/或ch3区；和跨膜结构域，如来自人cd28；共刺激信号传导结构域，如来自人4-1bb；以及细胞内信号传导结构域，如cd3ζ链或其一部分；和/或所述经修饰的t细胞刺激相关基因座按顺序包含编码以下的核苷酸序列：胞外结合结构域如scfv；间隔子，如包含来自人免疫球蛋白铰链(如来自igg1、igg2或igg4)或其修饰形式的序列，如还包含ch2区和/或ch3区；和跨膜结构域，如来自人cd28；共刺激信号传导结构域，如来自人4-1bb；以及细胞内信号传导结构域，如cd3ζ链或其一部分。

62、在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因编码所述重组受体。

63、在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因编码所述重组受体的一部分。在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体含有两条单独的多肽链，其中由所述转基因编码的重组受体的所述部分是所述重组受体的一条链。在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体的另一条链由第二转基因编码。

64、在任何实施方案的一些实施方案中，所述car是多链car。在任何实施方案中的一些实施方案中，转基因编码所述多链car的一条链。

65、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体是重组t细胞受体(tcr)。在任何实施方案的一些实施方案中，重组tcr包含α(tcrα)链和β(tcrβ)链，并且所述转基因包含编码所述tcrα链的核酸序列和/或编码所述tcrβ链的核酸序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因编码所述tcrα链或所述tcrβ链中的一个。

66、在任何实施方案的一些实施方案中，所述tcrα链包含含有一个或多个引入的半胱氨酸残基的恒定(cα)区和/或所述tcrβ链包含含有一个或多个引入的半胱氨酸残基的cβ区，其中所述一个或多个引入的半胱氨酸残基能够在所述α链与所述β链之间形成一个或多个非天然二硫桥。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个引入的半胱氨酸残基包括用半胱氨酸残基替代非半胱氨酸残基。在任何实施方案的一些实施方案中，所述cα区包含在对应于位置48的位置处的半胱氨酸，其中编号如seq id no:92所示；和/或所述cβ区包含在对应于位置57的位置处的半胱氨酸，其中编号如seq id no:96所示。

67、在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因包含编码至少一种另外的蛋白质的核苷酸序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述至少一种另外的蛋白质是替代标记物。在任何实施方案的一些实施方案中，所述替代标记物是截短的受体。在任何实施方案的一些实施方案中，所述截短的受体缺少细胞内信号传导结构域和/或在与其配体结合时不能介导细胞内信号传导。

68、在任何实施方案的一些实施方案中，所述转基因还包含一个或多个多顺反子元件。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个多顺反子元件包含编码选自t2a、p2a、e2a或f2a的核糖体跳跃元件或内部核糖体进入位点(ires)的序列。

69、在任何实施方案的一些实施方案中，所述多顺反子元件位于编码所述car的核苷酸序列与编码至少一种另外的蛋白质的核苷酸序列之间；所述重组受体是重组tcr，并且所述多顺反子元件位于编码所述tcrα的核苷酸序列与编码所述tcrβ的核苷酸序列之间；所述重组受体是多链car，并且所述多顺反子元件位于编码所述多链car的一条链的核苷酸序列与编码所述多链car的另一条链的核苷酸序列之间；和/或所述一个或多个多顺反子元件位于编码所述重组受体的核苷酸序列的上游。

70、在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸是线性多核苷酸。在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸是双链多核苷酸。在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸是单链多核苷酸。在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸包含于病毒载体中。在任何实施方案的一些实施方案中，所述病毒载体是aav载体。在任何实施方案的一些实施方案中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在任何实施方案的一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。

71、在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸的长度是为或约1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750或4000个核苷酸或任何前述值之间的任何值。在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸的长度在为或约1500与为或约2500个核苷酸之间，或者在为或约1750与为或约2250个核苷酸之间。

72、还提供了产生基因工程化t细胞的方法，所述方法包括：(a)将能够在t细胞的内源t细胞刺激相关基因座内的靶位点处诱导基因破坏的一种或多种药剂引入所述t细胞中；以及(b)将任何所提供的多核苷酸引入包含在t细胞刺激相关基因座处的基因破坏的t细胞中，其中所述方法产生经修饰的t细胞刺激相关基因座，所述经修饰的t细胞刺激相关基因座含有编码所述重组受体或其一部分的转基因。在任何实施方案的一些实施方案中，将编码重组受体或其一部分的所述转基因经由同源定向修复(hdr)整合在所述内源t细胞刺激相关基因座内。

