用于治疗或预防造血细胞移植后血液肿瘤复发的MDM2抑制剂的制作方法

背景技术：

1、急性髓性白血病(aml)复发是同种异体造血细胞移植(allo-hct)后第100天移植后死亡的主要原因(1)。促进复发的主要机制包括ii类mhc(mhc-ii)的下调(2，3)、错配hla4的缺失、免疫检查点配体的上调(3)和il-15产生的减少(5)和白血病衍生的乳酸释放减少(6)等(综述于7中)。促凋亡基因包括tnf相关凋亡诱导配体(trail)受体1和2的下调显示与aml中的治疗抗性和复发有关(8)。这些数据表明增加mhc-ii或trail-r1/2表达的方法可以成功地治疗同种异体hct后的aml复发。

2、目前用于aml复发的药理学方法除了其他flt3激酶抑制剂之外还包括免疫检查点抑制剂、去甲基化剂、bcl-2抑制剂等(综述于9中)。小鼠双微体-2(mdm2)抑制剂(10,11)可诱导aml中的p53依赖性细胞凋亡，然而，迄今为止尚未评价它们在同种异体hct后设置中的作用。

3、根据现有技术，在本领域中仍然非常需要提供另外的和/或改进的方法来治疗白血病或淋巴瘤复发，特别是hct后的aml复发。特别地，这种治疗可以包括增加白血病细胞中mhc-ii或trail-r1/2表达的化合物。然而，迄今为止这些化合物还不能获得，并且仍然需要提供这样的化合物。

技术实现思路

1、根据现有技术，本发明要解决的技术问题是提供替代和/或改进的工具(means)来治疗白血病或淋巴瘤复发，特别是hct后的aml复发。这种工具应包括适于介导白血病细胞中mhc-ii或trail-r1/2表达的上调或维持表达的化合物、分子和/或组合物。

2、该问题通过独立权利要求的特征来解决。本发明的优选实施方案由从属权利要求提供。

3、因此，本发明涉及一种小鼠双微体2(mdm2)抑制剂，其用于治疗和/或预防患者造血细胞移植(hct)后的血液肿瘤复发。mdm2抑制剂可在施用hct之前和/或同时和/或之后(优选在hct之后)施用。

4、本发明基于完全令人惊讶的发现，即通过施用mdm2抑制剂可以特异性地治疗或预防hct后患有血液肿瘤的患者中癌细胞的复发。本发明还出乎意料地发现，mdm2的抑制导致癌细胞如白血病细胞或aml细胞中mhc-i和mhc-ii分子的上调，以及trail-受体的上调。这导致通过同种异体t细胞对患者癌细胞的识别的大量增强，所述同种异体t细胞已经通过hct(造血细胞移植)和/或通过同种异体t细胞的单独移植引入到患者中(同种异体供体淋巴细胞输注；dli)。换句话说，暴露于mdm2抑制剂使得患者的癌细胞在免疫学上“可见”或强烈增强免疫学上“可见性”，使得移植的同种异体t细胞现在可以识别并攻击癌细胞。

5、mdm2蛋白作为泛素连接酶和p53转录激活的抑制剂起作用，泛素连接酶识别p53的n-末端反式激活结构域。mdm2过表达与致癌ras协同促进原发性啮齿动物成纤维细胞的转化，并且mdm2抑制可增加p53活性(11)。mdm2通过降低p53蛋白水平起作用，这促进肿瘤细胞中新生突变(de novo mutations)的累积，从而增强它们的恶性潜能。除了其抗致癌效应外，p53还可增加某些免疫相关基因的表达。在本发明的背景下，已经令人惊讶地发现，在血液肿瘤的癌细胞中，特别是在aml细胞中，类似的机制是可操作的，即hla-ii类分子和trail-受体的上调，使得它们在同种异体hct后对同种异体反应性供体t细胞应答更敏感。

6、完全出乎意料的是，mdm2抑制导致trail-r1/2在白血病和淋巴瘤细胞(例如，原发性人aml细胞和aml细胞系)中表达。在trail连接后，trail死亡受体在它们的细胞内死亡结构域装配由具有死亡结构域的fas相关蛋白(fadd)和半胱天冬酶原8/10组成的死亡诱导信号复合物(disc)(17)。trail-r激活显示具有抗肿瘤活性(18)。

7、此外，本文发现mdm2抑制还增加了原发性白血病和淋巴瘤细胞，特别是人aml细胞上的mhc-ii表达，这可提供药理学干预以逆转在同种异体hct后aml复发中观察到的mhc-ii减少(2,3)。

