作为衰老治疗剂的包含水飞蓟提取物的组合物的制作方法

本发明涉及组合物作为衰老治疗剂用于减少存在于皮肤中的组织中的细胞衰老的(美容)用途，所述组合物包含或由已从中去除种子的水飞蓟(silybummarianum)花提取物组成，所述提取物按重量包含基于干提取物的总重量小于0.1％的水飞蓟素。此外，本发明涉及组合物，所述组合物包含或由已从中去除种子的水飞蓟花提取物组成，所述组合物作为衰老治疗剂用于治疗或预防存在于皮肤中的组织中的与细胞衰老相关的病症的方法。因此，本发明涉及活性成分及其用途，所述活性成分由已从中去除种子的水飞蓟花提取物组成，所述提取物按重量包含基于干提取物的总重量小于0.1％的水飞蓟素。特别地，本发明涉及已从中去除种子的水飞蓟花提取物，所述提取物按重量包含基于干提取物的总重量小于0.1％的水飞蓟素，所述组合物作为衰老治疗活性成分用于预防和/或治疗组织内年龄相关的或与应激相关的衰老细胞；和/或用于治疗组织内的与细胞衰老相关的病症；更一般地用于延迟和/或预防组织和组织退化迹象的出现。

背景技术：

1、细胞衰老是一个生理过程和肿瘤抑制细胞命运，其特征是永久和不可逆的细胞周期停滞以及获得促炎和蛋白水解分泌组。时程老化通常与衰老细胞(包括皮肤细胞)的增加相关。事实上，皮肤是人体的第一道屏障。它保护器官免受温度和湿度差异以及外部环境的攻击。然而，过度的化学和物理刺激会恶化皮肤的正常功能，并诱导皮肤老化。

2、皮肤老化是一个由内部因素(例如：时间、遗传因素、激素)和外部因素(例如，紫外线(uv)暴露、污染)驱动的多因素过程。内在或时程老化的特征包括可见的迹象，例如皮肤变薄和干燥、细纹、弹性降低、异常色素沉着、毛发灰白和脱发。

3、其中，表皮变薄导致基底角质形成细胞增殖和更新能力下降。除表皮外，真皮上皮连接处(dej)和真皮也常常变薄。位于真皮内的成纤维细胞产生细胞外基质(ecm)，为皮肤提供结构完整性和弹性。在老化过程中，ecm通常经历结构改变和退化，导致皱纹增加和皮肤弹性丧失。在成人组织中，衰老作为防御机制在细胞损伤时被激活，不仅可以对抗导致癌症的致癌无限增殖信号，还可以促进许多细胞类型中响应多样化应激的正常生物体老化的生理过程。细胞衰老通常通过三个顺序的过程促进组织重塑：稳定的增殖停滞、募集免疫细胞并改变细胞外基质的sasp，以及动员附近的祖细胞重新填充组织。

4、在与年龄相关的皮肤改变过程中描述衰老的标志物。其中，1型纤溶酶原激活物抑制剂1(pai-1)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在衍生自早衰综合征患者和时程老化的供体的真皮成纤维细胞中升高。此外，衰老标志物研究报告，pai-1是细胞周期阻滞的介质，通过其在触发基本细胞周期检查点p53下游的衰老中的作用。

5、衰老细胞表现出特征性的形态特征、衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)的高活性、衰老相关分泌表型(sasp)(例如细胞因子和基质金属蛋白酶)的增加、核纤层蛋白b1表达减少以及核hmgb1易位到细胞质中(wang和dreesen，2018：frontiers in genetics，vol.9，article 247)。此外，永久生长停滞是由端粒缩短和由增强的p53活性、增加的p21和p16ink4a-rb表达引发的细胞周期阻断所驱动的(lozano-torres等人，2019：naturereviews in chemistry，vol.3，pages 426-441)。

6、除了增殖能力的丧失，衰老细胞通常通过激活被称为衰老细胞抗凋亡通路(scap)的各种机制来增强存活和抗凋亡。这些通路与许多特征直接相关，其中有生长停滞、代谢重编程、内在和外在凋亡通路。

