用于扩增T细胞的双特异性构建体和相关方法与流程

本发明涉及t细胞。特别地，本发明涉及用于离体扩增t细胞的双特异性构建体以及相关组合物和方法。

背景技术：

1、过继性细胞转移(act)将细胞转移到患者体内。细胞可以来源于该患者或来源于另一个个体。细胞最常见来源于免疫系统，其目标是改进免疫机能和特性。在自体癌症免疫疗法中，t细胞从患者身上提取、进行基因修饰、在体外培养并返还至同一患者。

2、自体肿瘤浸润淋巴细胞(til)或基因重定向的外周血单核细胞的过继性转移已在实验上使用，以治疗患有晚期实体瘤(包括黑色素瘤和大肠癌)的患者，以及患有表达cd19的血液恶性肿瘤、子宫颈癌、淋巴瘤、白血病、胆管癌、神经母细胞瘤、肺癌、乳腺癌、肉瘤、黑色素瘤、复发/难治性cd19+b细胞恶性肿瘤(包括携带混合谱系白血病(mll)重排的b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all))的患者。调节性t细胞的输入已用于治疗1型糖尿病以及其他自身免疫病。

3、loffler等(2000；blood；95:2098-2103和美国专利号7575923)描述了新型单链多功能多肽，其包含至少两个分别特异于cd19和cd3抗原的结合位点。此外提供了多肽，其中上述多肽包含至少一个另外的结构域、优选具有预定功能的结构域。此外，描述了编码所述多肽的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、用其转化的宿主细胞及其在生产所述多肽中的用途。此外，提供了组合物、优选药物和诊断组合物，所述组合物包含任意的上述多肽、多核苷酸或载体。还描述了上述多肽、多核苷酸和载体用于制备免疫疗法的药物组合物、优选针对b细胞恶性肿瘤(例如非霍奇金淋巴瘤)的用途。

4、grosse-hovest等(2003；eur.j.immunol.；33:1334-1340和美国专利号7538196)描述了第一双特异性抗体分子，其包含具有在轻链上的可变结构域(vl)和在重链上的与之连接的t细胞受体cd28的可变结构域(vh)的至少一个结合位点。该抗体分子还包含具有在重链上的可变结构域(vh)和在轻链上的与之连接的肿瘤抗原的可变结构域(vl)的至少一个结合位点。在重链上的两种特异性的可变结构域通过肽接头的方式互相连接。第二双特异性抗体分子对于cd28是双价的且对于肿瘤抗原至少是单价的。

5、尽管存在结合cd3和cd28的双特异性抗体或珠，仍存在开发用于扩增t细胞的替代有效构建体和组合物以及相关方法的需求。

技术实现思路

1、根据一个方面，提供了激动cd3和cd28路径的双特异性scfv构建体。

2、在一个方面，所述构建体是可溶的。

3、在一个方面，所述构建体离体激活、扩增和分化人t细胞。

4、在一个方面，所述构建体在飞摩尔级范围内的浓度下具有活性，所述构建体在例如约10至500fm、例如约170fm的浓度下具有活性。

5、在一个方面，与涉及固定化的抗cd3 mab/可溶性抗cd28 mab或可溶性抗cd3/cd28mab复合物的方法相比，所述构建体在12天的过程中促进人cd8+t细胞的优先生长。

6、在一个方面，所述构建体有利于cd8+cd27+t细胞表型的扩增。

7、在一个方面，抗cd28 scfv在所述构建体的n端，抗cd3 scfv在所述构建体的c端。

8、在一个方面，抗cd3 scfv在所述构建体的n端，抗cd28 scfv在所述构建体的c端。

9、在一个方面，所述构建体包含一个以上柔性接头，例如一个、两个或三个柔性接头。

10、在一个方面，所述构建体包含在每个scfv的每个重链结构域和轻链结构域之间的柔性接头以及在每个scfv之间的柔性接头。

11、在一个方面，所述构建体以1：1的摩尔比参与tcr激活信号和共刺激的信号。

12、在一个方面，所述构建体包含纯化和/或检测标签。

13、在一个方面，所述构建体包含组氨酸标签。

14、在一个方面，所述构建体包含或由与seq id no：1具有至少80％序列同一性的多肽或其片段组成，seq id no：1如下所示：

15、divltqspaslavslgqratiscrasesveyyvtslmqwyqqkpgqppkllifaasnvesgvparfsgsgsgtnfslnihpvdeddvamyfcqqsrkvpytfgggtkleikrggggsggggsggggsqvklqqsgpglvtpsqslsitctvsgfslsdygvhwvrqspgqglewlgviwagggtnynsalmsrksiskdnsksqvflkmnslqaddtavyycardkgysyyysmdywgqgttvtvssastkgpsvfplapssgsggggsggggsggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkhhhhhh。