8、在实施方案中，血液肿瘤选自含有白血病、淋巴瘤和骨髓增生异常综合征的组。在实施方案中，血液肿瘤是白血病，优选急性髓性白血病(aml)。

9、在实施方案中，血液肿瘤包含一种或多种突变，例如致癌突变，其在肿瘤细胞中诱导mdm2和/或mdm4表达。令人惊讶的是，某些突变诱导mdm2和/或mdm4，这使得这些肿瘤癌细胞对mdm2抑制剂的治疗特别敏感。在优选的实施方案中，包含一种或多种mdm2和/或mdm4诱导突变的血液肿瘤是aml。mdm2和/或mdm4诱导突变可以是例如点突变或融合基因，其可以通过染色体易位形成。

10、mdm2和/或mdm4诱导突变可非限制性地选自ckit-d816v、fip1l-pdgfr-α，flt3-itd和jak2-v617f。另外的mdm2和/或mdm4诱导突变可例如通过使用本文所述的技术来鉴定。

11、ckit-d816v是kit基因的密码子816的激活突变，其涉及恶性细胞生长，特别是在急性髓性白血病(aml)中，涉及系统性肥大细胞增多症和生殖细胞肿瘤，其特征在于天冬氨酸被缬氨酸取代(d816v)，并且其使得受体不依赖于激活和信号传导的配体。

12、fip1l1-pdgfrα融合基因已在血液恶性肿瘤，特别是aml中涉及的嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、t淋巴细胞和b淋巴细胞中检测到。fip1l1-pdgfr-α融合蛋白保留了pdgfr-α相关的酪氨酸激酶活性，但与pdgfr-α不同，它们的酪氨酸激酶是组成型的，即连续活性的：融合蛋白缺乏pdgfr-a的完整近膜结构域，其通常阻断酪氨酸激酶活性，除非pdgfr-α与其激活配体——血小板衍生的生长因子结合。fip1l1-pdgfr-α融合蛋白还对pdgfr-α的正常降解途径，即蛋白酶体依赖性泛素化具有抗性。因此，它们是高度稳定的、长寿命的、不受调节的，并且持续表达它们的pdgfra酪氨酸激酶组分的刺激作用。

13、用mdm2抑制剂(优选与同种异体t细胞移植组合)治疗hct后的造血系统肿瘤复发(例如，aml复发)在患有携带mdm2和/或mdm4诱导突变的肿瘤的患者中特别有效。因此，在优选的实施方案中，已知患者患有携带这些突变(例如，flt3-itd、jak2-v617f、ckit-d816v或fip1l-pdgfr-α)的造血系统肿瘤。

14、在实施方案中，hct是同种异体hct。优选造血细胞移植物是同种异体的(且最优选不是t细胞耗竭的)，因为由于hla分子的差异，移植物包含的同种异体t细胞可产生针对hct后复发的癌细胞的移植物抗白血病或移植物抗癌细胞应答。因此，施用mdm2抑制剂可导致移植的t细胞针对癌细胞的更强的抗癌效应，并可预防hct后癌症的复发或可导致复发发生后癌细胞的控制或根除。

15、在实施方案中，hct包含t细胞。

16、在实施方案中，在hct后和复发发生前将mdm2抑制剂施用于患者。在本发明的背景下，mdm2抑制剂可在不同时间点施用于患者。例如，可以在hct的时间点(造血细胞移植的时间点)，例如在同一天施用抑制剂。在实施方案中，在hct前(例如，hct前1、2、3、4、5、6或7天)已经施用抑制剂可能是有用的，使得剩余的癌细胞对于造血细胞移植物中包含的t细胞立即可见。mdm2抑制剂还可以在hct

17、

18、18、19、20天或更多天)施用。在一些实施方案中，在施用hct先前、之前和之后施用mdm2抑制剂。优选地，mdm2抑制剂(仅)在施用hct后施用。

19、mdm2抑制剂施用发生多次并且甚至定期重复，例如每天一次、每隔一天一次、每4天一次、每周一次、每月一次，(重复)28天时间表的第1-5天或(重复)28天时间表的第1-7天。

20、mdm2抑制剂施用可以常规地发生在已经接受和/或正在接受和/或将接受hct作为预防措施的患有血液肿瘤的患者中，例如以增强移植物抗癌症效果和预防患者中癌症复发的发生。

21、在实施方案中，在hct后复发发生后，将抑制剂施用于白血病患者。mdm2抑制剂施用可以是hct后血液肿瘤患者复发后的治疗措施，可能与进一步的同种异体t细胞移植(优选不含造血干细胞的供体淋巴细胞输注(dli))组合。

