靶向BCMA的嵌合抗原受体的制作方法

本发明涉及生物医学领域，且更具体地涉及靶向bcma的嵌合抗原受体及其制备方法和应用。

背景技术：

0、发明背景

1、bcma是b细胞成熟抗原(b cell maturation antigen)，也称为cd269或tnfrsf17，是肿瘤坏死因子受体超家族的成员。其配体是b细胞活化因子(b cell activatingfactor，baff)和增殖诱导的配体(a proliferation-induced ligand，april)。

2、bcma与baff和april的结合激活nf-kb并诱导抗凋亡bcl-2成员如bcl-xl或bcl-2和mcl-1的上调。bcma与其配体之间的相互作用从不同方面调节体液免疫以及b细胞的生长和分化，以维持人体内的稳定和平衡的环境。

3、bcma的表达限于b细胞系。它在成浆细胞、浆细胞和一部分成熟b细胞上表达，并在终末b细胞的分化时增加。而在大多数b细胞中，如幼稚b细胞、记忆b细胞和b细胞生发中心，以及其他器官，bcma不表达。据报道，bcma的表达对骨髓中的长寿命、固定的浆细胞是重要的。因此，bcma缺陷的小鼠骨髓中的浆细胞减少，但脾脏中的浆细胞水平不受影响。在bcma敲除小鼠中，成熟的b细胞可以正常分化为浆细胞。bcma敲除小鼠看起来正常，且看起来健康，以及b细胞数量正常，但浆细胞不能长时间存活。

4、bcma在恶性浆细胞中也高度表达，如多发性骨髓瘤和浆细胞白血病。霍奇金淋巴瘤患者的hrs细胞中也检测到bcma。在美国，血液系统恶性肿瘤约占所有恶性肿瘤的10％，且骨髓瘤占所有恶性血液学肿瘤的15％。根据文献，bcma的表达与多发性骨髓瘤疾病的进展有关。bcma基因在骨髓瘤样本中高表达，但在慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病和急性t细胞淋巴细胞白血病中低表达。在过量表达bcma配体baff和april的小鼠模型中，b细胞淋巴瘤显著增加。已显示与bcma结合的配体调节表达bcma的多发性骨髓瘤细胞的生长和存活。bcma与baff和april的结合可以使恶性浆细胞存活。因此，表达bcma的肿瘤细胞以及bcma配体和受体之间相互作用的分布的缺失可以改善多发性骨髓瘤或其他bcma阳性b细胞系恶性淋巴瘤的治疗结果。

5、多发性骨髓瘤，也称浆细胞瘤或凯勒氏病，是一种难治性b细胞系的恶性肿瘤，其特征是浆细胞异常增殖。浆细胞是一种负责产生抗体的白细胞。根据国家癌症研究所(national cancer institute)2017年发布的数据，骨髓瘤占所有肿瘤病例的1.8％，死亡率为2.1％。2010-2014年的统计结果显示，每10万人/年的发病率约为6.6人，死亡率约为50％。多发性骨髓瘤是一种中年疾病。欧洲和美国的发病年龄中位数为68岁。男性比女性多。中国发病高峰年龄为55-65岁，男女比例为2.35:1。中国没有关于多发性骨髓瘤的确认的流行病学数据。通常估计，中国的发病率与周边东南亚和日本相似，约为十万分之一。多发性骨髓瘤的常规治疗方法包括化疗和造血干细胞移植，但这些方法的复发率高。硼替佐米(bortezomib)(ps-341)是第一种蛋白酶体抑制剂，2003年被美国食品药品监督管理局(fda)批准用于治疗复发性难治性多发性骨髓瘤，其单独使用或与现有药物联合使用。结果令人满意。该药物也于2005年在中国上市，且已成为沙利度胺(thalidomide)和地塞米松(dexamethasone)治疗多发性骨髓瘤的选择之一。多发性骨髓瘤的治疗通常是联合治疗。但是，如果同时使用多种药物，也会产生昂贵和累积副作用的负面影响。临床上仍然需要开发治疗多发性骨髓瘤的新方法。

6、近年来，免疫疗法，特别是过继性t细胞疗法，在治疗血液系统恶性肿瘤的临床试验中显示出强的功效和光明的前景。可以对t细胞进行基因修饰以表达嵌合抗原受体(car)，其包含抗原识别部分和t细胞活化区。利用单克隆抗体的抗原结合特性，car可以以非mhc限制的方式重定向t细胞和靶点的特异性和反应性。这种非mhc限制性抗原识别允许表达car的t细胞在没有抗原加工的情况下识别抗原，从而避免肿瘤逃逸的主要机制。此外，car不产生内源性tcr的具有α链和β链的二聚体。

7、目前，两种靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞疗法(car-t)产品已被批准用于治疗儿童和年轻成人患者的急性淋巴母细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia)，以及用于治疗复发或难治性大b细胞淋巴瘤的成人二线或多线系统疗法。但是，cd19很少在多发性骨髓瘤的恶性浆细胞中表达。迫切需要开发一种靶向bcma的car-t产品，用于治疗多发性骨髓瘤。

技术实现思路

0、发明概述

1、本公开的一个目的是提供靶向bcma的嵌合抗原受体及其制备方法和应用。

2、本公开提供了嵌合抗原受体(car)。car可以包含抗bcma抗原结合区，其包含轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)。

3、vl可以包含三个互补决定区(cdr)，即lcdr1、lcdr2和lcdr3；vh可以包含三个cdr，即hcdr1、hcdr2和hcdr3。

4、在某些实施方案中，lcdr1、lcdr2和lcdr3可以具有分别与seq id no:17、seq idno:19和seq id no:21中所示的氨基酸序列约80％至约100％同一的氨基酸序列。hcdr1、hcdr2和hcdr3可以具有分别与seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28中所示的氨基酸序列约80％至约100％同一的氨基酸序列。

5、在某些实施方案中，lcdr1、lcdr2和lcdr3可以具有分别与seq id no:31、seq idno:33、seq id no:35中所示的氨基酸序列约80％至约100％同一的氨基酸序列。hcdr1、hcdr2和hcdr3可以具有分别与seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42中所示的氨基酸序列约80％至约100％同一的氨基酸序列。

6、在某些实施方案中，lcdr1、lcdr2和lcdr3可以具有分别与seq id no:45、seq idno:47、seq id no:49中所示的氨基酸序列约80％至约100％同一的氨基酸序列。hcdr1、hcdr2和hcdr3可以具有分别与seq id no:52、seq id no:54、seq id no:56中所示的氨基酸序列约80％至约100％同一的氨基酸序列。

7、car的vl和vh可以具有分别与(a)seq id no:1和seq id no:2中；分别与(a)seqidno:3和seq id no:4中；或分别与(a)seq id no:5和seq id no:6中所示的氨基酸序列约80％至约100％同一的氨基酸序列。

8、在某些实施方案中，vl位于vh的n末端。

9、抗bcma抗原结合区可以是特异性结合bcma的单链可变片段(scfv)。

10、car可以进一步包含以下中的一种或多种：(a)信号肽，(b)铰链区，(c)跨膜结构域，(d)共刺激区，和(e)细胞质信号传导结构域。

11、共刺激区可以包含4-1bb(cd137),cd28,ox40,cd2,cd7,cd27,cd30,cd40,cd70,cd134,pd1,dap10,cds,icam-1,lfa-1(cd11a/cd18),icos(cd278),nkg2d,gitr,tlr2的共刺激区或其组合(或可以衍生自4-1bb(cd137),cd28,ox40,cd2,cd7,cd27,cd30,cd40,cd70,cd134,pd1,dap10,cds,icam-1,lfa-1(cd11a/cd18),icos(cd278),nkg2d,gitr,tlr2或其组合)。