73、还提供了产生基因工程化t细胞的方法，所述方法包括将包含编码重组受体或其一部分的转基因的多核苷酸引入t细胞中，所述t细胞具有在所述t细胞的t细胞刺激相关基因座内的基因破坏，其中将编码所述重组受体或其一部分的转基因经由同源定向修复(hdr)整合在所述内源t细胞刺激相关基因座内。

74、在任何实施方案的一些实施方案中，通过以下方式来进行所述基因破坏：向t细胞中引入能够在所述t细胞的内源t细胞刺激相关基因座内的靶位点处诱导基因破坏的一种或多种药剂。在任何实施方案的一些实施方案中，所述方法产生经修饰的t细胞刺激相关基因座，所述经修饰的t细胞刺激相关基因座含有编码重组受体或其一部分的转基因。

75、在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸还包含与所述核酸序列连接的一个或多个同源臂，其中所述一个或多个同源臂包含与t细胞中的内源t细胞刺激相关基因座的一个或多个区域同源的序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个同源臂包含5'同源臂和/或3'同源臂。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5’同源臂和所述3'同源臂包含与靶位点周围的核酸序列同源的核酸序列，其中所述靶位点在所述t细胞刺激相关基因座内。

76、在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶位点位于所述t细胞刺激相关基因座的内源转录调节元件的下游。

77、在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸包含结构[5'同源臂]-[转基因]-[3'同源臂]。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与所述至少一个靶位点周围的核酸序列同源的核酸序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂的长度独立地在为或约50与为或约750个核苷酸之间、为或约50与为或约500个核苷酸之间、为或约50与为或约250个核苷酸之间、为或约50与为或约100个核苷酸之间、为或约100与为或约750个核苷酸之间、为或约100与为或约500个核苷酸之间、为或约100与为或约250个核苷酸之间、为或约250与为或约750个核苷酸之间、为或约250与为或约500个核苷酸之间。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂的长度独立地是为或约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400或500个核苷酸，或任何前述值之间的任何值。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂的长度独立地小于或小于约100个核苷酸。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂的长度独立地是为或约50、60、70、80或90个核苷酸，或任何前述值之间的任何值。

78、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座选自pdcd1、cd69、nur77、foxp3和hla-dr基因座。

79、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是pdcd1。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与pdcd1的一个或多个区域同源的序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂包含：a)含有与seq idno:66所示的序列展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列的为或至少为或至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个连续核苷酸的序列；b)含有seq id no:66所示的序列的为或至少为或至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个连续核苷酸的序列；或c)seq id no:66所示的序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述3'同源臂包含：a)含有与seq id no:67所示的序列展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列的为或至少为或至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个连续核苷酸的序列；b)含有seq id no:67所示的序列的为或至少为或至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个连续核苷酸的序列；或c)seq id no:67所示的序列。

80、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是cd69。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与cd69的一个或多个区域同源的序列。

81、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是nur77。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与nur77的一个或多个区域同源的序列。

82、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是foxp3。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与foxp3的一个或多个区域同源的序列。

83、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是hla-dr基因座。在任何实施方案的一些实施方案中，所述5'同源臂和所述3'同源臂包含与hla-dr基因座的一个或多个区域同源的序列。

84、在一些实施方案中，所述重组受体或其部分能够诱导或传递所述t细胞中的所述刺激或激活信号。

85、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体包含细胞内区域，所述细胞内区域含有所述t细胞受体(tcr)复合物的组分的细胞内信号传导结构域，并且所述t细胞中的所述刺激或激活信号包含通过所述重组受体中存在的细胞内信号传导结构域的信号，或者所述重组受体包含细胞内区域，所述细胞内区域含有包含免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的细胞内信号传导结构域，并且所述t细胞中的所述刺激或激活信号包含通过所述重组受体中存在的细胞内信号传导结构域的信号。

86、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体包含胞外区域，所述胞外区域含有能够结合或识别药剂的结合结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，在所述药剂结合后，在所述t细胞中诱导了刺激或激活信号。

87、在任何实施方案的一些实施方案中，所述药剂是靶抗原。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原是重组蛋白或在细胞表面上表达的抗原。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，为疾病、障碍或病症的细胞或组织所特有，或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在任何实施方案的一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。

