用于治疗心力衰竭的苯并二氢吡喃醇化合物的制作方法

用于治疗心力衰竭的苯并二氢吡喃醇化合物
i.技术领域
1.本发明涉及用于治疗或预防射血分数降低的心力衰竭(hfref)的苯并二氢吡喃醇化合物及其衍生物。
ii.

背景技术：

2.心力衰竭是一种临床诊断，其特征在于包括呼吸急促、疲劳和静脉压升高的症状和体征，其由明显的心脏功能异常引起(pearse和cowie 2014)。
3.存在不同类型的心力衰竭，其通常被分类为射血分数降低的心力衰竭(hfref)、射血分数保留的心力衰竭(hfpef)和充血性心力衰竭。通常，不同地治疗这些病症，并且适用于一种类型的心力衰竭的药物通常不适于治疗其他类型的心力衰竭。
4.hfref参照通常来源于超声心动图的左心室射血分数(lvef)进行定量，超过50％-60％的值被认为是正常的。患有射血分数保留的心力衰竭的患者也表现出≥50％的值。低于40％的值被认为是lvef降低(hfref)，并且lvef在40％-49％范围内的患者表示
‘
灰色区域’，其被定义为射血分数轻度降低的心力衰竭(hfmref)。患有hfmref的患者最可能主要具有轻度收缩功能障碍，但也具有舒张功能障碍的特征。
5.由于不同的潜在病因、人口统计学、并存病和对治疗的反应，基于lvef区分患有hf的患者是重要的。
6.无症状的结构性或功能性心脏异常(例如左心室(lv)收缩或舒张功能障碍)是心力衰竭的前兆。然而，瓣膜、心包膜、心内膜、心律和传导的异常也可导致心力衰竭(并且通常存在多于一种异常)。
7.患有射血分数降低的心力衰竭的患者具有左心室收缩功能障碍，通常还伴有舒张功能障碍的要素。(yancy等人，jacc，第62卷，第16号，2013)
8.心力衰竭的潜在心脏问题的鉴定出于治疗原因是至关重要的，因为精确的病理学决定了所使用的具体治疗(例如瓣膜疾病的瓣膜修复或置换、ef降低的hf的具体药物治疗、降低心动过速性心肌病的心率等)。(esc guidelines 2016)。
9.wo2020/096862描述了一种用于重塑心室的心脏装置，该装置包括被构造成从第一心室壁延伸到第二心室壁的用于分配力的装置以及被构造成将用于分配力的装置固定到第一心室壁处的组织的第一区域的第一多个用于锚固的装置，作为射血分数降低的心力衰竭的经皮治疗。
10.ru2422136公开了使用β-阻滞剂、利尿剂、重组人白介素和ace抑制剂治疗左心室射血分数降低的慢性心力衰竭的方法。
11.尽管这些方法是可利用的，但仍需要用于治疗射血分数降低的心力衰竭的新方法或化合物。
12.本发明的一个目的是提供用于治疗或预防射血分数降低的心力衰竭(hfmref或hfref)的化合物。
iii.

技术实现要素：

13.上述目的通过提供用于此类治疗的某些苯并二氢吡喃醇、醌或氢醌化合物来实现。
14.上述目的由本发明通过提供用于治疗或预防射血分数降低的心力衰竭的根据式(i)、(ii)的化合物、式(ii)的氢醌类似物或其药学上可接受的盐来实现；
[0015][0016]-其中r1表示氢或能够在活组织中除去的前药部分
[0017]-并且其中
[0018]
○
r2和r3与它们所附接的n原子一起形成具有一个至四个n、o或s原子的饱和或不饱和的、非芳族、任选取代的5-8元环，其中r2和r3一起含有3-12个碳原子；
[0019]
○
或者r2是氢原子，或具有1-6个碳原子的烷基基团，并且r3是任选地被氮或氧取代的烷基基团，其中所述烷基基团包含3-12个碳原子，r3中的所述烷基基团包含一个或多个能够在所述环中包含氮或氧原子并且能够含有直链和/或支链取代基团的非芳族环状结构，和一个或多个烯键式不饱和基团。
[0020]
对于本发明，根据式(ii)的化合物包括氢化醌(即氢醌)类似物，尽管考虑到稳定性，醌衍生物是优选的。
[0021]
式ii的化合物是根据式i的化合物的代谢物之一。因此，式i的化合物是式ii的化合物的前药，其中两者
[0022]
在一个优选的实施方案中，氮能够是胺、季胺、胍或亚胺，并且氧是羟基、羰基或羧酸；并且/或者氧和氮能够一起形成酰胺、脲或氨基甲酸酯基团。
[0023]
在一个优选的实施方案中，式(i)中的r1是氢或与所述6-氧一起形成具有2-6个碳原子的酯基团。
[0024]
在根据式(i)或根据式(ii)的化合物的一个优选的实施方案中，r2和r3与它们所附接的n原子一起形成包含另外的n原子的饱和环，所述环是未取代的或被醇或具有1-4个碳原子的烷醇基团诸如羟乙基取代。
[0025]
在另一个优选的实施方案中，r2是氢原子并且r3包含具有4-7个碳原子并且具有一个氮原子的饱和环状结构，所述环能够被烷基基团、醇基团或能够包含氧、羧酸或胺基团的具有1-4个碳原子的基团取代。
[0026]
在另一个优选的实施方案中，所述化合物是根据式ii的化合物，并且r2是氢原子，并且r3包含具有4-6个碳原子并且具有一个氮原子的环状结构，所述环是未取代的或被醇或具有1-4个碳原子的烷醇基团诸如羟乙基取代，并且优选地任选地被甲基、乙基或醇取代的甲基或乙基取代。
[0027]
在另一个优选的实施方案中，所述化合物是根据式i的化合物，r2是氢原子，并且r3包含具有4-7个碳原子并且具有一个氮原子的饱和环状结构，所述环是未取代的或被醇或具有1-4个碳原子的烷醇基团诸如羟乙基取代，并且优选地任选地被甲基、乙基或醇取代的甲基或乙基取代。