7、衰老细胞发挥多效性作用，这可以通过其分泌一批炎性细胞因子(例如：il-1α、il-1β、il-6、il-8、(γ-hmgb1)、趋化因子(例如，cxcr2)、生长因子(例如：igfbp7)和蛋白酶(例如称为sasp的金属蛋白酶(例如基质金属蛋白酶(mmp-1和mmp-3))的能力来解释。根据生理背景，sasp分泌可能是有益的或有害的，特别是当持续衰老的细胞通过损害组织稳态而对周围微环境产生负面影响时。事实上，一些sasp组分(例如il-6和il-8)可以通过分泌的和膜结合的il-1α介导的自分泌通路增强saga(衰老相关的生长停滞)。然而，相同的分泌组分可以作用于旁分泌信号传导到邻近细胞，传播衰老表型，从而潜在地阻碍周围组织的再生能力。此外，sasp细胞因子促进免疫细胞的浸润，导致持续的慢性炎症，这是衰老的特征和年龄相关的功能异常的主要原因。在体内，在痣黑素细胞中检测到il-6升高，而在时程老化和光老化的皮肤中检测到mmp，mmp负责细胞外基质(ecm)的分解。在衰老细胞中，hmgb1从细胞核易位到细胞质和细胞外空间，促进sasp因子(包括il-1β、il-6和mmp-3)的释放。sasp分泌与衰老相关，并可能与细胞周期阻滞分离。事实上，对原代人类成纤维细胞的研究表明，dna损伤独立于p16ink4a水平导致sasp。sasp转录的一个关键因素是转录因子nf-kb的磷酸化，所述转录因子易位到细胞核，在那里它与几个sasp基因的启动子结合。

8、“senolytic”通常被理解为能够选择性杀死衰老细胞的药剂，是在临床前体内模型中成功测试的第一种潜在的衰老疗法。换言之，当药剂的活性包括特异性诱导或促进组织中衰老细胞的细胞死亡，特别是凋亡细胞死亡时，该药剂被认为具有senolytic活性。现已鉴定出几种senolytic药剂，包括槲皮素，其抑制pi3k通路并作用于bcl-2家族、p53/p21；达沙替尼，其干扰依赖性受体efnb；abt-763；和navitoclax，也称为abt-263，其靶向bcl-2/bcl-xl蛋白。其他senolytic药剂是肽foxo4-d-retro inverso和17-dmag(阿螺旋霉素)。这种senolytic药剂能够通过诱导细胞凋亡过程选择性地杀死衰老细胞，但不能杀死非衰老细胞或正常细胞。迄今为止，对选择性杀死衰老细胞的药剂的研究仅集中在单一化合物上，但对例如植物提取物等化合物的混合物的研究很少。

9、“senomorphic”通常被理解为抑制衰老标志物或其分泌表型而不诱导细胞凋亡的药剂，通过与senolytic不同的机制提供senomorphic效应。换言之，当药剂的活性包括抑制组织中衰老细胞的衰老表型时，该药剂被认为具有senomorphic活性。

10、根据文献，上述senolytic药剂未被描述为能够对衰老细胞施加senomorphic活性。

11、根据上述所引用的，预防衰老细胞在组织内发生或积累似乎是预防或治疗由衰老细胞导致的与年龄相关的或与应激相关的组织退化的一种目的策略。事实上，衰老成纤维细胞占总皮肤细胞的20-60％。然而，阻断p16ink4a和p53或激活端粒酶以延长细胞的增殖能力必然会导致癌症风险增加。此外，衰老成纤维细胞分泌的mmp-1和mmp-3或促炎细胞因子(例如il-6和il-8)被称为sasp，所述sasp在ecm降解中发挥关键作用，导致皮肤状况恶化。因此，应考虑采取平衡的方法，确保防止衰老细胞数量的增加，并且同时限制细胞增殖能力的扩展，以对抗组织中与年龄相关的和与应激相关的细胞衰老。

12、此外，选择性地消除衰老细胞可以增加寿命并且可以提高健康寿命，并且可能有利于广泛的疾病治疗和预防(gonzález-gualda等人，2020，aging cell.2020；19：e13142)。这些发现提供了抑制衰老细胞是对抗衰老过程和组织退化的良好靶标的合理性。因此，一种可信的方法是选择性地消除衰老细胞和/或调节其功能，特别是sasp。

13、本领域已知一些衰老治疗剂，包括senolytic药剂和senomorphic药剂。

14、us-a 2019/054097公开了许多相当复杂的合成小分子senolytic药剂，类似于abt-263，它们选择性地杀死衰老细胞。这些化合物能够干扰抗凋亡bcl-2通路(癌症中也涉及)。wo 2020/122392公开了相当复杂的免疫抑制剂唑罗莫司，它是西罗莫司(雷帕霉素)的衍生物，用作恢复衰老细胞的senomorphic药剂。wo 2020/132053公开了达沙替尼和槲皮素作为衰老治疗剂用于治疗肥胖诱导的神经精神病症(例如焦虑症)。这些治疗剂可能会产生严重的不期望的副作用。

