治疗和预防痴呆的生物因子的制作方法

本发明涉及用于治疗和预防痴呆症(疾病)和线粒体功能障碍的制剂(特别是药物制剂或食物增补剂)及其用途，其包含生物因子的组合。

背景技术：

0、现有技术

1、痴呆症在世界卫生组织(who)第五章“精神和行为障碍”的icd-10(疾病和相关健康问题的国际统计分类，第10次修订本(2019年)中归类为f00-f03，且是一种由大脑慢性或进行性疾病引起的综合征，伴有多种较高级皮层功能紊乱，包括记忆、思维、定向、感知、计算、学习能力、语言和判断能力。意识没有被蒙蔽。认知障碍通常伴随着情绪控制、社交行为或动机的变化。这种综合征发生在阿尔茨海默病、脑血管疾病和其他主要(直接)或次要(间接)影响大脑的疾病中(另见“痴呆症：a public health priority"(2012)(https://www.alz.co.uk/who-dementia-report))。

2、阿尔茨海默氏痴呆症(ad)是最常见的痴呆症，影响着全球60％以上的痴呆症患者。ad的病理学主要特征是形成由aβ肽和神经原纤维聚集体组成的老年斑或淀粉样斑块，其伴有突触和神经元变性和胶质细胞增生，其中微管过度磷酸化与tau-蛋白(mapt)有关。aβ肽是由位于神经元细胞壁的前体蛋白“淀粉样前体蛋白”(app)中至少两种不同蛋白酶的活性产生的。在app的蛋白水解降解和随后的修饰过程中，形成不同长度和类型的aβ片段。aβ以斑块的形式沉积仍然被认为是疾病症状的至少一个诱因。在血管性(血管依赖性)痴呆中，大脑中的血液循环障碍会导致神经元死亡。例如，它们可能是多次小中风的结果(血管闭塞的结果)，也可能以延迟的方式发生(所谓的“多发性梗死性痴呆症”)。

3、到目前为止，由于神经元死亡而出现并决定痴呆症程度的痴呆症状如ad，最多只能对症治疗，但无法治疗其根源。

4、迄今为止，尚无已知的批准药物可以治愈以致病性脑部疾病引发的(原发性)痴呆症的疾病过程。

5、然而，病程甚至痴呆症的发作可以被延迟或积极地影响。除了降低个体风险(例如避免超重(肥胖)、缺乏运动、吸烟、饮酒、负面压力等)之外，维生素等生物因子尤其可以做出有效贡献，从而应遵循长期和持续的治疗或预防措施。这是申请人研究的主题。

6、ad是一种多因素疾病，其中代谢和炎性并发症的作用似乎越来越重要。只有约2％的ad病例是由淀粉样前体蛋白(app)、早老素1(psen1)和早老素2(psen2)(家族性ad，fad)的体细胞突变引起的，而98％的ad病例是偶发性的(偶发性ad,sad)，仍然未知但病因复杂且多因素[1-3]。迄今为止，全基因组关联研究(gwas)已将载脂蛋白e的等位基因(特别是apoeε4)与发生轻度认知障碍和ad的风险增加联系起来[4,5]。根据gwas识别并与sad的发生相关的其它遗传因素是，例如载脂蛋白j(apoj)、磷脂酰肌醇结合网格蛋白组装蛋白(picalm)、骨髓细胞表达的触发受体2(trem2)、分化簇33(cd33)和补体受体1(cr1)[4-7]。最近，营养不良引起的ad代谢并发症，尤其是在西方国家[8,9]，已被归因为越来越显著的角色。迄今为止，已确定的sad并发症之一是糖尿病(i型或ii型)，这是一种在西方人群中普遍存在的病理状况，目前全世界估计有1.76亿人患有i型(约5-10％的病例))、ii型(约90％的病例)或其他形式的糖尿病，例如妊娠糖尿病[9,10]。ii型糖尿病占全球糖尿病病例的大多数，在老年人中更为普遍，并且与高热量、低质量饮食和久坐不动的生活方式有关——这些情况在西方工业化国家的人群中很常见。这些国家的饮食通常包括廉价的、高度加工的食品，其中含有大量的饱和脂肪、胆固醇和简单的碳水化合物，同时缺乏必需的矿物质、微量元素和维生素[11-14]；例如在西方人群中，特别是在老年人中，镁、锌和维生素b，特别是硫胺素、叶酸或前药如苯磷硫胺和维生素d，通常是慢性缺乏，这种缺乏会从无症状阶段(仅通过实验室可检测)到临床表现出有或物特定症状的缺乏状态，贯穿各个阶段。令人吃惊的是，约80％的ad患者在痴呆症过程中出现葡萄糖耐受不良或糖尿病[15,16]，这表明相互的影响[17]。与此同时，可以看到线粒体功能障碍，这可能是痴呆症的(部分)原因。