[0028]
根据另一个优选的实施方案，所述化合物是作为外消旋混合物或作为其对映体中的一者的(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮(sul-121)、((s)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基-n-((r)-哌啶-3-基)色满-2-甲酰胺盐酸盐(sul-13)或(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)甲酮(sul-109)或其药学上可接受的盐。
[0029]
尽管s对映体是有效的，但在最优选的实施方案中，所述化合物是sul-121的(2r)-对映体，即(2r)-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮(sul-150)或其药学上可接受的盐，因为r对映体似乎甚至更有效。
[0030]
在根据本发明的一个优选的实施方案中，根据式(i)或根据式(ii)的化合物具有低于500da的分子量。
[0031]
在根据本发明的一个优选的实施方案中，根据式(i)或根据式(ii)的化合物用于治疗或预防射血分数降低的心力衰竭(hfmref)，其中射血分数降低至50％或更低，并且甚至更优选的，根据式(i)或根据式(ii)的化合物用于治疗或预防射血分数降低的心力衰竭(hfref)，其中射血分数降低至40％或更低。
iv.附图说明
[0032]
图1表明sul-150施用至少在一定程度上排除了射血分数降低的心力衰竭的发展。大鼠中的长期多柔比星施用导致射血分数降低的心力衰竭，其特征在于(a)心率、(b)射血分数、(c)搏出功和(d)心输出量的降低。预防性或治疗性地口服施用sul-150排除了心脏功能的这些改变的至少一部分。*相对于假治疗组p《0.05，相对于多柔比星/媒介物p《0.05。
[0033]
图2表明egfp合成与h9c2心肌细胞大小和蛋白质合成相关。(a)去氧肾上腺素剂量依赖性地增加h9c2心肌细胞表面积和(b)egfp表达。(c)h9c2心肌细胞表面积与egfp表达相关。(d)去氧肾上腺素剂量依赖性地增加h9c2心肌细胞的蛋白质合成。(e)h9c2心肌细胞蛋白质合成与egfp的表达相关。(f)与媒介物处理的对照心肌细胞相比，去氧肾上腺素诱导h9c2心肌细胞中的egfp表达。蛋白质合成抑制剂布雷菲德菌素a降低了h9c2心肌细胞中egfp的表达。
[0034]
图3表明sul化合物抑制大鼠h9c2心肌细胞中去氧肾上腺素诱导的肥大反应。去氧肾上腺素剂量依赖性地诱导h9c2心肌细胞中egfp的表达(灰线，图a-图h)。与30μm(a)sul-11、(b)sul-99、(c)sul-127、(d)sul-13、(e)sul-138或(f)sul-138的初级代谢物sul-138m2、(g)sul-150或(h)sul-151预温育降低了心肌细胞的egfp表达。
[0035]
图4表明sul-150施用排除了多柔比星诱导的心脏纤维发生。大鼠中的长期多柔比星施用导致纤维发生，其特征在于心肌细胞之间的胶原沉积增加。预防性或治疗性地口服
施用sul-150排除了导致心脏组织中胶原含量较低的心脏纤维发生。
[0036]
图5表明sul-150施用减轻心脏氧化应激。如通过增加的脂质过氧化产物(tbars，a)所示，长期多柔比星施用诱导心脏氧化应激。预防性或治疗性方案中的口服sul-150施用排除了心脏氧化应激的诱导并将脂质过氧化产物的水平保持在基线(a)。由于氧化应激可能由自由基产生增加或自由基清除活性降低引起，因此研究了心脏自由基清除(b)。多柔比星施用和sul-150施用都没有改变心脏自由基清除活性。
[0037]
图6表明sul-150施用保持心脏能量水平和线粒体拷贝数。长期多柔比星施用消耗心脏atp水平(针对adp标准化)，提示线粒体功能障碍(a)。预防性地或以治疗性方案施用sul-150减轻心脏能量损失。长期多柔比星施用降低了心脏mtdna拷贝数(b)，这可能是atp损失的基础。sul-150减轻mtdna拷贝数的减少。在多柔比星治疗的大鼠中，mtdna拷贝数与心脏射血分数(ef)相关，表明心脏线粒体质量的维持是心肌收缩性改善的基础(c)。
[0038]
图7表明sul-150在多柔比星应激下维持呼吸复合体iv的活性。将h9c2心脏成肌细胞暴露于多柔比星(1μm)24小时，之后分离它们的线粒体并评估复合体iv活性。多柔比星暴露降低复合体iv活性，其通过用sul-150共处理h9c2心脏成肌细胞而减轻。
v.具体实施方式
[0039]
提供用于治疗或预防射血分数降低的心力衰竭(hfref)的化合物的本发明的目的通过提供用于治疗或预防hfref的如上所示的根据式(i)或(ii)的化合物或其药学上可接受的盐来实现。
[0040]
用根据本发明的苯并二氢吡喃醇、醌或氢醌化合物的治疗或预防优选地是具有一种或多种治疗心力衰竭的常用其他措施的联合疗法的一部分。
[0041]
r1可以是在人体内容易除去的取代基，使得该化合物是前药。r1可以是例如氨基酸衍生物或酯衍生物，并且通常具有低于100道尔顿的分子量。
[0042]