88、在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原、病原体特异性或病原体表达的抗原、炎性抗原或自身抗原。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。在任何实施方案的一些实施方案中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3、b7-h6、碳酸酐酶9(ca9，也称为caix或g250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1b(ctag，也称为ny-eso-11和lage-12)、癌胚抗原(cea)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白a2、c-c基序趋化因子配体1(ccl-11)、cd19、cd20、cd22、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd123、cd133、cd138、cd171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)、表皮生长因子蛋白(egfr)、表皮生长因子受体iii型突变体(egfr viii)、上皮糖蛋白2(epg-12)、上皮糖蛋白40(epg-40)、肝配蛋白b2、肝配蛋白受体a2(epha2)、雌激素受体、fc受体样蛋白5(fcrl5；也称为fc受体同源物5或fcrh5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿achr)、叶酸结合蛋白(fbp)、叶酸受体α、神经节苷脂gd2、o-乙酰化gd2(ogd2)、神经节苷脂gd3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、g蛋白偶联受体c类5族成员d(gprc5d)、her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-b2)、her3(erb-b3)、her4(erb-b4)、erbb二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原a1(hla-a1)、人白细胞抗原a2(hla-a2)、il-122受体α(il-122rα)、il-113受体α2(il-113rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、l1细胞粘附分子(l1-cam)、l1-cam的ce7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员a(lrrc8a)、lewis y、黑色素瘤相关抗原(mage)-a1、mage-a3、mage-a6、mage-a10、间皮素(msln)、c-met、鼠类巨细胞病毒(cmv)、粘蛋白1(muc1)、muc16、自然杀伤细胞2族成员d(nkg2d)配体、黑色素a(mart-11)、神经细胞粘附分子(ncam)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(prame)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(tpbg，也称为5t4)、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、酪氨酸酶相关蛋白1(trp1，也称为tyrp1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(trp2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或dct)、血管内皮生长因子受体(vegfr)、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)、肾母细胞瘤1(wt-11)、病原体特有的或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由hiv、hcv、hbv或其他病原体表达的分子。

89、在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过特异性结合至、识别或杂交至所述靶位点的锌指核酸酶(zfn)、tal效应物核酸酶(talen)或crispr-cas9组合实现的。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过crispr-cas9组合实现的，并且所述crispr-cas9组合包含具有与所述至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导rna(grna)。在任何实施方案的一些实施方案中，所述crispr-cas9组合是包含所述grna和cas9蛋白的核糖核蛋白(rnp)复合物。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过经由电穿孔引入多个t细胞中的rnp实现的。

90、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是pdcd1。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过包含grna的crispr-cas9组合实现的，并且所述grna具有与pdcd1基因中的靶位点互补的靶向结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:75和104-109中任一个所示的序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:75所示的序列。

91、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是cd69。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过包含grna的crispr-cas9组合实现的，并且所述grna具有与cd69基因中的靶位点互补的靶向结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:116-121中任一个所示的序列。

92、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是nur77。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过包含grna的crispr-cas9组合实现的，并且所述grna具有与nur77基因中的靶位点互补的靶向结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:122-127和134-136所示的序列。

93、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是foxp3。

94、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞刺激相关基因座是hla-dr基因座。

95、在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞还包含内源t细胞受体α恒定区(trac)基因和/或内源t细胞受体β恒定区(trbc)基因处的基因破坏。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过特异性结合至、识别或杂交至所述trac、trbc1和/或trbc2基因内的至少一个靶位点的锌指核酸酶(zfn)、tal效应物核酸酶(talen)或crispr-cas9组合实现的。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过crispr-cas9组合实现的，并且所述crispr-cas9组合包含具有与所述至少一个靶位点互补的靶向结构域的指导rna(grna)。在任何实施方案的一些实施方案中，所述crispr-cas9组合是包含所述grna和cas9蛋白的核糖核蛋白(rnp)复合物。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过经由电穿孔引入多个t细胞中的rnp实现的。在任何实施方案的一些实施方案中，所述基因破坏是通过包含grna的crispr-cas9组合实现的，并且所述grna具有与所述trac、trbc1和/或trbc2基因内的至少一个靶位点互补的靶向结构域。

96、在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna具有与trac基因中的靶位点互补的靶向结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:77和188-218中任一个所示的序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:77所示的序列。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna具有与trbc基因中的靶位点互补的靶向结构域。在任何实施方案的一些实施方案中，所述grna包含seq id no:219-276中任一个所示的序列。