7、此外，西方饮食加上缺乏体能活动通常会导致肥胖[14]，且特别是内脏脂肪堆积增加会导致代谢性炎症[18](所谓的“寒性炎症(kalte entzündung)”)，从而导致释放来自浸润巨噬细胞和肝细胞的促炎细胞因子il-1β和tnf-α，导致全身性代谢恶化[18,19]。肥胖和糖尿病均加剧或“助长”ad的病理[9,11,20]。

8、鉴于在整体老龄化人口中，越来越多的患者患有包括糖尿病和肥胖症(主要由单纯的营养不良或与缺乏活动相结合引起)的代谢紊乱的事实，代谢紊乱是发展为痴呆症(特别是ad)的主要风险因素，特别是生物因子(特别是镁、锌和维生素b，特别是硫胺素、叶酸，或前药如苯磷硫胺和维生素d)的缺乏或摄入减少对老年人来说是充满风险的。这与老年人新陈代谢过程的改变密切相关(例如肌肉萎缩等)。

9、用于治疗和预防痴呆症的生物因子在现有技术中有所描述。例如，维生素缺乏症，特别是维生素b12缺乏症，已经可能导致(继发性)痴呆症(who icd10(2019),f02.8)。

10、如上所述，申请人特别关注以下化合物或物质，即乳清酸镁或锌、维生素d，特别是维生素d3(胆钙化醇)和维生素b，特别是硫胺素、叶酸、维生素b6和b12(钴胺素)和苯磷硫胺。特别是乳清酸盐被证明是很有前景的锌和镁载体，因为它们可以很容易地穿过血脑屏障。乳清酸盐也是有利的，因为例如特别是乳清酸镁和乳清酸锌两者均可以很容易地被携带/渗透通过细胞膜，并且也优先被线粒体和细胞核吸收[21]。由此产生的能量供应(因此例如线粒体中atp-生产)的刺激是有利的，因为痴呆，特别是ad，可以(共同)引起线粒体功能障碍(同上)。

11、此外，现有技术中描述了用于治疗和预防痴呆症的上述生物因子的组合制剂。

12、us20150132273a1描述了苏糖酸镁与生物因子的组合用于治疗认知障碍。然而，苏糖酸盐被证明是镁或锌的低效载体，因为苏糖酸盐本身在多种代谢途径中会迅速降解。

13、wo 2017/179644 a1中描述了使用镁盐而非乳清酸镁与生物因子联合治疗痴呆症。

14、wo 2017/059895 a1的实施例1公开了由l-5-甲基四氢叶酸盐(100-800μg叶酸当量)、维生素b3(4-40mg)、维生素b2(0.4-5mg)、甲钴胺(0.5-10微克)、维生素b6(0.4-5毫克)、三甲基甘氨酸(100-2000毫克)、双甘氨酸锌5-50毫克)和n-乙酰半胱氨酸(100-2000毫克)构成的制剂用于治疗痴呆症。