22、在一个实施方案中，mdm2抑制剂在hct之后、和a)在同种异体t细胞移植之前、和/或b)在同种异体t细胞移植的同一天、和/或c)在同种异体t细胞移植之后施用。

23、在本文中，应当理解mdm2抑制剂和同种异体t细胞移植的组合施用可涉及抑制剂和细胞的协调施用。这两种产品不必在单一组合物中施用，而是也可以在不同的时间点作为单独的组合物施用。例如，患者可以首先接受mdm2抑制剂以诱导例如trail-r1、trail-r2、人白细胞抗原(hla)i类分子和hla ii类分子的上调，并且随后例如在同一天之后，或在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天之后接受t细胞移植。然而，这两种产品也可以大约同时施用，这意味着大约在8小时内施用，或者mdm2抑制剂可以在t细胞移植施用后施用。在本文中，一种或两种产物(mdm2抑制剂或t细胞移植物)可以以协同方式向患者施用多次。

24、应当理解，在本发明的背景下，mdm2与其他产品如hct、同种异体t细胞移植物和/或xpo-1抑制剂的协同施用涉及mdm2抑制剂和其他产品的施用以增强抑制剂的治疗或预防效果。本领域技术人员能够根据接受mdm2抑制剂的患者的合适的施用方案，并协调抑制剂和其他化合物/产品的各自施用。另外，有可能具有诱导mdm2表达的某些突变的白血病将特别良好地响应，因为观察到例如ckit-d816v和fip1l-pdgfr-α诱导mdm2和mdm4。由此可以看出，同种异体hct(骨髓移植)后的同种异体t细胞/mdm2抑制剂组合在携带fip1l-pdgfr-α突变体和ckit-d816v突变体aml的小鼠中是高度有效的。

25、在实施方案中，本发明的治疗还包括与hct一起和/或在hct后施用同种异体t细胞移植。在实施方案中，同种异体t细胞移植是包括淋巴细胞但不包括造血干细胞的供体淋巴细胞输注。在实施方案中，同种异体t细胞移植的供体也是hct的供体。

26、在本发明的背景下，mdm2抑制剂优选地选自包含rg7112(ro5045337)、依达奴林(idasanutlin，rg7388)、amg-232(krt-232)、apg-115、bi-907828、cgm097、思瑞德林(siremadlin)(hdm-201)和米拉德美坦(milademetan，ds-3032b)及其药学上可接受的盐的组。在一个实施方案中，mdm2抑制剂是思瑞德林(hdm-201)或其药学上可接受的盐或共晶(例如，琥珀酸共晶或琥珀酸盐)。

27、各种mdm2抑制剂是本领域已知的，并且已经描述了多种已建立的用于鉴定mdm2抑制剂的测定法，并且正在研究治疗各种病症(marina konopleva等人，leukemia.2020jul10.doi:10.1038/s41375-020-0949-z)。然而，mdm2抑制剂用于在hct后特异性治疗或预防血液肿瘤患者癌症复发的用途在本领域中从未描述或建议。这种治疗的优点迄今从未被描述过，并且是基于完全令人惊讶的发现，即血液肿瘤的癌细胞如白血病细胞上调增强同种异体t细胞对癌细胞的识别的分子。

28、在实施方案中，mdm2抑制剂的施用导致tnf相关凋亡诱导配体受体1(trail-r1)、trail-r2、人白细胞抗原(hla)i类分子和hla ii类分子中的一种或多种的上调。因此，在实施方案中，mdm2的抑制导致tnf相关凋亡诱导配体受体1(trail-r1)、trail-r2、人白细胞抗原(hla)i类分子和hla ii类分子中的一种或多种的上调。在实施方案中，tnf相关凋亡诱导配体受体1(trail-r1)、trail-r2、人白细胞抗原(hla)i类分子和hla ii类分子中的一种或多种的上调，特别是trail-r1和/或trail-r2的上调是p53依赖性的。

29、在实施方案中，mdm2抑制剂的施用增加了cd8+同种异体t细胞对癌细胞的细胞毒性，其中优选地，cd8+同种异体t细胞的细胞毒性至少部分依赖于癌细胞的trail-r和cd8+同种异体t细胞的trail-配体(trail-l)的相互作用。

30、在实施方案中，mdm2抑制剂的施用增加移植物抗白血病(gvl)或移植物抗淋巴瘤反应，其中优选地，移植物抗白血病反应或移植物抗淋巴瘤反应由cd8+同种异体t细胞介导。