97、在任何实施方案的一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(car)。在任何实施方案的一些实施方案中，所编码的重组受体是或包含重组t细胞受体(tcr)。

98、在任何实施方案的一些实施方案中，所述rnp是经由电穿孔、粒子枪、磷酸钙转染、细胞压缩或挤压引入的。在任何实施方案的一些实施方案中，所述rnp是经由电穿孔引入的。在任何实施方案的一些实施方案中，所述rnp是经由电穿孔引入多个t细胞中的。在任何实施方案的一些实施方案中，所述rnp的浓度是从为或约1μm至为或约5μm。在任何实施方案的一些实施方案中，所述rnp的浓度是为或约2μm。

99、在任何实施方案的一些实施方案中，t细胞包含cd8+t细胞和/或cd4+t细胞或其亚型。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞是对于所述受试者而言自体的。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞是源自受试者的原代t细胞。在任何实施方案的一些实施方案中，所述受试者是人。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞是对于所述受试者而言同种异体的。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞源自多潜能或多能细胞。在任何实施方案的一些实施方案中，所述t细胞源自ipsc。

100、在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸是线性多核苷酸。在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸是双链多核苷酸。在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸是单链多核苷酸。在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸包含于病毒载体中。在任何实施方案的一些实施方案中，所述病毒载体是aav载体。在任何实施方案的一些实施方案中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在任何实施方案的一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。

101、在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸的长度是为或约1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750或4000个核苷酸或任何前述值之间的任何值。在任何实施方案的一些实施方案中，所述多核苷酸的长度在为或约1500与为或约2500个核苷酸之间，或者在为或约1750与为或约2250个核苷酸之间。

102、在任何实施方案的一些实施方案中，将所述一种或多种药剂和所述多核苷酸同时或按任何顺序依序引入。在任何实施方案的一些实施方案中，将所述一种或多种药剂和所述多核苷酸同时引入。在任何实施方案的一些实施方案中，在引入所述一种或多种药剂之后引入所述多核苷酸。在任何实施方案的一些实施方案中，在引入所述药剂之后立即引入所述多核苷酸，或者在引入所述药剂之后约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、6分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时或4小时内引入所述多核苷酸。

103、在任何实施方案的一些实施方案中，在引入所述一种或多种药剂和/或所述多核苷酸之前，所述方法包括在刺激或激活一种或多种免疫细胞的条件下将所述细胞在体外与一种或多种刺激剂一起孵育。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂包含抗cd3和/或抗cd28抗体。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂包含含有抗cd3和/或抗cd28抗体的低聚体颗粒试剂。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种刺激剂包含用抗cd3和/或抗cd28抗体包被的珠。

104、在任何实施方案的一些实施方案中，所述方法还包括在引入所述一种或多种药剂和/或引入所述多核苷酸之前、期间或之后，将所述细胞与一种或多种重组细胞因子一起孵育。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种重组细胞因子选自il-2、il-7和il-15。在任何实施方案的一些实施方案中，所述一种或多种重组细胞因子是以选自以下的浓度来添加的：从为或约10u/ml至为或约200u/ml的浓度的il-2。在任何实施方案的一些实施方案中，将所述一种或多种重组细胞因子以为或约50iu/ml至为或约100u/ml的浓度添加；将il-7以0.5ng/ml至50ng/ml的浓度添加。在任何实施方案的一些实施方案中，将所述一种或多种重组细胞因子以为或约5ng/ml至为或约10ng/ml的浓度添加和/或将il-15以0.1ng/ml至20ng/ml的浓度添加。在任何实施方案的一些实施方案中，将所述一种或多种重组细胞因子以为或约0.5ng/ml至为或约5ng/ml的浓度添加。

105、在任何实施方案的一些实施方案中，所述孵育是在引入所述一种或多种药剂和引入所述多核苷酸之后进行的，持续至多或大约24小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天。在任何实施方案的一些实施方案中，所述孵育进行至多或约7天。