15、mischoulon等人[22]公开了叶酸用于治疗痴呆症，包括阿尔茨海默氏症后的老年痴呆症及其预防。描述了每天向患者施用15mg。

16、从该现有技术出发，因此本发明的目的是提供特别合适且有效的生物因子组合以用于治疗和预防痴呆，特别是用于长期治疗或长期预防。

17、为此，申请人对临床前ad模型进行了全面测试，这些模型表明生物因子组合适用于预防和治疗痴呆症，特别是ad。

18、永生化的神经母细胞瘤细胞，即人sy-sy5y-app695细胞，过度表达神经元、人app基因，导致β-淀粉样蛋白的形成增加。

19、线虫秀丽隐杆线虫(c.elegans)(cl2006)在肌肉特异性启动子的控制下表达人淀粉样蛋白-β(1-42)，导致线虫逐渐麻痹。寿命缩短，并且蠕虫显示出β-淀粉样蛋白的特征性沉积物。

20、与野生型相比，阿尔茨海默氏症大鼠tgf344-ad在6-7个月和15-16个月后测试了线粒体氧化磷酸化的活性。

21、结果在实施例和图中进行了解释和报告。

22、令人惊讶的是，在永生化神经母细胞瘤细胞，特别是人sy-sy5y-app695细胞中，乳清酸镁和叶酸的组合物可以实现对β-淀粉样蛋白形成的累加抑制(图1a)。

23、这一结果尤其体现在这种组合使线粒体中的atp生产正常化并抵消引起线粒体功能障碍的适用性方面。

24、因此，本发明涉及用于预防和治疗痴呆的制剂，特别是药物或膳食增补剂或均衡饮食，其包含乳清酸镁和叶酸或由其组成(下文中：根据本发明的制剂)。

25、在另一个实施方案中，本发明因此涉及一种制剂，特别是药物或膳食增补剂或均衡饮食，其包含乳清酸镁和叶酸或由其组成，用于预防和治疗线粒体功能障碍，特别是这种选自以下的疾病：心力衰竭、非酒精性肝炎、慢性疲劳或纤维肌痛(下文中：根据本发明的制剂)。

26、上述研究表明，除了乳清酸镁和叶酸外，特别是由以下各项制成的“鸡尾酒”：乳清酸镁或乳清酸锌，维生素d，特别是维生素d3(胆钙化醇)和维生素b，特别是硫胺素，叶酸，维生素b6和b12(钴胺素)和苯磷硫胺，至少额外地支持所述功效。因此，根据本发明还包括其他组合，其中至少两种或三种或四种或五种或六种物质或所有物质选自乳清酸镁、乳清酸锌，维生素d3、维生素b6、叶酸、维生素b12和苯磷硫胺。

27、乳清酸镁是一种乳清酸(或6-羧基尿嘧啶)的盐，分子式为

28、

29、且市售可得，例如pharma gmbh(德国)。

30、乳清酸锌是一种乳清酸(或6-羧基尿嘧啶)的盐，分子式为

31、

32、且市售可得，例如pharma gmbh(德国)。

33、叶酸(或蝶酰单谷氨酸)是维生素b9

34、

35、或互变异构体(2s)-2-[(4-[(2-氨基-4-氧基-1h-蝶啶-6-基)甲基氨基]苯甲酰基)氨基]戊二酸(内酰胺)或(2s)-n-(4-[([2-氨基-4-羟基蝶啶-6-基]甲基)氨基]苯甲酰基)谷氨酸(内酰亚胺)并且可能作为叶酸盐存在，其中存在2-7个谷氨酰残基。此外，叶酸可以在蝶啶上氢化，例如5,6,7,8-四氢叶酸或取代(例如甲基，特别是如5-甲基四氢叶酸盐)。根据本发明，这种叶酸(或叶酸等同物)包括在术语叶酸中。根据本发明还包括叶酸的互变异构体和盐类。根据本发明优选合成产生的叶酸。