12、细胞质信号传导结构域可以包含cd3ζ的细胞质信号传导结构域(或可以衍生自cd3ζ)。

13、铰链区可以包含cd8、cd28、cd137、ig4的铰链区或其组合(或可以衍生自cd8、cd28、cd 137、ig4)。

14、跨膜结构域可以包含cd8,cd28,cd3ε,cd45,cd4,cd5,cd9,cd16,cd22,cd33,cd37,cd64,cd80,cd86,cd134,cd137,cd154的跨膜结构域或其组合(或可以衍生自cd8,cd28,cd3ε,cd45,cd4,cd5,cd9,cd16,cd22,cd33,cd37,cd64,cd80,cd86,cd134,cd137,cd154或其组合)。

15、本公开提供了一种表达本发明car的免疫细胞。免疫细胞可以是t细胞或自然杀伤(nk)细胞。免疫细胞可以是同种异体的或自体的。

16、本公开还包含编码本发明car的核酸。

17、本公开进一步提供了包含本发明核酸的载体。

18、本发明提供了一种治疗癌症的方法。该方法可以包括将免疫细胞施与有需要的受试者。

19、癌症可能是血液学癌症。癌症可能是浆细胞恶性肿瘤。癌症可能是bcma阳性的恶性肿瘤。癌症可能是多发性骨髓瘤(mm)或浆细胞白血病。

20、免疫细胞可以通过输注、注射、转输、植入和/或移植来施用。

21、免疫细胞可以静脉内、皮下、皮内、结节内(intranodally)、肿瘤内、髓内(intramedullary)、肌内或腹膜内施用。

22、免疫细胞可以通过静脉内输注施用。

23、受试者可以是人。

24、本公开提供一种治疗癌症的方法。该方法可以包括将本发明的免疫细胞施与有需要的受试者。

25、嵌合抗原受体(car)在施用后约28天在受试者的血液中可以产生从约5.0e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.3e+07个拷贝/gdna，从约5.0e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.0e+07个拷贝/gdna，从约5.0e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.3e+07个拷贝/gdna，或从约7.0e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.0e+07个拷贝/gdna范围的曲线下面积(auc)。

26、嵌合抗原受体(car)可以在受试者的血液中产生从约5x104个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.3x106个拷贝/gdna，从约5x105个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.3x106个拷贝/gdna，或从约7.5x105个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1x106个拷贝/gdna范围的最大血浆浓度(cmax)。

27、car可以具有范围为约12天至约25天、约14天至约20天、或约6天至约22天的tmax。

28、在某些实施方案中，抗bcma抗原结合区包括轻链可变区(vl)，所述轻链可变区包含与seq id no:1、seq id no:3或seq id no:5中所示的氨基酸序列至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。

29、在某些实施方案中，抗bcma抗原结合区包括重链可变区(vh)，所述重链可变区包含与seq id no:2、seq id no:4或seq id no:6中所示的氨基酸序列至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。

30、抗bcma抗原结合区的轻链可变区可以包含一个、两个或三个互补决定区(cdr)，所述互补决定区与bcma-20抗体轻链可变区的cdr(分别为seq id no:1的位置24-34、位置50-56、位置89-97所示的cdr1、cdr2和cdr3)、或与bcma-ca8抗体轻链可变区的cdr(分别为seqid no:3的位置24-34、位置50-56、位置89-97所示的cdr1、cdr2和cdr3)、或与bcma-mo6抗体轻链可变区的cdr(分别为seq id no:5的位置24-34、位置50-56、位置89-97所示的cdr1、cdr2和cdr3)至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一。

31、抗bcma抗原结合区的重链可变区可以包含一个、两个或三个互补决定区(cdr)，所述互补决定区与bcma-20抗体重链可变区的cdr(分别为seq id no:2的位置31-35、位置50-66、位置99-110所示的cdr1、cdr2和cdr3)、或与bcma-ca8抗体重链可变区的cdr(分别为seqid no:4的位置31-35、位置50-66、位置99-110所示的cdr1、cdr2和cdr3)、或与bcma-mo6抗体重链可变区的cdr(分别为seq id no:6的位置31-35、位置50-66、位置99-110所示的cdr1、cdr2和cdr3)至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一。

32、抗bcma抗原结合区的轻链可变区可以包含一个、两个或三个互补决定区(cdr)，所述互补决定区与bcma-20抗体轻链可变区的cdr(分别为seq id no:17、seq id no:19、seqid no:21所示的cdr1、cdr2和cdr3)、或与bcma-ca8抗体轻链可变区的cdr(分别为seq idno:31、seq id no:33、seq id no:35所示的cdr1、cdr2和cdr3)、或与bcma-mo6抗体轻链可变区的cdr(分别为seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49所示的cdr1、cdr2和cdr3)至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一。

33、抗bcma抗原结合区的重链可变区可以包含一个、两个或三个互补决定区(cdr)，所述互补决定区与bcma-20抗体重链可变区的cdr(分别为seq id no:24、seq id no:26、seqid no:28所示的cdr1、cdr2和cdr3)、或与bcma-ca8抗体重链可变区的cdr(分别为seq idno:38、seq id no:40、seq id no:42所示的cdr1、cdr2和cdr3)、或与bcma-mo6抗体重链可变区的cdr(分别为seq id no:52、seq id no:54、seq id no:56所示的cdr1、cdr2和cdr3)至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一。

34、在某些实施方案中，抗bcma抗原结合区的轻链可变区包括与bcma-20抗体的重链可变区的cdr(seq id no:1的位置24-34、位置50-56、位置89-97所示的cdr1、cdr2和cdr3)同一的(例如80％-100％同一的)三个cdr，以及抗bcma抗原结合区的重链可变区包括与bcma-20抗体的重链可变区cdr(分别为seq id no:2的位置31-35、位置50-66、位置99-110所示的cdr1、cdr2和cdr3)同一的(例如80％-100％同一的)三个cdr。

35、在某些实施方案中，抗bcma抗原结合区的轻链可变区包括与bcma-20抗体的轻链可变区的cdr(分别为seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21所示的cdr1、cdr2和cdr3)同一的(例如80％-100％同一的)三个cdr，以及抗bcma抗原结合区的重链可变区包括与bcma-20抗体的重链可变区cdr(分别为seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28所示的cdr1、cdr2和cdr3)同一的(例如80％-100％同一的)三个cdr。

36、在某些实施方案中，抗bcma抗原结合区的轻链可变区包括与bcma-ca8抗体的轻链可变区的cdr(分别为seq id no:3的位置24-34、位置50-56、位置89-97所示的cdr1、cdr2和cdr3)同一的(例如80％-100％同一的)三个cdr，以及抗bcma抗原结合区的重链可变区包括与bcma-ca8抗体的重链可变区的cdr(分别为seq id no:4的位置31-35、位置50-66、位置99-110所示的cdr1、cdr2和cdr3)同一的(例如80％-100％同一的)三个cdr。

37、在某些实施方案中，抗bcma抗原结合区的轻链可变区包括与bcma-ca8抗体的轻链可变区的cdr(分别为seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35所示的cdr1、cdr2和cdr3)同一的(例如80％-100％同一的)三个cdr，以及抗bcma抗原结合区的重链可变区包括与bcma-ca8抗体的重链可变区cdr(分别为seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42所示的cdr1、cdr2和cdr3)同一的(例如80％-100％同一的)三个cdr。

38、在某些实施方案中，抗bcma抗原结合区的轻链可变区包括与bcma-mo6抗体的轻链可变区的cdr(分别为seq id no:5的位置24-34、位置50-56、位置89-97所示的cdr1、cdr2和cdr3)同一的三个cdr，以及抗bcma抗原结合区的重链可变区包括与bcma-mo6抗体的重链可变区的cdr(分别为seq id no:6的位置31-35、位置50-66、位置99-110所示的cdr1、cdr2和cdr3)同一的三个cdr。