15、us-a 2020/121620教导了用于杀死衰老细胞的senolytic药剂，重点是通常用于其他领域治疗应用的合成小分子药物。kr-a 2020/0072924还教导了用于杀死衰老细胞(包括成纤维细胞)的senolytic药剂。

16、前述这些药剂和包含这些药剂的组合物的缺点是它们集中于特定药剂。它们通常是合成起源的，具有相当复杂的化学结构，需要大量的努力才能获得，并且具有严重的不期望的副作用。

17、因此，期望获得具有天然起源的、具有减少的不期望的副作用并且可以在少量努力下获得的衰老治疗剂的其他组合物。

18、自然界提供了多种基于植物的药剂和组合物，包括植物提取物。

19、水飞蓟(silybum marianum)植物传统上被认为对改善肝功能、降低总胆固醇量、治疗糖尿病、预防晕动病和心脏病有效。水飞蓟有时也被称为“(福)乳蓟”(“(blessed)milkthistle”)。另一方面，“乳蓟(milk thistle)”这个名称是模糊不清的。它可以指不同的物种，如毒莴苣(lactuca serriola)、各种苦苣菜属(sonchus)物种(例如，花叶滇苦菜(sonchus asper)、苣荬菜(sonchus arvensis)、苦苣菜(sonchus oleraceus))和水飞蓟。

20、它也被认为可以改变皮肤的外观。ep-b 1 845 935教导了化合物水飞蓟素或异水飞蓟宾(isosilybin)可以具有多种效果，包括影响毛发和皮肤的色素沉着。ep-b 2 658522教导了具有抗氧化剂效果和减少细胞应激因子的水飞蓟和罗汉果(momordicagrosvenori)提取物的组合的局部施用。us-a 2010/316743教导了与许多其他药剂相比，乳蓟提取物可以用于促进对晚期糖基化终产物(age)形成的抑制。cn-a 103961276教导了与许多其他植物提取物相比，乳蓟提取物用于抗糖基化美容组合物。cn-b 104382833教导了植物肽溶液，其可能特别含有作为抗皱和皮肤改善剂的乳蓟提取物。jp-a 2002/034505教导了具有减少的苦味并且含有多糖和可从乳蓟中提取的水飞蓟素的食品组合物。us-a2019/175677教导了包含少于0.2％的水飞蓟素的水飞蓟瘦果提取物，用于治疗痤疮、皮脂溢、脂溢性皮炎和/或酒糟鼻。wo 2014/151891公开了含有植物提取物(包括乳蓟提取物)的nrf2活化剂。该文件还提到了水飞蓟种子提取物，其可能按重量含有80％的水飞蓟素作为活性成分。ep-b 0 180 505教导了可以从乳蓟中提取以获得抗炎效果的水飞蓟素。似乎没有考虑到衰老治疗的用途，特别是逐渐形成的senolytic和/或senomorphic活性(即靶向组织内的衰老细胞)。kr-a 20200063855教导了一种无种子的水飞蓟花的水合乙醇提取物，用于促进黑色素产生、预防白癜风、毛发变白和色素沉着不足。然而，没有公开上述的衰老治疗效果。水飞蓟花的水合乙醇提取物含有水飞蓟宾(水飞蓟素的主要组分)，被描述为通过清除自由基来抑制皮肤内糖化蛋白的形成(胶原蛋白和弹性蛋白的保护)(seoungwoo shin等人，molecules 2015，20，3549-3564；doi:10.3390/molecules20033549)。

21、对于天然起源的、具有低不期望的副作用并且可以在少量努力下获得的衰老治疗组合物仍然有未满足的需求。

技术实现思路

1、令人惊讶的是，已经发现了无种子的水飞蓟花提取物可以用作衰老治疗剂。此外，令人惊讶地发现，包含(或甚至由其组成)至少一种无种子的水飞蓟花提取物的组合物作为衰老治疗剂可以用于减少组织中的细胞衰老，并且用于治疗或预防存在于皮肤中的组织中的与细胞衰老相关的病症。

2、因此，本发明涉及已从中去除种子的水飞蓟花提取物作为衰老治疗剂的(任选地，美容)用途。

3、本发明还涉及美容皮肤和头皮护理方法，用于预防和/或治疗皮肤和毛囊中与年龄相关的或与应激相关的衰老细胞；和/或通过在需要的皮肤或头皮上施用至少有效量的已从中去除种子的水飞蓟花提取物，治疗皮肤和毛囊中的与细胞衰老相关的病症，所述提取物按重量包含基于干提取物的总重量小于0.1％的水飞蓟素、或小于0.01％的水飞蓟素、或小于0.001％的水飞蓟素、或0％的水飞蓟素；或涉及包含至少所述提取物的组合物。