36、苯磷硫胺是硫胺素(维生素b1)的亲脂性前药，因此代表维生素原，例如申请人以milgamma 销售，专门用于治疗由维生素b1缺乏引起的神经病和心血管疾病。

37、在根据本发明的制剂的进一步优选的实施方案中，乳清酸镁与叶酸的摩尔比优选为2:1至25:1，特别是20:1。

38、维生素b和d涉及市售的维生素d2和d3以及b1至b12。

39、所提及的物质可以以其生理活性形式使用，包括盐、辅助因子和水合物或立体异构体、互变异构体(例如r、s、z、e)等。

40、在本发明的上下文中，痴呆症(疾病)被理解为意指(非仅以所列为限)例如阿尔茨海默氏痴呆症或阿尔茨海默氏病，早发性阿尔茨海默氏病性痴呆(2型)，晚发性阿尔茨海默氏病性痴呆(1型)、非典型或混合形式的阿尔茨海默氏痴呆症、血管性痴呆症、路易体痴呆症，所有这些形式都包括在本发明中。这些形式的痴呆症在世界卫生组织(who)第10次修订版(2019)的“国际疾病和相关健康问题统计分类”f00-03第五章“精神和行为障碍”(同上)中有所描述。

41、在本发明的上下文中，术语“线粒体功能障碍”是指在细胞或线粒体中，能量(atp和nadh)的形成与氧自由基或ros(活性氧类)的形成之间存在不平衡，因此导致能量缺乏和氧化负荷增加，并引发或可能引发继发性疾病，特别是慢性疾病，例如痴呆，特别是ad、心力衰竭、非酒精性肝炎、慢性疲劳、慢性疲劳综合征(cfs)或纤维肌痛(综合征)。线粒体功能障碍与ad之间的因果关系已根据文献[23,24]得以证明，同样对于慢性疲劳、cfs或纤维肌痛[25]得以证明。

42、所有所述适应征例如描述于pschyrembel,267,2017版，de gruyter(柏林)。

43、根据本发明的由乳清酸镁和叶酸构成的组合的活性制剂现在可以有利地用于治疗和预防病患者或个体、动物、哺乳动物或优选人，并且即用于治疗和预防痴呆症(疾病)、线粒体功能障碍、心力衰竭、非酒精性肝炎、慢性疲劳、慢性疲劳综合征(cfs)或纤维肌痛(综合征)。

44、所述制剂可以任何所需的量和剂量给药。

45、根据本发明的制剂的盖伦氏配制剂可以选自由以下各项组成的组：滴剂、药水、糖浆、片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、缓释制剂、输液剂、软膏、乳剂、扑粉或粉剂。当然，所述配制剂可以含有药学上常用的助剂。

46、在进一步的实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的制剂的药物制剂适用于或应用于痴呆(疾病)、线粒体功能障碍、心力衰竭、非酒精性肝炎、慢性疲劳、慢性疲劳综合征(cfs)或纤维肌痛(综合症)的治疗和预防。

47、另一个优选的实施方案涉及含有根据本发明的制剂的膳食增补剂，特别是以膳食组合物或均衡饮食的形式用于治疗和预防痴呆症(疾病)、线粒体功能障碍、心力衰竭、非酒精性肝炎、慢性疲劳、慢性疲劳综合症(cfs)或纤维肌痛(综合症)。根据本发明的合适的食品或食品，包括水，是未在2002年1月28日第178/2002号法规(eg)中最终定义的那些，例如烘培食品和饮料以及儿童食物制品。可以将合适的生理上可耐受的载体添加到根据本发明的膳食增补剂中。

48、根据本发明的药物制剂可以以剂量单位的形式生产。这意味着制剂是单独部分的形式，优选胶囊和安瓿，其活性成分含量对应于单次剂量的分数或倍数。剂量单位可以包含例如1、2、3或4个单剂量或1/2、1/3或1/4的单剂量。单次剂量优选包含在一次施用中施用的根据本发明的制剂的量，其通常对应于日剂量的全部、一半、三分之一或四分之一。一天三次的剂量是优选的，优选以片剂或滴剂的形式，特别是在早上、中午和晚上，视情况随餐服用。

49、无毒、惰性的药学上合适的赋形剂是任何种类的固体、半固体或液体稀释剂、填充剂和配制助剂，例如a)填充剂和增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、糊精、麦芽糖糊精和硅酸，高分散二氧化硅，b)粘合剂，如羧甲基纤维素，纤维素粉，微晶纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，c)保湿剂，如甘油，d)崩解剂，如琼脂，碳酸钙和碳酸钠，e)缓溶剂例如石蜡和f)吸收促进剂，例如季铵化合物，g)润湿剂，例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯，h)吸附剂，例如高岭土和膨润土和i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁和固体聚乙二醇或a)至i)中所列物质的混合物。