39、在某些实施方案中，抗bcma抗原结合区的轻链可变区包括与bcma-mo6抗体的轻链可变区的cdr(分别为seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49所示的cdr1、cdr2和cdr3)同一的(例如80％-100％同一的)三个cdr，以及抗bcma抗原结合区的重链可变区包括与bcma-mo6抗体的重链可变区cdr(分别为seq id no:52、seq id no:54、seq id no:56所示的cdr1、cdr2和cdr3)同一的(例如80％-100％同一的)三个cdr。

40、在某些实施方案中，car可以包含与seq id no:59、seq id no:61或seq id no-63中所示的氨基酸序列约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。

41、在某些实施方案中，编码car的核酸可以包含编码与seq id no:58、seq id no:60或seq id no:62中所示的氨基酸序列约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的核酸序列。

42、在某些实施方案中，在施用car至受试者后约28天，该car在受试者的血液中可以产生从约0.5e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约2e+07个拷贝/gdna，从约5.0e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.3e+07个拷贝/gdna，从约5.0e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约2e+07个拷贝/gdna，从约5.0e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.5e+07个拷贝/gdna，从约5.0e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.0e+07个拷贝/gdna，从约5.0e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.3e+07个拷贝/gdna，从约7.0e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.0e+07个拷贝/gdna，从约8.0e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.0e+07个拷贝/gdna，从约0.5e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约4e+06个拷贝/gdna，从约0.5e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3.5e+06个拷贝/gdna，从约1e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3.5e+06个拷贝/gdna，从约1.2e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3.2e+06个拷贝/gdna，从约0.8e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3.2e+06个拷贝/gdna，从约1.6e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3.2e+06个拷贝/gdna，从约1e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约2e+06个拷贝/gdna，从约0.6e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.8e+06个拷贝/gdna，从约3e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3.2e+06个拷贝/gdna，从约0.5e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.7e+06个拷贝/gdna，从约2e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3.2e+06个拷贝/gdna，从约1.5e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约2e+06个拷贝/gdna，或从约1e+06个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3.2e+06个拷贝/gdna范围的曲线下面积(auc)。该auc可以是中位值auc。

43、在某些实施方案中，在施用car至受试者后，该car在受试者的血液中产生从约5x104个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.3x106个拷贝/gdna，从约5x104个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.5x106个拷贝/gdna，从约5x105个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.3x106个拷贝/gdna，从约7.5x105个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1x106个拷贝/gdna，从约7x105个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1x106个拷贝/gdna，从约8x105个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1x106个拷贝/gdna，从约7.5x105个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.5x106个拷贝/gdna，从约7x105个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.5x106个拷贝/gdna，从约8x105个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.5x106个拷贝/gdna，从约0.8e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3.5e+05个拷贝/gdna，从约1e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3.5e+05个拷贝/gdna，从约1e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.6e+05个拷贝/gdna，从约1e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3.3e+05个拷贝/gdna，从约0.8e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约1.5e+05个拷贝/gdna，从约0.8e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约2e+05个拷贝/gdna，从约1e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约2e+05个拷贝/gdna，从约2e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3e+05个拷贝/gdna，从约2e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3.5e+05个拷贝/gdna，从约2e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约2.5e+05个拷贝/gdna，或从约1e+05个拷贝/μg基因组dna(个拷贝/gdna)至约3e+05个拷贝/gdna范围的最大血浆浓度(cmax)。该cmax可以是中位值cmax。

44、在某些实施方案中，该car具有从约12天至约25天，从约14天至约20天，从约6天至约22天，从约3天至约20天，从约4天至约18天，从约5天至约17天，从约6天至约16天，从约7天至约15天，从约9天至约15天，从约10天至约15天，从约10天至约14天，从约8天至约12天，从约6天至约14天，从约12天至约14天，从约8天至约11天，从约8天至约15天，或从约10天至约14天范围的tmax(car达到cmax所需的时间)。该tmax可以是中位值tmax。

45、在某些实施方案中，该car具有从约30天至约200天，从约50天至约150天，从约50天至约100天，从约60天至约80天，从约60天至约150天，从约80天至约150天，从约50天至约200天，从约50天至约60天，从约50天至约80天，从约50天至约100天，从约60天至约100天，从约80天至约100天，从约60天至约200天，从约80天至约200天，从约50天至约140天，从约60天至约140天，或从约80天至约140天范围的tlast(对应于最后可定量的car水平的时间)。该tlast可以是中位值tlast。

46、具体地，本公开的一个目的是提供靶向bcma的嵌合抗原受体的序列及其修饰的t细胞(cart-bcma)的制备方法和活性鉴定。

47、本公开提供了用于治疗bcma阳性b细胞淋巴瘤的嵌合抗原受体结构。

48、在第一方面，本发明提供了嵌合抗原受体(car)(序列)，并且其抗原结合结构域是靶向bcma细胞外区的抗体单链可变区序列。

49、在另一个实施方案中，抗原结合结构域是靶向bcma序列位置24至41位的氨基酸残基的抗体单链可变区序列。

50、在另一个实施方案中，bcma序列的ncbi登录号为ay684975.1。

51、在另一个实施方案中，该抗原结合结构域的结构如下式i所示：

52、vl-vh(i)

53、其中vh是抗体重链可变区；vl是抗体轻链可变区；并且“-”是接头肽或肽键；

54、并且，vl的氨基酸序列如seq id no:1所示，且vh的氨基酸顺序如seq id no：2所示；

55、或者，vl的氨基酸序列如seq id no:3所示，且vh的氨基酸顺序如seq id no:4所示；

56、或者，vl的氨基酸序列如seq id no:5所示，且vh的氨基酸顺序如seq id no:6所示。

57、在另一个实施方案中，接头肽的氨基酸序列如seq id no:10或seq id no:11所示。

58、在另一个实施方案中，抗体单链可变区包含人抗体、小鼠抗体、人-小鼠嵌合抗体的单链可变区。

59、在另一个实施方案中，嵌合抗原受体的结构如下式ii所示：

60、s-vl-vh-h-tm-c-cd3ζ   (ii)

61、其中,

62、s是任选的信号肽；

63、h是铰链区；

64、tm是跨膜结构域；

65、c是共刺激信号传导分子；

66、cd3ζ是衍生自cd3ζ的细胞质信号传导序列；

67、vh和vl如上所述。

68、在另一个实施方案中，s是选自cd8、cd28、gm-csf、cd4、cd137的蛋白质的信号肽或其组合。

69、在另一个实施方案中，s是衍生自cd8的信号肽。

70、在另一个实施方案中，s的氨基酸序列如seq id no:9所示。

71、在另一个实施方案中，h是选自cd8、cd28、cd137的蛋白质的铰链区或其组合。

72、在另一个实施方案中，h是衍生自cd8的铰链区。

73、在另一个实施方案中，h的氨基酸序列如seq id no:12所示。

74、在另一个实施方案中，tm是选自cd28,cd3ε,cd45,cd4,cd5,cd8,cd9,cd16,cd22,cd33,cd37,cd64,cd80,cd86,cd134,cd137,cd154的蛋白质的跨膜区，或其组合。

75、在另一个实施方案中，tm是衍生自cd8的跨膜区。

76、在另一个实施方案中，tm的序列如seq id no:13所示。

77、在另一个实施方案中，c是选自ox40,cd2,cd7,cd27,cd28,cd30,cd40,cd70,cd134,4-1bb(cd137),pd1,dap10,cds,icam-1,lfa-1(cd11a/cd18),icos(cd278),nkg2d,gitr,tlr2的蛋白质的共刺激信号传导分子或其组合。

