用于保护猪免于各种疾病的组合疫苗的制作方法

本发明总体上属于猪健康领域。猪容易感染许多致病微生物和遭遇不良事件，如动物饲料中存在的真菌毒素中毒。这些方面的控制通常通过农场和饲料管理、抗病毒药物和抗生素等药物治疗、使用疫苗进行预防性治疗、使用毒素粘合剂处理饲料等方式进行。例如，几乎所有的猪都容易感染猪圆环病毒2型(pcv2或pcv-2)和猪肺炎支原体(mhyo)，以及由动物饲料中存在的霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)诱导的真菌中毒。

背景技术：

1、pcv-2与在仔猪中观察到的断奶仔猪多系统衰竭综合征(pmws)有关。这种疾病于1991年在加拿大首次出现。临床体征和病理首次发表于1996年，包括进行性消瘦、呼吸困难、呼吸急促，偶尔出现黄疸和黄疸。

2、nayar等，can.vet.j.volume 38,june 1997在有pmws临床症状的猪上检测到了pcv，并得出结论，除了已知的pk-15细胞自然宿主pcv外，pcv可能与pmws有关。后来出版的(hamel等，j.virol.,72(6),5262-5267,1998；meehan等，j.gen.virol.,79,2171-2179,1998)证实了这些发现，并且有人建议(meehan等，同上)将新的致病性pcv称为pcv-2，而最初的pk-15细胞培养分离物(tischer等，nature295,64-66,1982)则应称为pcv-1。

3、pcv-2是一种小的(17-22nm)二十面体非包膜病毒，含有一个环状单链dna基因组。pcv-2基因组的长度约1768bp。来自世界不同地区的pcv-2分离株之间关系密切，显示出约95至99％核苷酸序列同一性(fenaux等，j.clin.micorbiol.,38(7),2494-2503,2000)。pcv的orf2编码病毒的衣壳蛋白。pcv-2的orf2基因编码约233个氨基酸的蛋白质。所有pcv-2分离株的orf2基因具有91-100％核苷酸序列同一性和90-100％的推导氨基酸序列同一性。

4、猪肺炎支原体是一种已知可引起猪地方性肺炎的细菌，这是一种影响猪的高度传染性和慢性疾病。mhyo体积小(400-1200nm)，有一个小的基因组(893-920千碱基对(kb))并缺乏细胞壁。mhyo附着在猪的肺部上皮细胞的纤毛上。它们导致纤毛停止跳动、结块和纤毛丢失，最终导致上皮细胞死亡。这是猪地方性肺炎猪肺部病变的来源。这种损伤阻碍了正常的纤毛清除，并且经常会发生继发性感染。这导致动物体重的显著下降。此前据估计，美国的损失每年高达10亿美元。猪流行性肺炎在全世界流行，mhyo几乎存在于所有猪群中。猪体内存在mhyo所诱发的免疫反应缓慢且无效。因此这种疾病的治疗是最重要的，但仅限于抗生素，因为抗生素目前仅部分有效，不能完全消除感染。已经发现疫苗可以降低疾病的严重程度，但不能完全防止该病在受感染猪群中发生。

5、另一种在世界范围内广泛分布于猪中的病原体是胞内劳森氏菌。这种细菌可能导致增殖性肠病，也称为回肠炎，这是世界各地断奶后猪常见的肠道疾病。特征性病变是回肠肠隐窝中未成熟肠细胞的增殖；这些细胞通常在顶端细胞质中含有致病细菌。尸检时，通过可见1.5-2.5μm长的弧菌状细菌，尤其是肠上皮细胞中的细菌，但通常也存在于隐窝之间固有层和肠系膜淋巴结中的巨噬细胞内，可以确认组织学病变为劳森氏菌阳性。从肠上皮细胞中清除细菌可导致相关增殖性病变的消退，表明细菌对隐窝的直接局部作用。已使用聚合酶链式反应证明在这些病变中存在胞内劳森氏菌，无论是在表现出疾病的动物中还是在仅表现出亚临床感染的动物中。临床病例通常出现在生长发育期；在一些年龄较大的肥育猪中，已经记录到急性出血形式。

6、真菌通常会在猪身上引起广泛的疾病，包括器官和组织的寄生以及过敏性表现。然而，除了通过摄入非食用蘑菇中毒外，真菌还可以产生真菌毒素和有机化学物质，这些毒素和化学物质导致各种毒性作用，称为真菌毒素中毒。这种疾病是由接触真菌毒素引起的，真菌毒素是由污染食品或动物饲料的丝状真菌产生的具有药理活性的化合物。真菌毒素是对真菌生理学不重要的次级代谢产物，在摄入、吸入或皮肤接触时，最低浓度对脊椎动物就具有剧毒。目前已识别出约400种真菌毒素，细分为具有类似生物和结构性质的化学相关分子家族。其中，大约有十几个群组经常因威胁动物健康而受到关注。具有最大公共利益和农业经济意义的真菌毒素的实例包括黄曲霉毒素(af)、赭曲霉素(ot)、单端孢霉烯族毒素(t；包括don)、玉米赤霉烯酮(zen)、伏马菌素(f)、致肿瘤毒素和麦角生物碱。真菌毒素与急性和慢性疾病有关，其生物学效应主要因其化学结构的多样性而不同，也因生物、营养和环境因素而不同。真菌毒素的病理生理学是真菌毒素与动物细胞中的功能分子和细胞器相互作用的结果，其可能导致致癌性、遗传毒性、蛋白合成抑制、免疫抑制、皮肤刺激和其他代谢紊乱。在敏感动物物种中，真菌毒素可能引发复杂且叠加的毒性作用。真菌中毒症不会传染，也不会对免疫系统产生显著刺激。