50、片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可以提供常用、任选地包含遮光剂的包衣和外壳，例如但不限于羟丙甲纤维素、微晶纤维素、硬脂酸、二氧化钛，并且同样可被组成使得它们仅或优选以视情况延迟的方式在肠道的某个部分释放，其中例如聚合物物质和蜡可以用作包埋材料。

51、因此，本发明还涉及包含根据本发明的制剂以及助剂和添加剂的药物制剂。

52、实施例和附图：

53、以下实施例和附图仅用于解释本发明，而不是将本发明限制于这些实施例。

54、实施例1：

55、细胞模型：

56、细胞培养：

57、使用的人神经母细胞瘤-sh-sy5y细胞用人野生型-app695(app)dna稳定转染(grewal r、reutzel m、dilberger b等人(2020)purified oleocanthal and ligstrosideprotect against mitochondrial dysfunction in models of early alzheimer'sdisease and brain ageing.exp neurol 328:113248,stockburger c,gold vam,pallast等人(2014)a cell model for the initial phase of sporadic alzheimer'sdisease.j alzheimers dis 42:395-411)。

58、sh-sy5y-app细胞在37℃、5％的co2气氛下在培养基(dmem)中培养，培养基(dmem)补充有10％(v/v)热灭活胎牛血清、60μg/ml链霉素、60单位/ml青霉素、0.3mg/ml潮霉素、非必需mem-氨基酸和1mm丙酮酸钠1％。细胞每3天传代一次，并在达到70-80％汇合时使用。

59、将细胞与200μm乳清酸镁、10μm叶酸及其组合培养24小时。用dmem培养作为对照。

60、aβ1-40测量：

61、培养24小时后，将培养基收集在细胞培养基瓶中，并用冷pbs冲洗细胞。然后将悬浮液以220g离心5分钟。此后，弃去上清液并将细胞沉淀重悬于1.5ml的pbs和蛋白酶抑制剂中。然后将溶液以112g离心5分钟并去除上清液。收集细胞沉淀并添加到600μl细胞提取缓冲液(thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)中并培养30分钟。此后，将悬浮液以13,000g离心10分钟。将上清液转移至新管中并于-80℃保存。将上清液在冰上解冻并移入384孔板(greiner bio-one，kremsmünster，奥地利)。使用htrf淀粉样蛋白1-40制剂盒(cisbio，codolet，法国)检测淀粉样蛋白β的浓度。根据制造商的说明使用样品。此后，在665和622nm处测量光密度。然后将淀粉样蛋白β值标准化为蛋白质含量。

62、蛋白质定量：

63、使用piercetm蛋白质测定制剂盒(thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)测定蛋白质含量。按照制造商的规定遵循说明。牛血清白蛋白用作标准。该实验程序基于smith等人的出版物(smith pk,krohn ri,hermanson gt等人(1985)measurement ofprotein using bicinchoninic acid.analytical biochemistry 150:76-85)。

64、线虫(秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans))

65、秀丽隐杆线虫和细菌菌株

66、秀丽隐杆线虫野生型品系n2来自秀丽隐杆线虫遗传学中心(minnesota大学,mn,usa)。根据标准方案(brenner s(1974)the genetics of caenorhabditiselegans.genetics 77:71-94)，将线虫在持有线虫生长培养基的(ngm)琼脂平板上在20℃下，将线虫用大肠杆菌op50接种。通过标准漂白方案(theresa stiernagle(2006)maintenance of c.elegans.wormbook:1-11)为所有实验生成同步种群。