78、在另一个实施方案中，c是衍生自4-1bb的共刺激信号传导分子。

79、在另一个实施方案中，c的氨基酸序列如seq id no:14所示。

80、在另一个实施方案中，cd3ζ的氨基酸序列如seq id no:15所示。

81、在第二方面，本发明提供了编码第一方面的嵌合抗原受体(car)的核酸分子。

82、在另一个实施方案中，所述核酸分子是分离的核酸分子。

83、在第三方面，本发明提供了包含第二方面的核酸分子的载体。

84、在另一个实施方案中，载体选自dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子或其组合。

85、在另一个实施方案中，所述载体是慢病毒载体。

86、在第四方面，本发明提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含第三方面的载体或具有整合到染色体中的第二方面的外源核酸分子或表达第一方面的car。

87、在另一个实施方案中，细胞是分离的细胞，和/或细胞是基因工程化的细胞。

88、在另一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。

89、在另一个实施方案中，所述细胞是t细胞。

90、在第五方面，本发明提供了制备表达第一方面的car的car-t细胞的方法，该方法包括以下步骤：将第二方面的核酸分子或第三方面的载体转导到t细胞中，从而获得car-t细胞。

91、在第六方面，本发明提供了一种制备物，其包含第一方面的嵌合抗原受体、第二方面的核酸分子、第三方面的载体或第四方面的细胞，以及可药用载体、稀释剂或赋形剂。

92、在另一个实施方案中，制备物是液体制备物。

93、在另一个实施方案中，制备物的剂型是注射剂。

94、在另一个实施方案中，制备物中car-t细胞的浓度为1×10 3-1×108个细胞/ml、或1×10 4-1×107个细胞/ml。

95、在第七方面，本发明提供了第一方面的嵌合抗原受体、第二方面的核酸分子、第三方面的载体或第四方面的细胞用于制备预防和/或治疗肿瘤或癌症的药物或制备物的用途。

96、在另一个实施方案中，肿瘤选自血液学肿瘤、实体瘤或其组合。

97、在一个实施例中，癌症是b细胞淋巴瘤。

98、在另一个实施方案中，血液肿瘤选自急性髓性白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴母细胞性白血病(all)、弥散性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)或其组合。

99、在另一个实施方案中，实体瘤选自胃癌、胃癌的腹膜转移、肝癌、白血病、肾癌、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴瘤、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、胶质瘤、子宫内膜癌或其组合。

100、在另一个实施方案中，肿瘤是bcma阳性肿瘤，例如bcma阳性b细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤或浆细胞白血病。

101、在第八方面，本发明提供了用于制备第四方面的细胞的试剂盒，该试剂盒包含容器，且第二方面的核酸分子或第三方面的载体位于容器中。

102、在第九方面，本发明提供了第四方面的细胞或第六方面的制备物用于预防和/或治疗癌症或肿瘤的用途。

103、在第十方面，本发明提供了治疗疾病的方法，包括向需要治疗的受试者施用合适量的第四方面的细胞或第六方面的制备物。

104、在另一实施方案中，该疾病是癌症或肿瘤。

105、应当理解，上述本公开的各个技术特征和下文(如在实施例中)具体描述的各个技术特征可以在本公开的范围内相互组合，以构成新的或优选的技术方案，由于篇幅的限制，无需在此逐一描述。