在一个优选的实施方案中，式(i)中的r1是氢或与所述6-氧一起形成具有2-6个碳原子的酯基团。酯可包含一个或多个醚或醇基团。合适的酯是乙酸酯、丁酸酯、3-羟基丁酸酯等。
[0043]
在根据式(i)或根据式(ii)的化合物的一个优选的实施方案中，r2和r3与它们所附接的n原子一起形成具有3-6个碳原子并包含一个另外的n原子的饱和环，该饱和环可以被可包含氧、羧酸或胺基团的1-4个碳原子取代。
[0044]
更优选地，r2和r3与它们所附接的n原子一起形成包含一个另外的胺基团的5-7元环，该环任选地被甲基、乙基或醇取代的甲基或乙基取代。
[0045]
在另一个优选的实施方案中，r2是氢原子并且r3包含具有3-6个碳原子并且具有一个氮原子的环状结构。
[0046]
更优选地，r2是氢原子，并且r3包含含有一个另外的胺基团的5-7元环，该环附接到酰胺-氮上，并且该环任选地被甲基、乙基或醇取代的甲基或乙基取代。
[0047]
在任一情况下，环(由r2和r3形成的环状结构，或仅r3的环状结构)可以是未取代的或被具有1-4个碳原子的烷基、醇或具有1-4个碳原子的烷醇基团(诸如羟乙基)取代。
[0048]
在根据本发明的一个优选的实施方案中，根据式(i)或根据式(ii)的化合物具有低于500da的分子量。
[0049]
在一个优选的实施方案中，根据本发明使用的化合物是根据式i的苯并二氢吡喃醇化合物。
[0050]
某些苯并二氢吡喃醇化合物已描述于wo2014/098586中。详细描述的化合物具有缩写，参见sul-xxx(xxx是2或3位数字)。这些化合物中的许多化合物是外消旋混合物，尽管也已经测试了一些对映体。制备根据本发明的苯并二氢吡喃醇化合物的合适方法描述于wo2014/098586或wo2014/011047中。
[0051]
wo 2017/060432 a1公开了2-羟基-2-甲基-4-(3,5,6-三甲基-1,4-苯醌-2-基)-丁酸的酰胺衍生物和制备此类化合物的方法。
[0052]
通过醌结构的氢化可容易地制备氢化的醌衍生物。
[0053]
根据另一个优选的实施方案，所述化合物是作为外消旋混合物或作为其对映体中的一者的(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮(sul-121)、((s)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基-n-((r)-哌啶-3-基)色满-2-甲酰胺盐酸盐(sul-13)或(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)甲酮(sul-109)或其药学上可接受的盐。
[0054]
在最优选的实施方案中，所述化合物是sul-121的r-对映体，即r-(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮(sul-150)或其药学上可接受的盐。
[0055]
药学上可接受的盐中的抗衡离子可以是本领域已知的抗衡离子。优选地，所述化合物具有至少一个碱性氮，可以质子化的胺。抗衡离子优选地为卤素诸如氯离子、硫酸根、柠檬酸根、甲酸根等，并且最优选地为氯离子。
[0056]
所述化合物作为外消旋混合物或基本上纯的对映体形式是有效的。所述化合物具有一个或多个手性中心，通常为一个或两个。
[0057]
优选地，所述化合物是基本上对映体纯的化合物。基本上对映体纯是约95％对映体过量或更高，更优选约98％对映体过量，以及最优选约99％或更高对映体过量。另外，在化合物含有多于一个手性中心的情况下，这些量适用。
[0058]
所述化合物优选地以有效量使用，以实现hfref的治疗或预防。hfref，其中射血分数为约40％或更低。
[0059]
措辞治疗或预防包括改善心力衰竭的症状和/或减少心力衰竭的进展，包括改善心脏功能诸如心率和心输出量。
[0060]
优选地，根据本发明的化合物用于治疗或预防哺乳动物器官的hfref，其中哺乳动物优选地为人。
[0061]
hfref参照通常来源于超声心动图的左心室射血分数(lvef)进行定量，超过50％-60％的值被认为是正常的。患有射血分数保留的心力衰竭的患者也表现出≥50％的值。低于40％的值被认为是lvef降低(hfref)，并且lvef在40％-49％范围内的患者表示
‘
灰色区域’，其被定义为射血分数轻度降低的心力衰竭(hfmref)。患有hfmref的患者最可能主要具有轻度收缩功能障碍，但也具有舒张功能障碍的特征。
[0062]
本发明提供了用于治疗保留射血分数为50％或更低(hfmref)和约40％或更低(hfref)的hfref的化合物。优选地，用于治疗的化合物用于治疗约40％或更低的保留射血分数的hfref。
[0063]
通常在体液中观察到约1μm的量的效果，但优选地使用更高的量。优选的量是约10μm或更高，更优选地约20μm或更高的体内或体外浓度。通常，在人中约200μm或更低的浓度
应该是足够的和安全的。
[0064]
对于人类使用，这将意味着(假设30l分布容积、100％可用性和约1μm的浓度)约10mg或更多的剂量。优选的量将产生约10μm的浓度，对于该浓度，约100mg或更多的剂量将是合适的。因此，优选地，约20mg或更多、优选地50mg或更多、优选地100mg或更多的剂型是合适的。