7、脱氧雪腐镰刀菌烯醇，也称为呕吐毒素，是一种b型三烯，主要存在于小麦、大麦、燕麦、黑麦和玉米等谷物中，也存在于水稻、高粱和小黑麦中。脱氧雪腐镰刀菌烯醇的出现主要与禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)(玉米赤霉)和黄色镰刀菌(fusariumculmorum)有关，这两种植物病原体都是导致小麦枯萎病以及玉米赤霉和枯萎病的重要植物病原体。小麦枯萎病发病率与脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染之间存在直接关系。枯萎病的发病率与开花时的水分密切相关，而降雨的时间而不是数量是最关键的因素。此外，don含量受品种对镰刀菌属种的易感性、以前的作物、耕作方法和杀菌剂使用的显著影响。禾谷镰刀菌在25℃的温度下生长最佳，而黄色镰刀菌则在21℃下生长最佳。因此，禾谷镰刀菌是出现在温暖气候中的更常见的物种。

8、don与人类和农场动物的真菌中毒事件有关。该毒素属于单端孢霉烯族毒素，是蛋白质合成的强抑制剂。暴露于don会导致大脑对氨基酸色氨酸的摄取减少，进而减少血清素的合成。血清素水平的降低被认为是don引起食欲不振作用的原因。胃肠道刺激也可能在减少采食量方面发挥作用，也可能部分解释在拒绝进食期间观察到的母猪食管旁胃溃疡的高发病率。

9、don诱导的真菌毒素中毒的预防性治疗目前仅限于减少作物真菌毒素产生的良好农业实践，以及食品和饲料商品的控制计划，以确保真菌毒素水平保持在一定限度以下。药物或抗生素治疗对疾病的进程几乎没有影响。到目前为止，还没有人或动物疫苗可用于对抗真菌中毒。

10、这与上述确定的各种病原体不同，针对这些病原体的疫苗是众所周知的。预防性治疗动物，特别是猪，对抗pcv 2感染的常规疫苗可以基于作为(非复制性)免疫原的整个灭活的pcv-2病毒。另外，在本领域中已经证明orf2编码的衣壳蛋白(例如，当重组表达时)适合作为猪圆环病毒2型的亚单位免疫原用于适当的疫苗。这是可以理解的，因为循环系统中的这个亚单位与病毒本身呈现相同的方式(其形成病毒样颗粒)，本质上的区别仅在于dna和非结构蛋白不存在于衣壳内。目前，市售有几种针对pcv-2的疫苗。pcv(可购自msd animal health,boxmeer,the netherlands)是一种针对猪圆环病毒2型的疫苗，适用于三周龄及以上的猪。当作为两针(两剂)疫苗接种时，免疫持续时间(doi)为22周，几乎完全覆盖了猪的育肥期。ingelvac(可购自boehringer ingelheim,ingelheim)是一种针对猪圆环病毒2型的疫苗，适用于两周龄及以上的猪。其登记为仅一针(一剂)疫苗。(可购自ceva santéanimale,libourne,france)是一种用于保护猪免于猪圆环病毒2型的疫苗，适用于三周龄及以上的猪。pcv(可购自zoetis,capelle a/dijssel,the netherlands)是一种保护猪免于猪圆环病毒2型的疫苗，适用于三周龄及以上的猪。其他pcv2疫苗描述在例如wo2007/028823、wo 2007/094893和wo2008/076915中。这些疫苗都具有共同点，即其包含pcv2的orf2衣壳蛋白。

11、关于猪肺炎支原体，存在很多商业疫苗并且这些疫苗通常用于大多数商业养猪作业。通常，这些疫苗包含mhyo的非复制免疫原，如亚单位蛋白和/或菌苗，其通常通过胃肠外注射施用。一些实例是：(zoetis)、m.hyo和(boehringer ingelheim)、mycoplasma(elanco animal health)、pcv mh(zoetis)以及和m hyo(均可购自msd animal health)。

12、通过诱导活性保护来对抗胞内劳森氏菌的疫苗是市售的，并且在本领域中进行了描述。这些疫苗的商品名为ileitis(boehringer ingelheim vetmedica,usa)，这是一种减毒活疫苗，和ileitis(merck animal health,usa)或lawsonia(msd animal health,the netherlands)，这两种疫苗都包含以菌苗形式存在的胞内劳森氏菌的非复制免疫原。