106、                        序列表

107、<110>  上海赛比曼生物科技有限公司

108、<120>  靶向bcma的嵌合抗原受体

109、<130>  11299/008884-wo1

110、<150>  17/476,661

111、<151>  2021-09-16

112、<150>  63/212,289

113、<151>  2021-06-18

114、<150>  63/153,666

115、<151>  2021-02-25

116、<150>  63/120,692

117、<151>  2020-12-02

118、<160>  63

119、<170>  patentin版本3.5

120、<210>  1

121、<211>  107

122、<212>  prt

123、<213>  人工序列

124、<220>

125、<223>  bcma-20轻链可变区

126、<400>  1

127、asp ile gln met thr gln ser pro ser ser leu ser ala ser val gly

128、1               5                   10                  15

129、asp arg val thr ile thr cys arg ala ser gln gly ile ser asn tyr

130、            20                  25                  30

131、leu asn trp tyr gln gln lys pro gly lys ala pro lys pro leu ile

132、        35                  40                  45

133、tyr tyr thr ser asn leu gln ser gly val pro ser arg phe ser gly

134、    50                  55                  60

135、ser gly ser gly thr asp tyr thr leu thr ile ser ser leu gln pro

136、65                  70                  75                  80

137、glu asp phe ala thr tyr tyr cys met gly gln thr ile ser ser tyr

138、                85                  90                  95

139、thr phe gly gln gly thr lys leu glu ile lys

140、            100                 105

141、<210>  2

142、<211>  121

143、<212>  prt

144、<213>  人工序列

145、<220>

146、<223>  bcma-20重链可变区

147、<400>  2

148、glu val gln leu val glu ser gly gly gly leu val gln pro gly gly

149、1               5                   10                  15

150、ser leu arg leu ser cys ala ala ser gly phe thr phe ser asn phe

151、            20                  25                  30

152、asp met ala trp val arg gln ala pro gly lys gly leu val trp val

153、        35                  40                  45

154、ser ser ile thr thr gly ala asp his ala ile tyr ala asp ser val

155、    50                  55                  60

156、lys gly arg phe thr ile ser arg asp asn ala lys asn thr leu tyr

157、65                  70                  75                  80

158、leu gln met asn ser leu arg ala glu asp thr ala val tyr tyr cys

159、                85                  90                  95

160、val arg his gly tyr tyr asp gly tyr his leu phe asp tyr trp gly

161、            100                 105                 110

162、gln gly thr leu val thr val ser ser

163、        115                 120

164、<210>  3

165、<211>  108

166、<212>  prt

167、<213>  人工序列

168、<220>

169、<223>  bcma-ca8轻链可变区

170、<400>  3

171、asp ile gln leu thr gln thr thr ser ser leu ser ala ser leu gly

172、1               5                   10                  15

173、asp arg val thr ile ser cys ser ala ser thr thr thr ser asn tyr

174、            20                  25                  30

175、leu asn trp tyr gln gln lys pro asp gly thr val glu leu val ile

176、        35                  40                  45

177、tyr tyr thr ser asn leu his gly gly gly pro ser arg phe ser gly

178、    50                  55                  60

179、ser gly ser gly thr asp tyr ser leu thr ile gly tyr leu glu pro

180、65                  70                  75                  80

181、glu asp val ala thr tyr tyr cys gln gln tyr arg lys leu pro trp

182、                85                  90                  95

183、thr phe gly gly gly ser lys leu glu ile lys arg

184、            100                 105

185、<210>  4

186、<211>  121

187、<212>  prt

188、<213>  人工序列

189、<220>

190、<223>  bcma-ca8重链可变区

191、<400>  4

192、glu val gln leu gln gln ser gly ala val leu ala arg pro gly ala

193、1               5                   10                  15

194、ser val lys met ser cys lys gly ser gly tyr thr phe thr asn tyr

195、            20                  25                  30

196、trp met his trp val lys gln arg pro gly gln gly leu glu trp ile

197、        35                  40                  45

198、gly ala thr tyr arg gly his ser asp thr tyr tyr asn gln lys phe

199、    50                  55                  60

200、lys gly lys ala lys leu thr ala val thr ser thr ser thr ala tyr

201、65                  70                  75                  80

202、met glu leu ser ser leu thr asn glu asp ser ala val tyr tyr cys

203、                85                  90                  95

204、thr arg gly ala ile tyr asn gly tyr asp val leu asp asn trp gly

205、            100                 105                 110

206、gln gly thr leu val thr val ser ser

207、        115                 120

208、<210>  5

209、<211>  108

210、<212>  prt

211、<213>  人工序列

212、<220>

213、<223>  bcma-mo6轻链可变区

214、<400>  5

215、asp ile gln met thr gln ser pro ser ser leu ser ala ser val gly

216、1               5                   10                  15

217、asp arg val thr ile thr cys ser ala ser gln asp ile ser asn tyr

218、            20                  25                  30

219、leu asn trp tyr gln gln lys pro gly lys ala pro lys leu leu ile

220、        35                  40                  45

221、tyr tyr thr ser asn leu his ser gly val pro ser arg phe ser gly

222、    50                  55                  60

223、ser gly ser gly thr asp phe thr leu thr ile ser ser leu gln pro

224、65                  70                  75                  80

225、glu asp phe ala thr tyr tyr cys gln gln tyr arg lys leu pro trp

226、                85                  90                  95

227、thr phe gly gln gly thr lys leu glu ile lys arg

228、            100                 105

229、<210>  6

230、<211>  121

231、<212>  prt

232、<213>  人工序列

233、<220>

234、<223>  bcma-mo6重链可变区

235、<400>  6

236、gln val gln leu val gln ser gly ala glu val lys lys pro gly ser

237、1               5                   10                  15

238、ser val lys val ser cys lys ala ser gly gly thr phe ser asn tyr

239、            20                  25                  30

240、trp met his trp val arg gln ala pro gly gln gly leu glu trp met

241、        35                  40                  45

242、gly ala thr tyr arg gly his ser asp thr tyr tyr asn gln lys phe

243、    50                  55                  60

244、lys gly arg val thr ile thr ala asp lys ser thr ser thr ala tyr

245、65                  70                  75                  80

246、met glu leu ser ser leu arg ser glu asp thr ala val tyr tyr cys

247、                85                  90                  95

248、ala arg gly ala ile tyr asp gly tyr asp val leu asp asn trp gly

249、            100                 105                 110

250、gln gly thr leu val thr val ser ser

251、        115                 120

252、<210>  7

253、<211>  111

254、<212>  prt

255、<213>  人工序列

256、<220>

257、<223>  bcma-1轻链可变区

258、<400>  7

259、asp ile val leu thr gln ser pro pro ser leu ala met ser leu gly

260、1               5                   10                  15

261、lys arg ala thr ile ser cys arg ala ser glu ser val thr ile leu

262、            20                  25                  30

263、gly ser his leu ile his trp tyr gln gln lys pro gly gln pro pro

264、        35                  40                  45

265、thr leu leu ile gln leu ala ser asn val gln thr gly val pro ala

266、    50                  55                  60

267、arg phe ser gly ser gly ser arg thr asp phe thr leu thr ile asp

268、65                  70                  75                  80

269、pro val glu glu asp asp val ala val tyr tyr cys leu gln ser arg

270、                85                  90                  95

271、thr ile pro arg thr phe gly gly gly thr lys leu glu ile lys

272、            100                 105                 110

273、<210>  8

274、<211>  117

275、<212>  prt

276、<213>  人工序列

277、<220>

278、<223>  bcma-1重链可变区