[0065]
通常，固体口服剂型含有最多约500mg化合物，优选地约450mg或更少，以允许赋形剂。
[0066]
对于肠胃外施用，例如静脉内，或对于其他液体施用形式，可施用更大的量。
[0067]
可使用的剂量的示例是剂量为0.2mg/kg或更高的本发明化合物的有效量，诸如优选地在约1mg/kg至约100mg/kg的范围内，或在约2mg/kg至约40mg/kg体重内，或在约3mg/kg至约30mg/kg体重内，或在约4mg/kg至约15mg/kg体重内。本发明的化合物可以单一日剂量施用，或者总日剂量可以每天两次、三次或四次的分剂量施用。
[0068]
本文所述的化合物可通过与添加剂诸如药学上或生理学上可接受的赋形剂、载体和媒介物配制而配制为药物组合物。
[0069]
合适的药学上或生理学上可接受的赋形剂、载体和媒介物包括加工剂和药物递送改性剂和增强剂，例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、单糖、二糖、环糊精、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、右旋糖、羟丙基-p-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡等，以及它们的任何两种或更多种的组合。其他合适的药学上可接受的赋形剂描述于“remington
′
s pharmaceutical sciences”，mack pub.co.,new jersey(1991)中。
[0070]
药物组合物优选地包含单位剂量制剂，其中单位剂量是足以具有治疗效果的剂量。单位剂量可以是在治疗或抑制病症的过程中周期性施用的剂量。
[0071]
本发明的化合物可以含有所需的常规无毒的药学上或生理学上可接受的载体、佐剂和媒介物的剂量单位制剂形式经肠、口服、非肠道、舌下、通过吸入(例如作为雾剂或喷雾剂)、直肠或局部施用。如本文所用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、跗骨内注射或输注技术。将所述化合物与适于所需施用途径的药学上可接受的载体、佐剂和媒介物混合。
[0072]
通常，口服施用是优选的施用途径，并且适于口服施用的制剂是优选的制剂。
[0073]
本文所述的化合物可以固体形式、液体形式、气溶胶形式，或以片剂、丸剂、粉末混合物、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、霜剂、溶液剂、栓剂、灌肠剂、结肠灌洗剂、乳剂、分散剂、食物预混物形式以及以其他合适的形式施用。化合物还可以脂质体制剂施用。
[0074]
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性混悬剂可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬剂，例如作为丙二醇的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸诸如油酸可用于注射剂的制备。
[0075]
用于药物的直肠施用的栓剂可通过将药物与合适的非刺激性赋形剂诸如可可脂和聚乙二醇混合来制备，该赋形剂在室温处为固体，但在直肠温度处为液体，并且因此将在直肠中融化并释放药物。
[0076]
用于口服施用的固体剂型可包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂诸如蔗糖、乳糖或淀粉混合。此类剂型还可包含除惰性稀释剂之外的另外的物质，例如润滑剂诸如硬脂酸镁。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。片剂和丸剂还可用肠溶衣制备。
[0077]
用于口服施用的液体剂型可包括含有本领域常用的惰性稀释剂(诸如水)的药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。此类组合物还可包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、环糊精，以及甜味剂、风味剂和芳香剂。
[0078]
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于活性成分所施用的主体和特定施用模式而变化。通常制备和施用所选择的单位剂量以在血液、组织、器官或身体的其他靶向区域中提供确定的药物最终浓度。对于给定情况的有效量可通过常规实验容易地确定，并且在普通临床医生或技术人员的技能和判断范围内。
[0079]
本发明将使用以下实施例进一步说明。在实施例中，参考附图。
[0080]
vi.实施例
[0081]
实施例1
[0082]
在大鼠体内测试根据本发明的化合物用于治疗或预防hfref的有效性。多柔比星(一种用于癌症化疗的蒽环类抗生素)用于在临床前大鼠模型中诱导射血分数降低的心力衰竭(christiansen等人，(2006)eur.j.cardiothorac.surg.30:611-616；ertunc等人，(2009)pharmacology 84:240-248；hayward等人，(2007)j.am.ass.lab.animal sci.46:20-32)。