106、还提供了使用任何所提供的方法生成的一个工程化t细胞或多个工程化t细胞。

107、还提供了一种组合物，所述组合物包含任何所提供的工程化细胞或多个任何所提供的工程化细胞。

108、还提供了一种组合物，所述组合物包含多个任何所提供的工程化细胞。

109、在任何实施方案的一些实施方案中，所述可操作地连接的转基因的表达在所述t细胞中所述刺激或激活信号之后小于或小于约6、12、18、24、36或48小时内在所述组合物中的一个或多个细胞中被上调或诱导。在任何实施方案的一些中，在所述t细胞中的刺激或激活信号之后，在所述组合物中的细胞中表达所述可操作地连接的转基因的细胞的频率大于或大于约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。在任何实施方案的一些实施方案中，在表达的上调或诱导之后或在所述t细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述组合物中的一个或多个细胞中被降低或下调。

110、在任何实施方案的一些实施方案中，在表达的上调或诱导之后或在所述t细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后，在组合物中的细胞中表达所述可操作地连接的转基因的细胞的频率降低大于或大于约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。在任何实施方案的一些实施方案中，在表达的上调或诱导之后，在所述t细胞中的所述刺激或激活信号之后为或约1、2、3、4、5、6、7或8天或更长时间之后，所述可操作地连接的转基因的表达在所述组合物中的一个或多个细胞中被降低或下调。

111、在任何实施方案的一些实施方案中，在所述t细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后小于或小于约6、12、18、24、36或48小时内，在所述组合物中的一个或多个细胞中所述可操作地连接的转基因的表达被降低或下调。在任何实施方案的一些实施方案中，在所述t细胞中所述刺激或激活信号降低或不存在之后，在所述组合物中的细胞中表达所述重组受体的细胞的频率小于或小于约50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％或更少。

112、在任何实施方案的一些实施方案中，所述组合物包含cd4+t细胞和/或cd8+t细胞。在任何实施方案的一些实施方案中，所述组合物包含cd4+和cd8+t细胞，并且cd4+与cd8+t细胞的比率是从或从约1:3至3:1。在任何实施方案的一些实施方案中，1:1。

113、还提供了治疗方法，所述治疗方法包括向患有疾病或障碍的受试者施用任何所提供的工程化细胞或任何所提供的工程化组合物。

114、还提供了任何所提供的工程化细胞或任何所提供的工程化组合物用于治疗疾病或障碍的用途。

115、还提供了任何所提供的工程化细胞或任何所提供的工程化组合物在制造用于治疗疾病或障碍的药物中的用途。

116、还提供了任何所提供的工程化细胞或任何所提供的工程化组合物，所述工程化细胞或所述工程化组合物用于治疗疾病或障碍。

117、在任何实施方案的一些实施方案中，所述疾病或障碍是癌症或肿瘤。在任何实施方案的一些实施方案中，所述癌症或所述肿瘤是血液恶性肿瘤。在任何实施方案的一些实施方案中，所述癌症或所述肿瘤是淋巴瘤、白血病或浆细胞恶性肿瘤。在任何实施方案的一些实施方案中，所述癌症是淋巴瘤，并且所述淋巴瘤是伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、霍奇金淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、滤泡性淋巴瘤、小无裂细胞性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(malt)、边缘区淋巴瘤、脾淋巴瘤、结节单核细胞样b细胞淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、弥漫性混合细胞淋巴瘤、肺b细胞血管中心淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lpl)或套细胞淋巴瘤(mcl)。在任何实施方案的一些实施方案中，所述癌症是白血病，并且所述白血病是慢性淋巴细胞白血病(cll)、浆细胞白血病或急性淋巴细胞白血病(all)。在任何实施方案的一些实施方案中，所述癌症是浆细胞恶性肿瘤，并且所述浆细胞恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(mm)。

118、在任何实施方案的一些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在任何实施方案的一些实施方案中，所述实体瘤是非小细胞肺癌(nsclc)或头颈部鳞状细胞癌(hnscc)。

119、还提供了试剂盒，所述试剂盒包含能够在t细胞刺激相关基因座内的靶位点处诱导基因破坏的一种或多种药剂；以及任何所提供的多核苷酸。

120、还提供试剂盒，所述试剂盒包含能够在t细胞刺激相关基因座内的靶位点处诱导基因破坏的一种或多种药剂；和包含编码嵌合受体或其一部分的核酸序列的多核苷酸，其中编码所述嵌合受体或其抗原结合片段或链的转基因被靶向用于经由同源定向修复(hdr)整合在所述靶位点处或附近；以及用于进行任何所提供的方法的说明书。