279、<400>  8

280、gln ile gln leu val gln ser gly pro glu leu lys lys pro gly glu

281、1               5                   10                  15

282、thr val lys ile ser cys lys ala ser gly tyr thr phe thr asp tyr

283、            20                  25                  30

284、ser ile asn trp val lys arg ala pro gly lys gly leu lys trp met

285、        35                  40                  45

286、gly trp ile asn thr glu thr arg glu pro ala tyr ala tyr asp phe

287、    50                  55                  60

288、arg gly arg phe ala phe ser leu glu thr ser ala ser thr ala tyr

289、65                  70                  75                  80

290、leu gln ile asn asn leu lys tyr glu asp thr ala thr tyr phe cys

291、                85                  90                  95

292、ala leu asp tyr ser tyr ala met asp tyr trp gly gln gly thr ser

293、            100                 105                 110

294、val thr val ser ser

295、        115

296、<210>  9

297、<211>  21

298、<212>  prt

299、<213>  人工序列

300、<220>

301、<223>  cd8信号肽

302、<400>  9

303、met ala leu pro val thr ala leu leu leu pro leu ala leu leu leu

304、1               5                   10                  15

305、his ala ala arg pro

306、            20

307、<210>  10

308、<211>  18

309、<212>  prt

310、<213>  人工序列

311、<220>

312、<223>  接头

313、<400>  10

314、gly ser thr ser gly ser gly lys pro gly ser gly glu gly ser thr

315、1               5                   10                  15

316、lys gly

317、<210>  11

318、<211>  15

319、<212>  prt

320、<213>  人工序列

321、<220>

322、<223>  接头

323、<400>  11

324、gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser

325、1               5                   10                  15

326、<210>  12

327、<211>  55

328、<212>  prt

329、<213>  人工序列

330、<220>

331、<223>  铰链

332、<400>  12

333、phe val pro val phe leu pro ala lys pro thr thr thr pro ala pro

334、1               5                   10                  15

335、arg pro pro thr pro ala pro thr ile ala ser gln pro leu ser leu

336、            20                  25                  30

337、arg pro glu ala cys arg pro ala ala gly gly ala val his thr arg

338、        35                  40                  45

339、gly leu asp phe ala cys asp

340、    50                  55

341、<210>  13

342、<211>  24

343、<212>  prt

344、<213>  人工序列

345、<220>

346、<223>  cd8跨膜结构域

347、<400>  13

348、ile tyr ile trp ala pro leu ala gly thr cys gly val leu leu leu

349、1               5                   10                  15

350、ser leu val ile thr leu tyr cys

351、            20

352、<210>  14

353、<211>  42

354、<212>  prt

355、<213>  人工序列

356、<220>

357、<223>  4-1bb共刺激序列

358、<400>  14

359、lys arg gly arg lys lys leu leu tyr ile phe lys gln pro phe met

360、1               5                   10                  15

361、arg pro val gln thr thr gln glu glu asp gly cys ser cys arg phe

362、            20                  25                  30

363、pro glu glu glu glu gly gly cys glu leu

364、        35                  40

365、<210>  15

366、<211>  113

367、<212>  prt

368、<213>  人工序列

369、<220>

370、<223>  cd3ζ

371、<400>  15

372、arg val lys phe ser arg ser ala asp ala pro ala tyr gln gln gly

373、1               5                   10                  15

374、gln asn gln leu tyr asn glu leu asn leu gly arg arg glu glu tyr

375、            20                  25                  30

376、asp val leu asp lys arg arg gly arg asp pro glu met gly gly lys

377、        35                  40                  45

378、pro gln arg arg lys asn pro gln glu gly leu tyr asn glu leu gln

379、    50                  55                  60

380、lys asp lys met ala glu ala tyr ser glu ile gly met lys gly glu

381、65                  70                  75                  80

382、arg arg arg gly lys gly his asp gly leu tyr gln gly leu ser thr

383、                85                  90                  95

384、ala thr lys asp thr tyr asp ala leu his met gln ala leu pro pro

385、            100                 105                 110

386、arg

387、<210>  16

388、<211>  23

389、<212>  prt

390、<213>  人工序列

391、<220>

392、<223>  合成的

393、<400>  16

394、asp ile gln met thr gln ser pro ser ser leu ser ala ser val gly

395、1               5                   10                  15

396、asp arg val thr ile thr cys

397、            20

398、<210>  17

399、<211>  11

400、<212>  prt

401、<213>  人工序列

402、<220>

403、<223>  合成的

404、<400>  17

405、arg ala ser gln gly ile ser asn tyr leu asn

406、1               5                   10

407、<210>  18

408、<211>  15

409、<212>  prt

410、<213>  人工序列

411、<220>

412、<223>  合成的

413、<400>  18

414、trp tyr gln gln lys pro gly lys ala pro lys pro leu ile tyr

415、1               5                   10                  15

416、<210>  19

417、<211>  7

418、<212>  prt

419、<213>  人工序列

420、<220>

421、<223>  合成的

422、<400>  19

423、tyr thr ser asn leu gln ser

424、1               5

425、<210>  20

426、<211>  32

427、<212>  prt

428、<213>  人工序列

429、<220>

430、<223>  合成的

431、<400>  20

432、gly val pro ser arg phe ser gly ser gly ser gly thr asp tyr thr

433、1               5                   10                  15

434、leu thr ile ser ser leu gln pro glu asp phe ala thr tyr tyr cys

435、            20                  25                  30

436、<210>  21

437、<211>  9

438、<212>  prt

439、<213>  人工序列

440、<220>

441、<223>  合成的

442、<400>  21

443、met gly gln thr ile ser ser tyr thr

444、1               5

445、<210>  22

446、<211>  9

447、<212>  prt

448、<213>  人工序列

449、<220>

450、<223>  合成的

451、<400>  22

452、phe gly gln gly thr lys leu glu ile

453、1               5

454、<210>  23

455、<211>  30

456、<212>  prt

457、<213>  人工序列

458、<220>

459、<223>  合成的

460、<400>  23

461、glu val gln leu val glu ser gly gly gly leu val gln pro gly gly

462、1               5                   10                  15

463、ser leu arg leu ser cys ala ala ser gly phe thr phe ser

464、            20                  25                  30

465、<210>  24

466、<211>  5

467、<212>  prt

468、<213>  人工序列

469、<220>

470、<223>  合成的

471、<400>  24

472、asn phe asp met ala

473、1               5

474、<210>  25

475、<211>  14

476、<212>  prt

477、<213>  人工序列

478、<220>

479、<223>  合成的

480、<400>  25

481、trp val arg gln ala pro gly lys gly leu val trp val ser

482、1               5                   10

483、<210>  26

484、<211>  17

485、<212>  prt

486、<213>  人工序列

487、<220>

488、<223>  合成的

489、<400>  26

490、ser ile thr thr gly ala asp his ala ile tyr ala asp ser val lys

491、1               5                   10                  15

492、gly

493、<210>  27

494、<211>  32

495、<212>  prt

496、<213>  人工序列

497、<220>

498、<223>  合成的

499、<400>  27

500、arg phe thr ile ser arg asp asn ala lys asn thr leu tyr leu gln

501、1               5                   10                  15

502、met asn ser leu arg ala glu asp thr ala val tyr tyr cys val arg

503、            20                  25                  30

504、<210>  28

505、<211>  12

506、<212>  prt

507、<213>  人工序列

508、<220>

509、<223>  合成的

510、<400>  28

511、his gly tyr tyr asp gly tyr his leu phe asp tyr

512、1               5                   10

513、<210>  29

514、<211>  11

515、<212>  prt

516、<213>  人工序列

517、<220>

518、<223>  合成的

519、<400>  29

520、trp gly gln gly thr leu val thr val ser ser

521、1               5                   10

522、<210>  30

523、<211>  23

524、<212>  prt

525、<213>  人工序列

526、<220>

527、<223>  合成的

528、<400>  30

529、asp ile gln leu thr gln thr thr ser ser leu ser ala ser leu gly

530、1               5                   10                  15

531、asp arg val thr ile ser cys

532、            20