[0083]
实验
[0084]
将sul-150(250mg)溶解在100％ etoh(1.02ml)中并在蒸馏水(68.7ml)中进一步稀释以获得澄清的10mm溶液。将sul-150溶液均匀地喷涂在标准食物颗粒(1.25kg)上。将食物颗粒风干过夜。每周新鲜制备食物颗粒。食物颗粒中约200mg/kg sul-150，以及350克大鼠每日饮食摄入量为25克，sul-150的日剂量约每天5mg。
[0085]
将250克-300克的雄性远交系wistar大鼠(10-12周龄)保持在12h光照/黑暗循环中，并随意接受含有蒸馏水的标准饮食。三十只大鼠经由腹膜内注射每周施用多柔比星(2mg/kg)，连续9周，并且不进行治疗(标准食物饮食，10只大鼠)，或接受补充有sul-150的饮食作为预防(在第1次多柔比星施用之前，10只大鼠)或治疗(在第6次多柔比星施用之后开始，10只大鼠)。假对照大鼠(8只大鼠)经由腹膜内注射每周施用盐水，连续9周，并接受标准饮食。所有大鼠在第一次多柔比星施用后12周进行心脏功能评估。
[0086]
在麻醉(含异氟烷的o2(fio2 100％))下进行心脏功能测试(pv环评估)，随后进行经口气管插管。将大鼠置于机械啮齿动物呼吸机(harvard apparatus,holliston,massachusetts)中，潮气量为10ml/kg，每分钟呼吸70次。在胸骨下方打开一个小窗口，用一个小切口将2f微尖端压力传导导管(spr-838；millar instruments,houston,tx)通过心尖直接插入左心室(lv)。稳定后，用连接到数据采集系统(powerlab,ad instruments,colorado springs,co)的压力-容积电导系统(mpvssul-ultra,millar instruments,houston,tx)记录信号。
[0087]
在稳态条件下获得平均动脉压(map)、lv搏出功(lvsw)、每搏输出量(sv)、lv舒张期末容积(lvedv)、lv收缩末期压力(lvesp)、平均动脉压与lv收缩末期压力之间的比率
(map-lvesp)、lv射血分数(lvef)、心率(hr)、lv收缩压增量的最大斜率(dp/dt max)和lv压力衰减的时间常数(tau)。
[0088]
对于前负荷动作，压缩下腔静脉并收集数据，以评估前负荷可补充搏出功(prsw)、dp/dt-舒张末期容积关系(dp/dt-edv)、收缩末期和舒张末期p-v关系的斜率(espvr和edpvr)。
[0089]
用来自每只动物的新鲜肝素化温血进行容积校准。另外，在每个实验结束时注射50ml的7.5％高渗盐水用于平行电导容积校准。
[0090]
在graphpad prism 8.0(graphpad software inc,ca)中分析数据。所有结果表示为平均值
±
s.d.(标准偏差)或中值和四分位间隔。通过anova评估组之间的差异，随后与假治疗组和媒介物治疗组进行成对比较，使用fdr校正调整p值进行多重比较。
[0091]
结果
[0092]
图1表明大鼠中的长期多柔比星施用导致心力衰竭的发展，如由心率、射血分数和搏出功的降低所指示，最终导致心输出量的严重降低(*指示相对于假治疗组p《0.05)。图1进一步表明，在施用多柔比星之前经由食物颗粒施用sul-150(预防组)，基本上保留了心脏功能并且很大程度上保持了射血分数和心输出量(指示相对于多柔比星治疗组p《0.05)。与非治疗组相比(与多柔比星治疗组相比p《0.05)，在6次累积多柔比星施用之后经由食物颗粒施用sul-150(治疗组)显著改善了心脏功能，并且参数与预防组所获得的这些参数没有差异，证明sul-150是心力衰竭的治疗剂。
[0093]
表1表明多柔比星诱导的心力衰竭表现为射血分数降低的心力衰竭(hfref)，并且特征在于收缩和舒张能力均下降，指示心脏组织内的重塑或纤维发生。
[0094]
在预防或治疗方案中施用sul-150保持收缩能力(即，dp/dtmax，收缩效率)和舒张能力(即，tau)，不希望受理论的束缚，这表明sul-150抑制心脏纤维发生或增加收缩能量。
[0095]
结论
[0096]
多柔比星诱导的心力衰竭的特征在于心脏收缩的减少和由此心输出量的降低。用6-苯并二氢吡喃醇sul-150治疗显著改善心脏收缩功能并因此改善心输出量。
[0097][0098][0099]
实施例2
[0100]
实施例2在体外实验中表明，与trolox和一些其他不是根据本发明的trolox衍生物相比，根据本发明的几种不同化合物具有改善的功效。
[0101]
心室肥大是血流动力学应激状况(诸如高血压和瓣膜病)的严重恶化，其与射血分数降低的心力衰竭(hfref)直接相关。
[0102]
心力衰竭中的心室肥大可归因于心脏质量增加和不对称室间隔增厚。组织学标志包括心肌细胞大小的增加(即，心肌细胞肥大)、肌细胞排列紊乱(肌原纤维紊乱)以及血管周围和间质纤维化，这是许多心肌病中的常见表型。
[0103]