67、培养和处理：

68、同步幼虫(synchrone larven)在m9缓冲液中洗涤两次，计数并调整为每10μl 10个幼虫。将线虫移入96孔板(greiner bio-one，frickenhausen，德国)。在液体线虫的光密度od600下将op50的浓度调整为1。添加op50-ngm作为标准化食物来源，其中使用具有m9溶液的4.4倍体量的幼虫。l1幼虫保持在20℃并不断摇动，并在3天内达到成年。达到青年期48小时后在实验前添加效应物。溶解在m9中的100μm乳清酸镁和50μm叶酸用作效应物。m9缓冲液用作对照。

69、耐热应力：

70、如上所述，在96孔微孔板中每孔生长约10条线虫。培养48小时后，如前所述应用效应物。如fitzenberger等人所述(fitzenberger e,deusing dj,marx c et al.(2014)thepolyphenol quercetin protects the mev-1mutant of caenorhabditis elegans fromglucose-induced of survival under heat stress depending on sir-2.1,daf-12,andproteasomal molecular nutrition&food research 58：984-994)，使用微孔板耐热试验确定线虫的死亡时间。

71、在15ml小管中用m9缓冲液从孔中清洗线虫，然后再清洗3次。在黑色384孔微量滴定板(greiner bio-one，frickenhausen，德国)的每个孔中，添加6.5μl m920(1％v/v)溶液。然后在立体显微镜(breukhoven microscopesystems,capelle aan den ijssel,荷兰)下将具有一条线虫的1μl的m9缓冲液移入每个孔中，并与7.5μl sytoxtm绿混合(终浓度1m；life technologies,karlsruhe,德国)。为防止水分蒸发，将板用rotilab密封膜(greiner bio-one，frickenhausen，德国)密封。诱导热休克(37℃)，并在17小时内每30分钟用clariostar读板器(bmg，ortenberg，德国)测量荧光。为了检测sytoxtm的绿色荧光，激发波长设置为485nm，发射波长为538nm。

72、实施例2：

73、处理后从转基因f344-ad大鼠海马体分离的线粒体的氧化磷酸化(oxphosc)

74、f344-ad大鼠断头后，分离海马体并在4℃下匀浆。离心步骤后，分离的线粒体被放置在呼吸计的腔室中。通过连续添加呼吸链的底物和抑制剂，可以在铂电极上测量对腔室耗氧量的影响，并且可以单独检查单个复合物的活性(操作由tina m.schwarzkopf,konrada.koch,jochen klein,neurodegeneration after transient brain ischemia in agedmice:beneficial effects of bilobalide,brain research,vol.1529,5 september2013,178-187页具有进一步的证据)。

75、

76、结果如图3所示。

77、图1显示了在sh-sy5y-app695中用活性成分a.)叶酸(fol；10μm)和乳清酸镁(200μm)及其组合和b.)叶酸(fol；10μm)和乳清酸锌(200μm)及其组合培养24小时后，β淀粉样蛋白肽(aβ1-40)以pg/mg蛋白质表示的量。显示了来自6个独立实验(n＝6)的相应平均值和相关的标准误差(±sem)。借助anova分析确定显著性(***p<0.001或****p<0.0001)。虚线表示对照的平均值(217.4pg/mg aβ)。

78、从图1a可以看出叶酸和乳清酸镁的协同效应，因为：

79、δ组合>δ乳清酸镁+δfol。

80、图2显示了在用乳清酸镁和叶酸(“fol”)及其组合处理后的热应激测定中以kaplan-meier曲线形式的秀丽隐杆线虫的寿命。未处理的蠕虫作为对照(m9[对照])。其显示了各自的平均值和相关的标准误差(±sem)。显著性(**p<0.01)是使用对数秩(mantel-cox)检验计算的。

81、图3显示了从转基因f344-ad大鼠海马体分离的线粒体氧化磷酸化(oxphosc)的能力(iu＝μmol/min)。四个处理组(b、c、d、f)和两个年龄组(6-7个月、15-16个月)绘制在横坐标上。通过处理，6-7个月大的动物之间的oxphosc没有显著差异，尽管用鸡尾酒(d组)处理导致oxphosc增加。年龄相关地，oxphosc在统计学上显著降低(参见a组与e组)。通过鸡尾酒的处理可以显著影响或消除年龄的这种影响(对比e组和f组)。

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技术实现思路