16、在一个方面，所述构建体包含或由与seq id no：1具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽或其片段组成。

17、在一个方面，所述构建体包含或由具有seq id no：1的多肽组成。

18、根据一个方面，提供了编码本文所述的构建体的多核苷酸。

19、在一个方面，所述多核苷酸包含或由与seq id no：2具有至少80％序列同一性的多核苷酸或其片段组成，seq id no：2如下所示：

20、gacatcgtgctgacacagagccctgcttctctggccgtgtctctgggacagagagccaccatcagctgtagagccagcgagagcgtggaatattacgtgaccagcctgatgcagtggtatcagcagaagcctggccagcctcctaagctgctgatcttcgccgccagcaatgtggaaagcggagtgcctgccagattttccggctctggcagcggcaccaacttcagcctgaacattcaccccgtggacgaggacgacgtggccatgtacttttgccagcagagcagaaaggtgccctacacctttggcggaggcaccaagctggaaatcaagagaggtggcggaggatctggcggcggaggaagcggaggcggcggatctcaagtgaaactgcagcagtctggccctggcctggtcacaccttctcagagcctgagcatcacctgtaccgtgtccggctttagcctgagcgattacggcgtgcactgggtccgacagtctccaggacaaggactggaatggctgggagtgatttgggctggcggagggacaaactacaacagcgccctgatgagccggaagtccatcagcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaactccctgcaggccgacgacaccgccgtgtactattgcgccagagacaagggctacagctactactacagcatggactactggggccagggcaccaccgtgacagttagctctgcctctacaaagggccccagcgtgttccctctggctccttctagttctggaagtggcggtggtggatcaggcggtggcggttctggcggaggcggaagtgatattaagctgcagcagagcggagccgagctggctagacctggtgcctctgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcaccagatacaccatgcattgggtcaagcagcggcctggacagggacttgagtggatcggctacatcaaccccagccggggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccacactgaccaccgacaagagcagcagcacagcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaagatagcgccgtgtattactgtgcccggtactacgacgaccactactgcctggattattggggacagggaacaaccctgaccgtgtctagtgtggaaggtggcagtggcggtagcggtggctctggtggaagcggcggagtggatgatatccagctgactcagtcccctgccatcatgtctgctagccctggcgagaaagtgaccatgacctgcagagccagcagctccgtgtcctacatgaactggtatcaacaaaagagcggcacaagccccaagcggtggatctacgatacaagcaaggtggccagcggcgtgccctatagattttctggaagcggatccggcaccagctactccctgacaatcagcagcatggaagccgaggatgccgccacctactactgccaacagtggtccagcaatcccctgacctttggagccggaacaaagctggaactgaagcaccaccaccatcaccac。

21、根据一个方面，提供了包含本文所述的多核苷酸的载体(vector)。

22、根据一个方面，提供了包含所述载体的宿主细胞。

23、根据一个方面，提供了包含本文所述的构建体和媒介物(carrier)的组合物。

24、在一个方面，所述构建体、多核苷酸、宿主细胞或组合物用于过继性t细胞疗法。

25、在一个方面，所述构建体、多核苷酸、宿主细胞或组合物用于离体扩增t细胞。

26、在一个方面，所述构建体、多核苷酸、宿主细胞或组合物用于治疗和/或预防癌症。

27、根据一个方面，提供了用于离体扩增、激活和/或分化t细胞的方法，所述方法包括用本文所述的构建体孵育t细胞。

28、在一个方面，所述构建体以约10至约500fm、例如约170fm的浓度使用。

29、在一个方面，孵育进行约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天的时间，例如，孵育进行约12天的时间。

30、根据一个方面，提供了由本文所述的方法制备的t细胞。

31、根据一个方面，提供了治疗癌症的方法，所述方法包括将本文所述的t细胞施用给需要其的受试者。

32、在研究了本发明的以下具体实施方式后，本发明的新颖特征对本领域技术人员而言将变得显而易见。然而，应该理解，在指示本发明的某些方面时所呈现的本发明的具体实施方式和具体实施例仅用于解释目的，因为根据本发明的具体实施方式和随后的权利要求书在本发明的精神和范围进行各种变化和修改对本领域技术人员而言将是显而易见的。