病理性心肌细胞肥大的特征是基因表达谱的转换，包括胎儿心肌肌球蛋白重链-β(mhc-β)代替成人主要α同种型(mhc-α)、骨骼α肌动蛋白(ska)和心房利钠因子(anf)基因的上调。另外，心肌细胞转换为碳水化合物依赖性能量机制而不是脂肪酸氧化，这又需要改变代谢基因的表达水平。有趣的是，两种病理生理学适应都与creb、jnk、nfκb和nfat下游的转录活性增加相关。
[0104]
用于研究心肌细胞肥大和筛选推定的心肌细胞肥大的小分子抑制剂的体外测定
利用充分表征的肥大诱导剂(例如，去氧肾上腺素或il-6)与在心肌细胞肥大期间上调的典型基因的转录组学筛选和心肌细胞表面积的定量相结合。然而，这些测定对于快速筛选更大的一组小分子是费力且耗时且不允许的。
[0105]
间接定量蛋白质合成和心肌细胞大小的替代方法是在标准细胞巨化病毒(cmv)增强子/启动子元件的控制下定量增强型绿色荧光蛋白(egfp)的表达[vettel,2012]。cmv启动子含有creb、nfκb和nfat的多个功能性结合位点。因此，体外心肌细胞表达egfp可用作高通量平台来筛选抑制心肌细胞肥大的小分子[vettel,2012]，并且可能在治疗心力衰竭中具有临床功效。
[0106]
测试了以下化合物(表2)表2
[0107]
[0108][0109]
实验设计
[0110]
h9c2心肌细胞培养和分化
[0111]
将大鼠h9c2心脏成肌细胞(atcc crl-1446)维持在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液(sigma-aldrich)的dmem培养基中，并在培养物达到70％汇合时传代。在实验之前，通过血清减少(至1％)并用20nm视黄酸刺激5天，将h9c2成肌细胞分化为心肌细胞。对于所有实验，以0.6
·
105个细胞/cm2接种分化的h9c2心肌细胞。
[0112]
细胞大小的测定
[0113]
将h9c2心肌细胞血清饥饿24h，然后再暴露于不同浓度的去氧肾上腺素(剂量范围2
·
10-5
至1
·
10-11
m)24h。将细胞在冰冷的pbs中洗涤，并在室温处通过含2％多聚甲醛的pbs固定10min。将固定的细胞与5μm罗丹明缀合的鬼笔环肽(thermofisher scientific)温育并用pbs充分洗涤。用zeiss axioobserver z1显微镜随机拍摄荧光照片，并用cellprofiler软件分析细胞大小[mcquin,2018]。
[0114]
egfp合成的定量作为细胞大小的替代。
[0115]
将h9c2心肌细胞(0.6
·
105个细胞/cm2)在无血清培养基中用cmv-copgpf(moi 10)感染24h。将h9c2心肌细胞与30μm sul化合物在标准培养条件下预温育30min，然后用去氧肾上腺素(剂量范围2
·
10-5
至1
·
10-11
m)再刺激24h。然后，将h9c2心肌细胞在每孔100μl软裂解缓冲液(25mm tris、2mm二硫苏糖醇、2mm edta、1％ triton x-100，ph 7.4)中裂解并且获得的上清液的荧光强度在配备有fitc滤波器组(激发488nm，10nm带宽；发射515，具有20nm带宽)的clariostar plus平板读取器(bmg labtech)中记录。
[0116]
统计学评估
[0117]
所有实验在每个条件下一式三份进行并取平均值。从两个单独的实验获得的数据用于在graphpad prism 8.0(graphpad software inc,ca)中评估。使用线性回归将平均h9c2心肌细胞大小与平均egfp水平相关联。使用基线水平为0％和最大egfp记录为100％，将去氧肾上腺素诱导的egfp合成标准化。将所有数据集标准化为媒介物对照。4参数非线性回归用于确定去氧肾上腺素诱导gfp合成的效力的功效。sul化合物抑制去氧肾上腺素诱导的egfp合成的功效计算为100％-e
max
，其中emax是由去氧肾上腺素引起的最大效应。
[0118]
结果
[0119]
egfp合成与h9c2心肌细胞肥大相关
[0120]
根据已建立的方案使h9c2心脏成肌细胞分化成心肌细胞，并用增加剂量的去氧肾上腺素(1
·
10-11
至2
·
10-5
m)刺激以诱导心肌细胞肥大24h。去氧肾上腺素剂量依赖性地(ec
50
为7.4
·
10-10
)将h9c2心肌细胞表面积从媒介物处理的对照心肌细胞中的791
±
263μm2增加至暴露于2
·
10-5
m去氧肾上腺素的心肌细胞中的3278
±
296μm2(图2a)。类似地，去氧肾上腺素剂量依赖性地增加用cmv-egfp慢病毒颗粒转化的h9c2心肌细胞中的egfp荧光(ec
50
为5.2
·
10-9
m)(图2b)。h9c2心肌细胞表面积的增加与egfp的表达相关(r2为0.5601，p《
0.001；图2c)。类似于细胞表面积的增加，去氧肾上腺素剂量依赖性地增加h9c2心肌细胞的蛋白质合成(ec
50
为5.5
·
10-10
；图2d)，其也与增加的egfp荧光相关(r2为0.5734，p《0.0001；图2e)。添加广泛有效的蛋白质合成抑制剂布雷菲德菌素a抑制去氧肾上腺素诱导的egfp荧光的增加(图2f)，表明egfp是在去氧肾上腺素刺激后新合成的。由此，验证了实验设置。
[0121]
sul化合物抑制h9c2心肌细胞肥大反应