533、<210>  31

534、<211>  11

535、<212>  prt

536、<213>  人工序列

537、<220>

538、<223>  合成的

539、<400>  31

540、ser ala ser thr thr thr ser asn tyr leu asn

541、1               5                   10

542、<210>  32

543、<211>  15

544、<212>  prt

545、<213>  人工序列

546、<220>

547、<223>  合成的

548、<400>  32

549、trp tyr gln gln lys pro asp gly thr val glu leu val ile tyr

550、1               5                   10                  15

551、<210>  33

552、<211>  7

553、<212>  prt

554、<213>  人工序列

555、<220>

556、<223>  合成的

557、<400>  33

558、tyr thr ser asn leu his gly

559、1               5

560、<210>  34

561、<211>  32

562、<212>  prt

563、<213>  人工序列

564、<220>

565、<223>  合成的

566、<400>  34

567、gly gly pro ser arg phe ser gly ser gly ser gly thr asp tyr ser

568、1               5                   10                  15

569、leu thr ile gly tyr leu glu pro glu asp val ala thr tyr tyr cys

570、            20                  25                  30

571、<210>  35

572、<211>  9

573、<212>  prt

574、<213>  人工序列

575、<220>

576、<223>  合成的

577、<400>  35

578、gln gln tyr arg lys leu pro trp thr

579、1               5

580、<210>  36

581、<211>  11

582、<212>  prt

583、<213>  人工序列

584、<220>

585、<223>  合成的

586、<400>  36

587、phe gly gly gly ser lys leu glu ile lys arg

588、1               5                   10

589、<210>  37

590、<211>  30

591、<212>  prt

592、<213>  人工序列

593、<220>

594、<223>  合成的

595、<400>  37

596、glu val gln leu gln gln ser gly ala val leu ala arg pro gly ala

597、1               5                   10                  15

598、ser val lys met ser cys lys gly ser gly tyr thr phe thr

599、            20                  25                  30

600、<210>  38

601、<211>  5

602、<212>  prt

603、<213>  人工序列

604、<220>

605、<223>  合成的

606、<400>  38

607、asn tyr trp met his

608、1               5

609、<210>  39

610、<211>  14

611、<212>  prt

612、<213>  人工序列

613、<220>

614、<223>  合成的

615、<400>  39

616、trp val lys gln arg pro gly gln gly leu glu trp ile gly

617、1               5                   10

618、<210>  40

619、<211>  17

620、<212>  prt

621、<213>  人工序列

622、<220>

623、<223>  合成的

624、<400>  40

625、ala thr tyr arg gly his ser asp thr tyr tyr asn gln lys phe lys

626、1               5                   10                  15

627、gly

628、<210>  41

629、<211>  32

630、<212>  prt

631、<213>  人工序列

632、<220>

633、<223>  合成的

634、<400>  41

635、lys ala lys leu thr ala val thr ser thr ser thr ala tyr met glu

636、1               5                   10                  15

637、leu ser ser leu thr asn glu asp ser ala val tyr tyr cys thr arg

638、            20                  25                  30

639、<210>  42

640、<211>  12

641、<212>  prt

642、<213>  人工序列

643、<220>

644、<223>  合成的

645、<400>  42

646、gly ala ile tyr asn gly tyr asp val leu asp asn

647、1               5                   10

648、<210>  43

649、<211>  11

650、<212>  prt

651、<213>  人工序列

652、<220>

653、<223>  合成的

654、<400>  43

655、trp gly gln gly thr leu val thr val ser ser

656、1               5                   10

657、<210>  44

658、<211>  23

659、<212>  prt

660、<213>  人工序列

661、<220>

662、<223>  合成的

663、<400>  44

664、asp ile gln met thr gln ser pro ser ser leu ser ala ser val gly

665、1               5                   10                  15

666、asp arg val thr ile thr cys

667、            20

668、<210>  45

669、<211>  11

670、<212>  prt

671、<213>  人工序列

672、<220>

673、<223>  合成的

674、<400>  45

675、ser ala ser gln asp ile ser asn tyr leu asn

676、1               5                   10

677、<210>  46

678、<211>  15

679、<212>  prt

680、<213>  人工序列

681、<220>

682、<223>  合成的

683、<400>  46

684、trp tyr gln gln lys pro gly lys ala pro lys leu leu ile tyr

685、1               5                   10                  15

686、<210>  47

687、<211>  7

688、<212>  prt

689、<213>  人工序列

690、<220>

691、<223>  合成的

692、<400>  47

693、tyr thr ser asn leu his ser

694、1               5

695、<210>  48

696、<211>  32

697、<212>  prt

698、<213>  人工序列

699、<220>

700、<223>  合成的

701、<400>  48

702、gly val pro ser arg phe ser gly ser gly ser gly thr asp phe thr

703、1               5                   10                  15

704、leu thr ile ser ser leu gln pro glu asp phe ala thr tyr tyr cys

705、            20                  25                  30

706、<210>  49

707、<211>  9

708、<212>  prt

709、<213>  人工序列

710、<220>

711、<223>  合成的

712、<400>  49

713、gln gln tyr arg lys leu pro trp thr

714、1               5

715、<210>  50

716、<211>  11

717、<212>  prt

718、<213>  人工序列

719、<220>

720、<223>  合成的

721、<400>  50

722、phe gly gln gly thr lys leu glu ile lys arg

723、1               5                   10

724、<210>  51

725、<211>  30

726、<212>  prt

727、<213>  人工序列

728、<220>

729、<223>  合成的

730、<400>  51

731、gln val gln leu val gln ser gly ala glu val lys lys pro gly ser

732、1               5                   10                  15

733、ser val lys val ser cys lys ala ser gly gly thr phe ser

734、            20                  25                  30

735、<210>  52

736、<211>  5

737、<212>  prt

738、<213>  人工序列

739、<220>

740、<223>  合成的

741、<400>  52

742、asn tyr trp met his

743、1               5

744、<210>  53

745、<211>  14

746、<212>  prt

747、<213>  人工序列

748、<220>

749、<223>  合成的

750、<400>  53

751、trp val arg gln ala pro gly gln gly leu glu trp met gly

752、1               5                   10

753、<210>  54

754、<211>  17

755、<212>  prt

756、<213>  人工序列

757、<220>

758、<223>  合成的

759、<400>  54

760、ala thr tyr arg gly his ser asp thr tyr tyr asn gln lys phe lys

761、1               5                   10                  15

762、gly

763、<210>  55

764、<211>  32

765、<212>  prt

766、<213>  人工序列

767、<220>

768、<223>  合成的

769、<400>  55

770、arg val thr ile thr ala asp lys ser thr ser thr ala tyr met glu

771、1               5                   10                  15

772、leu ser ser leu arg ser glu asp thr ala val tyr tyr cys ala arg

773、            20                  25                  30

774、<210>  56

775、<211>  12

776、<212>  prt

777、<213>  人工序列

778、<220>

779、<223>  合成的

780、<400>  56

781、gly ala ile tyr asp gly tyr asp val leu asp asn

782、1               5                   10

783、<210>  57

784、<211>  11

785、<212>  prt

786、<213>  人工序列

787、<220>

788、<223>  合成的

789、<400>  57

790、trp gly gln gly thr leu val thr val ser ser

791、1               5                   10

792、<210>  58

793、<211>  1494

794、<212>  dna

795、<213>  人工序列

796、<220>

797、<223>  合成的

798、<400>  58

799、atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg      60

800、ccggacatcc agatgaccca gtccccctcc tccctgtccg cctccgtggg cgaccgggtg     120

801、accatcacct gccgggcctc ccagggcatc tccaactacc tgaactggta ccagcagaag     180

802、cccggcaagg cccccaagcc cctgatctac tacacctcca acctgcagtc cggcgtgccc     240

803、tcccggttct ccggctccgg ctccggcacc gactacaccc tgaccatctc ctccctgcag     300

804、cccgaggact tcgccaccta ctactgcatg ggccagacca tctcctccta caccttcggc     360

805、cagggcacca agctggagat caagggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc     420

806、ggcggatctg aggtgcagct ggtggagtcc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggctcc     480

807、ctgcggctgt cctgcgccgc ctccggcttc accttctcca acttcgacat ggcctgggtg     540

808、cggcaggccc ccggcaaggg cctggtgtgg gtgtcctcca tcaccaccgg cgccgaccac     600

809、gccatctacg ccgactccgt gaagggccgg ttcaccatct cccgggacaa cgccaagaac     660

810、accctgtacc tgcagatgaa ctccctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgtg     720

811、cggcacggct actacgacgg ctaccacctg ttcgactact ggggccaggg caccctggtg     780

812、accgtgtcct ccttcgtgcc ggtcttcctg ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg     840