13、发明目的

14、本发明的目的是提供一种组合物，其能够一次性保护猪免于猪圆环病毒2型(pcv2或pcv-2)和猪肺炎支原体(mhyo)的感染，以及由霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)诱导的真菌中毒。

技术实现思路

1、为了满足本发明的目的，已经设计了一种疫苗，其包含组合的猪圆环病毒2型(pcv2)的非复制免疫原、猪肺炎支原体的非复制免疫原以及缀合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)。这种疫苗似乎适于一次性保护猪免受猪圆环病毒2型的感染、猪肺炎支原体的感染以及don诱导的霉菌中毒，其均是在猪中非常普遍的疾病。尽管本领域已知针对pcv2和mhyo的组合疫苗，但是令人吃惊的是，发现缀合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇适合用作保护动物免受don诱导的真菌中毒的疫苗。研究发现，将don转化为类毒素没有特别的必要(尽管权利要求没有排除)，这种缀合的毒素似乎对治疗的宿主动物是安全的。此外，令人吃惊的是，在治疗后口服don后，诱导的免疫应答足以保护接种疫苗的动物免受真菌中毒。通过诱导针对真菌毒素的免疫应答在本领域中尚未显示出对任何真菌毒素，更不用说对高丰度和剧毒的化合物脱氧雪腐镰刀菌烯醇的主动保护。另一个令人吃惊的是，疫苗的三种组分不会产生负面干扰。使用组合疫苗，可以对每种抗原产生足够的免疫应答。这种应答对本领域公知的病原体pcv2和mhyo具有保护作用，并且现在首次证明对don摄入具有保护作用。

2、本发明还涉及一种用于保护猪免于猪圆环病毒2型感染、猪肺炎支原体感染和don诱导的霉菌中毒的方法中的疫苗，所述疫苗包含组合的猪圆环病毒2型(pcv2)的非复制免疫原、猪肺炎支原体的非复制免疫原和缀合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)。

3、本发明进一步涉及一种试剂盒，其包含第一组合物和第二组合物的组合，所述第一组合物包含组合的猪圆环病毒2型的非复制免疫原、猪肺炎支原体的非复制免疫原(术语“组合物”不排除其涉及两个单独的容器，其中的内容物在施用前混合)，所述第二组合物包含缀合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)。

4、试剂盒可以包含如何一次性使用这两种组合物向猪施用的说明，例如，在实际施用前将其混合，或者使用带有两个单独施用喷嘴/桶的施用装置(如3g twin(msdanimal health))进行相关的非混合使用。

5、定义

6、疫苗是一种可安全施用于受试动物的药物组合物，并且能够诱导该动物对病原微生物或化合物的保护性免疫，即诱导成功的预防性治疗，如下所述。

7、病原体的非复制免疫原是与病原体相对应的任何物质或化合物，而不是整体的活体可复制病原体(野生型或减毒型)，病原体对其会产生免疫应答，从而使相应的毒性病原体或其一种或多种毒性因子作为这种免疫应答的结果被宿主的免疫系统所识别，并最终至少部分地被中和。非复制免疫原的典型实例是杀死的整个病原体(该术语包括裂解形式的病原体)和这些病原体的亚单位如衣壳蛋白、表面表达分子(例如重组表达蛋白或脂多糖)和分泌分子如毒素。这组免疫原的共同点是，其通常会激发体液免疫应答。

8、菌苗是被杀死的细菌混悬液，例如，通过浓缩细菌培养物，随后用化学试剂如二元亚乙基亚胺(bei)、氯甲酚、福尔马林，或者例如通过紫外线或其他类型的灭活获得。

9、预防性治疗，例如针对病原体的感染或针对另一不良事件，是有助于预防、改善或治愈该病原体的感染(或由该感染引起的病症)，或有助于预防、改善或治愈所述事件，其中所述治疗分别在用所述致病性病原体攻击或所述事件发生之前进行。

10、真菌毒素中毒是由暴露于真菌毒素引起的疾病。临床症状、靶器官和结局取决于真菌毒素的内在毒性特征、暴露的数量和时间，以及暴露动物的健康状况。

11、为了针对真菌毒素中毒产生保护指防止或减少真菌毒素在动物中的一种或多种负面生理作用，如平均每日体重增加的减少。

12、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(简称don，也称为呕吐毒素或vom)是一种由真菌禾谷镰刀菌产生的真菌毒素，其会导致小谷物的小麦赤霉病(fhb)或赤霉病。don会导致拒食和呕吐。基本化合物的分子式是c15h20o6。

13、缀合的分子是免疫原性化合物通过共价键与之偶联的分子。通常，免疫原性化合物是(大)蛋白，如klh、bsa或ova。

14、佐剂是非特异性免疫刺激剂。原则上，每种物质都能够促进或扩增免疫事件级联中的特定过程，最终导致更好的免疫应答(即，对抗原的综合身体应答，特别是由淋巴细胞介导的应答，通常涉及特异性抗体或此前致敏的淋巴细胞对抗原的识别)，可以定义为佐剂。佐剂通常不需要用于所述特定过程的发生，而仅仅有利于或放大所述过程。