[0122]
去氧肾上腺素剂量依赖性地诱导h9c2心肌细胞中egfp的表达(图3a-h，灰线)。h9c2心肌细胞与30μm的sul-11、sul-99、sul-127、sul-13、sul-138、sul-138m2、sul-150或sul-151的预培育降低了由去氧肾上腺素诱导的egfp的表达。然而，根据本发明的化合物(sul-13、sul-138、sul-150或sul-151)清楚地显示增加的效力和功效(表2)。值得注意的是，sul-138的初级代谢物sul-138m2与sul-138相比具有抑制egfp表达的功效，表明sul-138可在该实验中充当前药。此外，(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-基)(哌嗪-1-基)甲酮的r-对映体和s-对映体sul 150和sul-151分别在抑制h9c2心肌细胞的egfp表达方面具有相当的功效(分别为图2g和h)。
[0123]
结果进一步总结在表3中
[0124][0125]
实施例3
[0126]
在发现实施例1的意料不到的结果之后设计以下实验。以下发现可用于理解为什么要求保护的sul型化合物在治疗射血分数降低的心力衰竭中是有效的。
[0127]
在该实施例3中，表明dox诱导的心力衰竭与心脏纤维发生(增加的胶原沉积)和氧化应激(增加的脂质过氧化)重合，其可能来源于线粒体功能障碍(降低的心脏mtdna拷贝数和atp产生)。
[0128]
在预防性或治疗性模型中施用的sul-150减轻了这些病理过程并将心脏线粒体功能维持在稳态水平。在分离的线粒体中，sul-150减轻dox诱导的呼吸复合体iv活性的降低，这被认为是观察到的治疗效果的潜在机制。
[0129]
实验设计
[0130]
sul-150食物颗粒的制备
[0131]
将sul-150(250mg)溶解在100％ etoh(1.02ml)中并在蒸馏水(68.7ml)中进一步稀释以获得澄清的10mm溶液。将sul-150溶液均匀地喷涂在标准食物颗粒(1.25kg)上。将食物颗粒风干过夜。每周新鲜制备食物颗粒。食物颗粒中约200mg.kg-1
sul-150，以及350克大鼠每日饮食摄入量为25克，sul-150的日剂量约5mg.天-1
。
[0132]
动物程序
[0133]
将250克-300克的雄性远交系wistar大鼠(10-12周龄)保持在12h光照/黑暗循环中，并随意接受含有蒸馏水的标准饮食。三十只大鼠经由腹膜内注射每周施用多柔比星(2mg.kg-1
)，连续9周，并且不进行治疗(标准食物饮食，10只大鼠)，或接受补充有sul-150的饮食作为预防(在第1次多柔比星施用之前，10只大鼠)或治疗(在第6次多柔比星施用之后开始，10只大鼠)。假对照大鼠(8只大鼠)经由腹膜内注射每周施用盐水，连续9周，并接受标准饮食。所有大鼠在第一次多柔比星施用后12周进行心脏功能评估。
[0134]
实验方案
[0135]
对于心脏功能测试(pv环评估)的结果，参考上述实施例1。
[0136]
心脏纤维化
[0137]
将用于组织病理学的心脏组织样品固定在3.6％福尔马林中并石蜡包埋。制备4μm厚的心脏组织切片，并使用天狼星红染色，并按照制造商的说明书用weighert的苏木精(均为sigma-aldrich,st.louis,mo)复染。将样品在nanozoomer s60数字载玻片扫描仪(hammamatsu photonics)上成像，并使用aperio imagescope(leica biosystems,nussloch,germany)定量左心室间质纤维化(即，非血管周围纤维化)。
[0138]
心脏氧化应激
[0139]
使用tissueruptor ii(qiagen,hilden,germany)将心脏组织样品在ddh2o中匀浆，随后在20khz处超声处理3
×
1min(sonopuls 2000,bandelin,berlin,germany)并以14000g离心以沉淀不溶性蛋白质。上清液用于评估abts自由基脱色的自由基清除活性，如re等人[14]所述，根据ohkawa等人[15]通过评估对硫代巴比妥酸的反应性的脂质过氧化。
[0140]
心脏线粒体拷贝数
[0141]
将心脏组织样品在含有50u
·
ml-1
rna酶i和100u
·
ml-1
蛋白酶k(均为thermofisher,walthham,ma)的裂解缓冲液(100mm nacl，10mm edta，含0.5％ sds的20mm tris-hcl，ph 7.4)中均浆。在55℃处温育过夜后，使用2-丙醇沉淀总dna。在viia7实时pcr系统(thermofisher,waltham,ma)上使用itaq universal sybr(bio-rad,hercules,ca)和特异于线粒体dna(mt-nd1；有义5
′‑
cctcctaataagcggctcct-3
′
，反义5
′‑
ggcggggattaatagtcaga-3
′
)或核dna(ndufa1；有义5
′‑
atggcccgaaccaagcagacc-3
′
，反义5
′‑
ttaagctctctccccccgtatccg-3
′
)的引物来扩增5ng总dna的等分试样。mtdna拷贝数计算为：mtdna＝2