31、在实施方案中，mdm2抑制剂的施用增加了cd8+同种异体t细胞对穿孔素、cd107a、ifn-γ、tnf和cd69中的一种或多种的表达。因此，根据本发明的一个方面，本文提供了增加了cd8+同种异体t细胞表达穿孔素、cd107a、ifn-γ、tnf和cd69中的一种或多种的方法，该方法包括施用与hct(例如，同种异体hct，例如包含t细胞)组合的mdm2抑制剂(例如，hdm201或其药学上可接受的盐)。

32、在实施方案中，mdm2抑制剂的施用诱导t细胞，特别是cd8+t细胞如cd8+同种异体t细胞的寿命特征(如(13)中所述)。例如，在实施方案中，在mdm2抑制的背景下，移植的cd8+t细胞显示bcl-2和/或il-7r(cd127)的高表达。此外，在实施方案中，mdm2抑制剂的施用诱导具有高抗原回忆应答的cd8+t细胞(如例如(12)所定义)，如缺乏cd27的cd8+t细胞。在实施方案中，mdm2抑制剂治疗诱导cd8+cd27+tim3+供体t细胞的减少。

33、本发明的另一个完全出乎意料的发现是，mdm2抑制剂的施用不仅导致如本文所述的癌细胞上的受体和表面分子的上调，而且还可以在患者的同种异体t细胞中诱导有利的表型，导致t细胞对癌细胞的更强的细胞毒性效应。粗略地说，mdm2抑制剂可以在cd8+同种异体t细胞中诱导更具细胞毒性的表型，使它们对复发的癌细胞更具“攻击性”。因此，根据本发明的一个方面，由此提供了在cd8+同种异体t细胞中诱导更有效的细胞毒性表型的方法，该方法包括与hct(例如，同种异体hct，例如包含t细胞)组合施用mdm2抑制剂(例如，hdm201或其药学上可接受的盐)。

34、在实施方案中，向对象施用根据本发明的mdm2抑制剂增强了移植物抗白血病反应期间体内t细胞的糖酵解活性。因此，在实施方案中，mdm2抑制导致对象中t细胞的糖酵解活性增加。因此，根据本发明的一个方面，由此提供了增强cd8+同种异体t细胞中的糖酵解活性的方法，该方法包括与hct(例如，同种异体hct，例如包含t细胞)组合施用mdm2抑制剂(例如，hdm201或其药学上可接受的盐)。

35、如本文所示，mdm2抑制导致t细胞(包括细胞毒性t细胞)中的糖酵解活性增加，这指示更强的t细胞激活和增加的gvl活性。在实施方案中，mdm2抑制剂治疗增加了对象中t细胞的激活和/或增加t细胞的gvl活性。t细胞可以是内源性的或施用的t细胞，优选cd8+同种异体t细胞。如以下实施例所示，对象的mdm抑制诱导所述对象中t细胞的糖酵解活性的增加。

36、完全出乎意料的是，在本发明背景下施用mdm2抑制剂诱导具有增强/增加的糖酵解活性的t细胞表型，进一步提高cd8+同种异体t细胞的细胞毒活性。

37、在实施方案中，患者可另外接受输出蛋白1(xpo-1)抑制剂。因此，在实施方案中，本发明涉及用于根据本发明的用途的mdm2抑制剂，其中所述治疗还包括输出蛋白1(xpo-1)抑制剂的施用。

38、如以下实施例所示，aml细胞中的mdm2抑制导致trail-r1/2表达增加并增强针对aml细胞的gvl，这在治疗hct后复发的患者或预防hct后复发的情况下是巨大的优势。分子xpo-1介导p53从细胞核中输出，并且令人惊讶地发现，在某些癌细胞中，xpo-1在mdm2抑制后减少p53诱导的trail-r1/2/mhc-ii产生。因此，在本发明的背景下另外抑制xpo-1以最大化mdm2抑制的效果是有利的。mdm2抑制剂和xpo-1抑制剂可以以如上所述用于组合施用mdm2抑制剂和造血细胞移植物或同种异体t细胞移植物的协同方式施用。两种抑制剂的施用可以单独进行或以包含两种抑制剂的药物产品或组合物的形式进行。

39、因此，本发明还涉及一种包含mdm2抑制剂和输出蛋白1(xpo-1)抑制剂的药物组合物，其用于治疗和/或预防根据前述权利要求中任一项的患者的造血细胞移植(hct)后的血液肿瘤复发。这样的药物组合物可用于本文所述的所有实施方案的背景下。

40、此外，根据本发明的一个方面，由此提供了用于治疗和/或预防患者的血液肿瘤的xpo-1抑制剂，其中治疗还包括施用造血细胞移植物(例如，同种异体的，例如包含t细胞)和mdm2抑制剂。