4、本发明的第一方面涉及包含(或由其组成)已从中去除种子的水飞蓟花提取物的组合物的(任选地，美容)用途，所述提取物按重量包含基于干提取物的总重量小于0.1％的水飞蓟素、或小于0.01％的水飞蓟素、或小于0.001％的水飞蓟素、或0％的水飞蓟素，所述组合物作为衰老治疗剂用于减少存在于皮肤中的组织中的细胞衰老。

5、因此，本发明还涉及用于减少组织中细胞衰老的方法(其任选为美容方法)，所述方法包括向所述组织施用足量的组合物作为衰老治疗剂，所述组合物包含(或由其组成)已从中去除种子的水飞蓟花提取物，所述提取物按重量包含基于干提取物的总重量小于0.1％的水飞蓟素、或小于0.01％的水飞蓟素、或小于0.001％的水飞蓟素、或0％的水飞蓟素。

6、因此，本发明还涉及用于减少受试者皮肤中存在的组织中细胞衰老的方法(其任选为美容方法)，所述方法包括向所述受试者的所述组织施用组合物作为衰老治疗剂，所述组合物包含(或由其组成)已从中去除种子的水飞蓟花提取物，所述提取物按重量包含基于干提取物的总重量小于0.1％的水飞蓟素、或小于0.01％的水飞蓟素、或小于0.001％的水飞蓟素、或0％的水飞蓟素。

7、本发明的进一步的方面涉及包含或由已从中去除种子的水飞蓟花提取物组成的组合物，所述提取物按重量包含基于干提取物的总重量小于0.1％的水飞蓟素、或小于0.01％的水飞蓟素、或小于0.001％的水飞蓟素、或0％的水飞蓟素，所述组合物作为衰老治疗剂，用于治疗或预防存在于皮肤中的组织中的与细胞衰老相关的病症的方法。

8、因此，本发明还涉及包含已从中去除种子的水飞蓟花提取物的组合物，所述提取物按重量包含基于干提取物的总重量小于0.1％的水飞蓟素、或小于0.01％的水飞蓟素、或小于0.001％的水飞蓟素、或0％的水飞蓟素，所述组合物作为衰老治疗活性成分，用于预防和/或治疗存在于皮肤中的组织中的与年龄相关的或与应激相关的衰老细胞；和/或用于治疗所述组织中与细胞衰老相关的病症。

9、因此，本发明还涉及用于治疗或预防存在于皮肤中的组织中的与细胞衰老相关的病症的方法，所述方法包括向所述组织施用足量的组合物作为衰老治疗剂，所述组合物包含(或由其组成)已从中去除种子的水飞蓟花提取物，所述提取物按重量包含基于干提取物的总重量小于0.1％的水飞蓟素、或小于0.01％的水飞蓟素、或小于0.001％的水飞蓟素、或0％的水飞蓟素。

10、因此，本发明还涉及用于治疗或预防受试者皮肤中存在的组织中的与细胞衰老相关的病症的非治疗方法，所述方法包括向所述受试者的所述组织施用足量的组合物作为衰老治疗剂，所述组合物包含(或由其组成)已从中去除种子的水飞蓟花提取物。

11、因此，本发明还涉及用于治疗或预防受试者中与细胞衰老相关的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用足量的组合物作为衰老治疗剂，所述组合物包含(或由其组成)已从中去除种子的水飞蓟花提取物。

12、本发明还涉及已从中去除种子的水飞蓟花提取物的美容用途，或包含至少所述提取物的组合物，所述组合物作为抗衰老治疗活性成分，旨在预防和/或治疗组织中(优选地在皮肤和毛囊中)与年龄相关的或与应激相关的衰老细胞；和/或治疗组织中(优选地在皮肤和毛囊中)与衰老细胞相关的疾病。

13、已经发现，与现有技术中描述的那些相比，本发明的无种子的水飞蓟花提取物对不同的组织产生了新的有益效果。事实上，已经证明，已从中去除种子的水飞蓟提取物首先能够选择性地杀死衰老细胞(例如，皮肤和毛囊细胞)。因此，发现所述水飞蓟提取物具有senolytic活性。其次，这种提取物被发现可以调节衰老细胞的表型，并且帮助那些细胞摆脱这些有害细胞。因此，发现所述水飞蓟提取物具有senomorphic活性。这可能包括sasp分泌的调节。还可能涉及那些衰老细胞的增殖能力。