×2cq(ndufa1)
–
cq(mt
–
nd1)
。
[0142]
心脏atp/adp比率
[0143]
使用tissueruptor ii(qiagen,hilden,germany)将心脏组织样品在tris-饱和苯酚(ph 7.4)中匀浆以提取腺苷并通过离心经氯仿:水(1:1v/v)分离。通过hplc进行核苷酸分离以及atp和adp浓度的测量。通过将100μl样品注入反相色谱c18柱中进行分离。柱温保
持在25℃。流动相为70％乙腈:30％75mmol l-1kh2po4(v/v)，并且流速为1ml/min。在260nm的波长处检测洗脱的核苷酸。使用每个标准核苷酸峰面积的校准曲线计算洗脱液的核苷酸浓度。atp浓度相对于每个样品中的adp浓度进行标准化。
[0144]
呼吸复合体iv活性
[0145]
在标准细胞培养条件下，在存在或不存在1μm sul-150的情况下，将h9c2心脏成肌细胞暴露于1μm dox持续24h。使用密度梯度离心法，使用线粒体分离试剂盒(cayman chemical#701010,ann arbor,mi)，根据制造商的说明书分离线粒体，并通过测量细胞色素c的氧化速率来评估线粒体复合体iv(细胞色素c氧化酶)的活性，该氧化速率通过550nm处吸光度的增加来反映(cayman chemical#700990,ann arbor,mi)。
[0146]
统计学评估
[0147]
在graphpad prism 8.0(graphpad software inc,ca)中分析数据。所有结果表示为平均值
±
s.d.或中值和四分位间隔。通过anova评估组之间的差异，随后与假治疗组和媒介物治疗组进行成对比较，使用fdr校正调整p值进行多重比较。
[0148]
结果
[0149]
sul-150施用似乎减少多柔比星诱导的心力衰竭的大鼠模型中的心脏纤维化
[0150]
大鼠中的长期多柔比星施用导致心力衰竭的发展，如由心率、射血分数和搏出功的降低所指示，最终导致心输出量的严重降低。此外，长期多柔比星施用引起左心室间质中的纤维发生反应，如通过增加的胶原沉积所指示(图4)。在施用多柔比星之前(预防组)或在6次累积多柔比星施用之后(治疗组)，经由食物颗粒施用sul-150维持心脏功能(如上所示)并阻断该纤维发生反应(图4)。
[0151]
sul-150施用似乎减轻心脏氧化应激而不影响心脏抗氧化能力
[0152]
心力衰竭与心脏组织中氧化应激增加相关，这可能由氧化自由基清除能力和氧化自由基产生的不平衡引起。长期多柔比星施用后心脏氧化应激是明显的，如通过增加的脂质过氧化产物(tbars，图5a)所指示。在预防或治疗方案中施用sul-150减轻心脏脂质过氧化(图5a)，提示心脏氧化应激降低。
[0153]
长期多柔比星施用(图5b)和预防性或治疗性施用sul-150(图5b)使心脏自由基清除活性保持不变，表明自由基产生增加而不是清除能力降低是所观察到的氧化应激增加的基础。
[0154]
sul-150施用维持心脏线粒体拷贝数并使心脏能量状态正常化
[0155]
心力衰竭与心脏能量损失、线粒体功能障碍的发展和线粒体质量通过线粒体自噬的损失相关，从而导致收缩功能障碍。实际上，长期多柔比星施用降低了可用于收缩的心脏atp含量(图6a)，这通过预防性或治疗性施用sul-150而减轻。
[0156]
线粒体dna(mtdna)拷贝数可用作线粒体质量的替代标记，并且线粒体质量的降低可能是在长期多柔比星施用之后发生的能量消耗的基础。长期多柔比星施用降低了心脏mtdna拷贝数(图6b)，这被sul-150的施用所排除。值得注意的是，在多柔比星治疗的动物中，mtdna拷贝数与心脏射血分数正相关(r2＝0.454，p＝0.033；图6c)，表明较高的线粒体负荷对应于较好的心脏收缩性。
[0157]
sul-150减轻分离的心脏线粒体中多柔比星诱导的呼吸复合体iv活性的降低
[0158]
已经显示sul化合物通过呼吸复合体iv的活化来增加线粒体功能，其可以被多柔
比星抑制。实际上，当h9c2心脏成肌细胞暴露于多柔比星(1μm，24h)时，呼吸复合体iv的活性显著降低(图7)。h9c2心脏成肌细胞与多柔比星和sul-150(均1μm，24h)的共温育维持了复合体iv活性，这可能解释在sul-150治疗的大鼠中观察到的atp产生增加。有趣的是，在未处理的对照h9c2心脏成肌细胞中，sul-150(1μm，24h)的施用不改变呼吸复合体iv的活性。
[0159]
结论
[0160]
已知化学治疗剂多柔比星具有心脏毒性作用，最终导致射血分数降低的心力衰竭(hfref)。
[0161]
实施例1表明，尽管施用多柔比星，6-苯并二氢吡喃醇sul-150(预防性或治疗性施用)仍维持心脏收缩功能并因此维持心输出量。
[0162]
实施例2表明，所要求保护的sul-150的类似物在预防心室肥大中也是有效的；并且值得注意的是比不是根据本发明的其他trolox型化合物更有效，这表明这些要求保护的化合物也可用于治疗hfref。
[0163]
实施例3表明，多柔比星诱导的心力衰竭与心脏氧化应激增加、能量消耗和线粒体质量损失重合。预防性或治疗性地施用sul-150可能通过维持呼吸复合体iv活性而意外地排除了这些病理变化。