813、cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg     900

814、tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc     960

815、tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc    1020

816、ctttactgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga    1080

817、ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa    1140

818、ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag    1200

819、ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg    1260

820、gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag    1320

821、gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg    1380

822、atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca    1440

823、gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaa          1494

824、<210>  59

825、<211>  497

826、<212>  prt

827、<213>  人工序列

828、<220>

829、<223>  合成的

830、<400>  59

831、met ala leu pro val thr ala leu leu leu pro leu ala leu leu leu

832、1               5                   10                  15

833、his ala ala arg pro asp ile gln met thr gln ser pro ser ser leu

834、            20                  25                  30

835、ser ala ser val gly asp arg val thr ile thr cys arg ala ser gln

836、        35                  40                  45

837、gly ile ser asn tyr leu asn trp tyr gln gln lys pro gly lys ala

838、    50                  55                  60

839、pro lys pro leu ile tyr tyr thr ser asn leu gln ser gly val pro

840、65                  70                  75                  80

841、ser arg phe ser gly ser gly ser gly thr asp tyr thr leu thr ile

842、                85                  90                  95

843、ser ser leu gln pro glu asp phe ala thr tyr tyr cys met gly gln

844、            100                 105                 110

845、thr ile ser ser tyr thr phe gly gln gly thr lys leu glu ile lys

846、        115                 120                 125

847、gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser glu

848、    130                 135                 140

849、val gln leu val glu ser gly gly gly leu val gln pro gly gly ser

850、145                 150                 155                 160

851、leu arg leu ser cys ala ala ser gly phe thr phe ser asn phe asp

852、                165                 170                 175

853、met ala trp val arg gln ala pro gly lys gly leu val trp val ser

854、            180                 185                 190

855、ser ile thr thr gly ala asp his ala ile tyr ala asp ser val lys

856、        195                 200                 205

857、gly arg phe thr ile ser arg asp asn ala lys asn thr leu tyr leu

858、    210                 215                 220

859、gln met asn ser leu arg ala glu asp thr ala val tyr tyr cys val

860、225                 230                 235                 240

861、arg his gly tyr tyr asp gly tyr his leu phe asp tyr trp gly gln

862、                245                 250                 255

863、gly thr leu val thr val ser ser phe val pro val phe leu pro ala

864、            260                 265                 270

865、lys pro thr thr thr pro ala pro arg pro pro thr pro ala pro thr

866、        275                 280                 285

867、ile ala ser gln pro leu ser leu arg pro glu ala cys arg pro ala

868、    290                 295                 300

869、ala gly gly ala val his thr arg gly leu asp phe ala cys asp ile

870、305                 310                 315                 320

871、tyr ile trp ala pro leu ala gly thr cys gly val leu leu leu ser

872、                325                 330                 335

873、leu val ile thr leu tyr cys lys arg gly arg lys lys leu leu tyr

874、            340                 345                 350

875、ile phe lys gln pro phe met arg pro val gln thr thr gln glu glu

876、        355                 360                 365

877、asp gly cys ser cys arg phe pro glu glu glu glu gly gly cys glu

878、    370                 375                 380

879、leu arg val lys phe ser arg ser ala asp ala pro ala tyr gln gln

880、385                 390                 395                 400

881、gly gln asn gln leu tyr asn glu leu asn leu gly arg arg glu glu

882、                405                 410                 415

883、tyr asp val leu asp lys arg arg gly arg asp pro glu met gly gly

884、            420                 425                 430

885、lys pro arg arg lys asn pro gln glu gly leu tyr asn glu leu gln

886、        435                 440                 445

887、lys asp lys met ala glu ala tyr ser glu ile gly met lys gly glu

888、    450                 455                 460

889、arg arg arg gly lys gly his asp gly leu tyr gln gly leu ser thr

890、465                 470                 475                 480

891、ala thr lys asp thr tyr asp ala leu his met gln ala leu pro pro

892、                485                 490                 495

893、arg

894、<210>  60

895、<211>  1497

896、<212>  dna

897、<213>  人工序列

898、<220>

899、<223>  合成的

900、<400>  60

901、atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg      60

902、ccggatatcc agctgaccca gaccacaagc agcctgagcg cctccctggg cgacagggtg     120

903、accattagct gcagcgccag ccaggacatc agcaactacc tgaactggta ccagcagaag     180

904、cccgacggca ccgtggagct cgtgatctac tacacctcca acctgcacag cggcgtgccc     240

905、agcaggttct ctggcagcgg cagcggcacc gactacagcc tgaccatcgg ctatctggag     300

906、cccgaggacg tcgccaccta ctactgccag cagtacagga agctgccctg gaccttcggc     360

907、ggaggctcta agctggagat taagcgtggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt     420

908、ggcggcggat ctgaggtgca gctgcagcag agcggcgccg tgctggccag gcccggagct     480

909、agcgtgaaga tgagctgcaa gggcagcggc tacaccttca ccaactactg gatgcactgg     540

910、gtgaaacaga ggcccggcca gggactggag tggatcggcg ccacctacag gggccacagc     600

911、gacacctact acaaccagaa gttcaagggc aaggccaagc tgaccgccgt gacctcaacc     660

912、agcaccgcct acatggaact gagcagcctg accaacgagg acagcgccgt ctattactgc     720

913、accaggggcg ccatctacaa cggctacgac gtgctggaca attggggcca gggaacacta     780

914、gtgaccgtgt ccagcttcgt gccggtcttc ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg     840

915、ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag     900

916、gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat     960

917、atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc    1020

918、accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg    1080

919、agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa    1140

920、gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag    1200

921、cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt    1260

922、ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct    1320

923、caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt    1380

924、gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt    1440

925、acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa       1497

926、<210>  61

927、<211>  498

928、<212>  prt

929、<213>  人工序列

930、<220>

931、<223>  合成的

932、<400>  61

933、met ala leu pro val thr ala leu leu leu pro leu ala leu leu leu

934、1               5                   10                  15

935、his ala ala arg pro asp ile gln leu thr gln thr thr ser ser leu

936、            20                  25                  30

937、ser ala ser leu gly asp arg val thr ile ser cys ser ala ser gln

938、        35                  40                  45

939、asp ile ser asn tyr leu asn trp tyr gln gln lys pro asp gly thr

940、    50                  55                  60

941、val glu leu val ile tyr tyr thr ser asn leu his ser gly val pro

942、65                  70                  75                  80

943、ser arg phe ser gly ser gly ser gly thr asp tyr ser leu thr ile

944、                85                  90                  95

945、gly tyr leu glu pro glu asp val ala thr tyr tyr cys gln gln tyr

946、            100                 105                 110

947、arg lys leu pro trp thr phe gly gly gly ser lys leu glu ile lys

948、        115                 120                 125

949、arg gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser

950、    130                 135                 140

951、glu val gln leu gln gln ser gly ala val leu ala arg pro gly ala

952、145                 150                 155                 160

953、ser val lys met ser cys lys gly ser gly tyr thr phe thr asn tyr

954、                165                 170                 175

955、trp met his trp val lys gln arg pro gly gln gly leu glu trp ile

956、            180                 185                 190

957、gly ala thr tyr arg gly his ser asp thr tyr tyr asn gln lys phe

958、        195                 200                 205

959、lys gly lys ala lys leu thr ala val thr ser thr ser thr ala tyr

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965、gln gly thr leu val thr val ser ser phe val pro val phe leu pro

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973、ile tyr ile trp ala pro leu ala gly thr cys gly val leu leu leu

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975、ser leu val ile thr leu tyr cys lys arg gly arg lys lys leu leu

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977、tyr ile phe lys gln pro phe met arg pro val gln thr thr gln glu

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979、glu asp gly cys ser cys arg phe pro glu glu glu glu gly gly cys

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981、glu leu arg val lys phe ser arg ser ala asp ala pro ala tyr gln

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983、gln gly gln asn gln leu tyr asn glu leu asn leu gly arg arg glu

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985、glu tyr asp val leu asp lys arg arg gly arg asp pro glu met gly

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987、gly lys pro arg arg lys asn pro gln glu gly leu tyr asn glu leu

988、        435                 440                 445

989、gln lys asp lys met ala glu ala tyr ser glu ile gly met lys gly

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991、glu arg arg arg gly lys gly his asp gly leu tyr gln gly leu ser

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993、thr ala thr lys asp thr tyr asp ala leu his met gln ala leu pro

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995、pro arg

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1000、<220>

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1030、<212>  prt

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1032、<220>

1033、<223>  合成的

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1039、ser ala ser val gly asp arg val thr ile thr cys ser ala ser gln

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1041、asp ile ser asn tyr leu asn trp tyr gln gln lys pro gly lys ala

1042、    50                  55                  60

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1045、ser arg phe ser gly ser gly ser gly thr asp phe thr leu thr ile

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1047、ser ser leu gln pro glu asp phe ala thr tyr tyr cys gln gln tyr

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1049、arg lys leu pro trp thr phe gly gln gly thr lys leu glu ile lys

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1051、arg gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser

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1055、ser val lys val ser cys lys ala ser gly gly thr phe ser asn tyr

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1057、trp met his trp val arg gln ala pro gly gln gly leu glu trp met

1058、            180                 185                 190

1059、gly ala thr tyr arg gly his ser asp thr tyr tyr asn gln lys phe

1060、        195                 200                 205

1061、lys gly arg val thr ile thr ala asp lys ser thr ser thr ala tyr

1062、    210                 215                 220

1063、met glu leu ser ser leu arg ser glu asp thr ala val tyr tyr cys

1064、225                 230                 235                 240

1065、ala arg gly ala ile tyr asp gly tyr asp val leu asp asn trp gly

1066、                245                 250                 255

1067、gln gly thr leu val thr val ser ser phe val pro val phe leu pro

1068、            260                 265                 270

1069、ala lys pro thr thr thr pro ala pro arg pro pro thr pro ala pro

1070、        275                 280                 285

1071、thr ile ala ser gln pro leu ser leu arg pro glu ala cys arg pro

1072、    290                 295                 300

1073、ala ala gly gly ala val his thr arg gly leu asp phe ala cys asp

1074、305                 310                 315                 320

1075、ile tyr ile trp ala pro leu ala gly thr cys gly val leu leu leu

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1077、ser leu val ile thr leu tyr cys lys arg gly arg lys lys leu leu

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1081、glu asp gly cys ser cys arg phe pro glu glu glu glu gly gly cys

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1085、gln gly gln asn gln leu tyr asn glu leu asn leu gly arg arg glu

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1087、glu tyr asp val leu asp lys arg arg gly arg asp pro glu met gly

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1089、gly lys pro arg arg lys asn pro gln glu gly leu tyr asn glu leu

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1091、gln lys asp lys met ala glu ala tyr ser glu ile gly met lys gly

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1093、glu arg arg arg gly lys gly his asp gly leu tyr gln gly leu ser

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1095、thr ala thr lys asp thr tyr asp ala leu his met gln ala leu pro

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1097、pro arg