优化的通用流感疫苗的设计、其设计和用途的制作方法

本公开内容涉及含有流感ha衍生抗原的组合物，所述抗原与超过一种甲型流感血清型具有高度相似性。在另一个实施方式中，本公开内容涉及用于通用流感疫苗的组合物。

背景技术：

1、季节性流感、大流行性流感和高致病性禽流感(hpai)源自大量鸟类和哺乳动物宿主。新的流感病毒变体可以以不可预测的排列快速重组。由于hpai的微小基因变化可能会大大增加其传染性并允许有效的人与人之间传染，大流行性传播确实可能成为现实。

2、例如，h5n1 hpai于2003年通过鸟与人之间传染在亚洲爆发。它传播到世界各地，埃及是其热点。亚洲最初的h5n1 hpai毒株属于进化枝1，而更新的埃及毒株属于进化枝2(进化枝2.2.1)。首例h7n9 hpai于2013年出现，随后在2016年和2017年出现了更多变种。美国联邦政府一直储备着基于鸡蛋的常规h5n1和h7n9疫苗。它们的免疫原性，尤其是sanofi-pasteur进化枝1h5n1疫苗的免疫原性，显著低于标准季节性流感疫苗的免疫原性。疫苗以初免-加强方案提供，并且进化枝2h5n1 gsk疫苗通过佐剂增强。其他问题是进化枝1和进化枝2h5n1疫苗之间的异源保护水平降低，以及免疫反应的短暂性，其可能会在6个月内失效。

3、已经提出用广泛反应性疫苗——所谓的“通用”流感疫苗来应对流感病毒的不可预测性。最有效的抗流感抗体(ab)与血凝素(ha)头部结合并物理阻断与特定细胞受体的相互作用。此ha结构域的高度可变性提供了特异性，但限制了交叉反应性。更罕见的ab识别高度保守的ha茎区域。它们与几种甲型流感病毒亚型广泛结合。茎抗体可能不是通过抑制细胞受体结合而是通过抑制病毒-膜融合，包括感染细胞的adcc和阻止病毒进入细胞核来发挥作用。然而，目前的双抗原茎疫苗可能仅提供基础免疫力。此类双抗原茎疫苗基于两种不同的“保守”抗原，所述抗原与来自不同血清型流感的ha仅具有相对较低的相似性或“序列重叠”。因此，可能有必要用基于特定流感毒株的疫苗来增强通过双分子通用抗原诱导的免疫反应。一些科学证据还表明，广泛反应性ab可能会有一些问题，诸如诱导疾病增强ab会加重后续流感感染。

4、目前严重缺乏针对季节性和大流行性流感以及hpai(以及其他新出现的传染性威胁)的免疫预防方法，因为以下问题在现有解决方案中尚未得到充分解决：

5、(1)效力：现有流感疫苗(包括储备的hp al疫苗)仅提供适度和短暂的免疫保护。

6、(2)开发速度：目前流感疫苗的开发和生产计划缓慢，并且无法应对快速出现的流感(和其他传染性威胁)的挑战。

7、(3)流感毒株的变异性：流感具有快速改变其抗原组成的能力，并且需要不断开发新疫苗以应对新毒株和解决新的特异性。

8、需要开发更一致的“通用”疫苗，其使用衍生自流感血凝素的保守抗原，与不同血清型流感中发现的蛋白质保持高度相似性或保守性，并诱导有效的免疫反应。

9、经典病毒疫苗是使用缓慢且容量受限的受精卵技术作为减毒、灭活病毒或病毒提取物生产的。最近的组织培养方法包括在流感和zikv(寨卡病毒)疫苗的情况下，在细胞培养肉汤中进行病毒扩增和特定抗原的合成。基于蛋白质的疫苗固有的低免疫原性可以且必须通过添加佐剂来增强。

10、基因免疫方法不是递送完整的疫苗，而是迫使宿主合成抗原并将其呈递至免疫系统。这些系统更接近于模仿自然病毒感染。正在研究不同的策略。裸dna疫苗虽然生产简单且快速，但需要相对较高的剂量和专门的递送系统来克服其低免疫原性。基因疫苗通常利用工程化病毒，诸如ad、牛痘病毒、水疱性口炎病毒、黄热病病毒和α病毒。然而，它们的基础生物学限制了其效用。它们可能具有致病性，例如17d黄热病病毒毒株与严重但罕见的不良反应有关。

11、除了裸dna、aav和rna病毒作为基因转移的基础和疫苗载体平台，可以使用基于腺病毒(ad)的方法。ad衍生载体已被证明是良性的，避免了整合到宿主基因组中，并且本质上是佐剂化的。许多疫苗是在复制缺陷型、最低修饰的早期生成(例如)ad载体的基础上工程化的。在与其他疫苗系统的直接比较中，它们一再证明具有更高的免疫原性。此外，已经证明它们还对禽流感和zikv产生了有效的免疫反应。重要的是，与其他疫苗系统相比，它们可以在较长时间段内提供持续的免疫保护。因此，他们对针对zikv、埃博拉、肺结核和疟疾的疫苗重新产生了兴趣。

12、开发了整合不同策略以克服早期ad系统的局限性的ad载体系统。完全缺失的(fd)ad载体平台将疫苗基因组包装成具有低流行率的人血清型，诸如人血清型ad6。此类疫苗完全缺失(fd)所有内源性ad基因。fdad载体更好地将免疫系统集中于疫苗抗原，最大限度地减少抗ad免疫反应的干扰，并实现初免-加强疫苗接种。使用辅助病毒进行封装的fdad载体系统与辅助病毒和具有复制能力的腺病毒(rca)的污染有关。这些杂质有可能诱导有效的抗ad反应。产生了一种新的fdad构造——独立于辅助病毒(辅助病毒非依赖性，hi)包装fdad的fdad载体。这些是完全缺失的辅助病毒非依赖性ad载体(fdhiad载体)。

13、fdhiad疫苗平台建立在两个可独立修改的组件之上：(i)缺失所有内源性ad基因的fdad载体基因组模块，和(ii)不可包装的环状包装表达质粒，其反式递送必需的ad晚期基因。

14、为了获得缺失了所有内源性ad基因的fdad载体基因组，组装了fdad载体基础模块以适应多至33kb的不同转基因构建体。它们携带不同ad的左itr和右itr以及包装信号(ψ)。

15、完整的fdad载体基因组模块大小约为34kb，并且通过将不可包装的包装表达质粒共转染到宿主细胞中进行封装。包装表达质粒提供组装衣壳、复制fdad载体基因组模块及其整合到衣壳中所必需的所有反式ad基因。不同的环状包装表达质粒已在修饰的pbr322骨架上被工程化用于人ad物种c和b(血清型35)的衣壳。它们提供关键的反式晚期基因(l1、l2、l3、l4、l5)与早期基因e2和e4，并且缺失了包装信号ψ和至少一个itr。

16、fdad技术具有很大的有效载荷，可用于递送大型转基因构建体。例如，可以在单个fdad载体中递送全长人凝血因子viii cdna和免疫抑制基因cd8(组合为12kb)。两种转基因在转导到细胞中后得到有效表达。因此，fdad载体可以用作生产优化的通用流感疫苗的基础，所述疫苗可以递送超过两种保守流感抗原构建体。

17、目前的通用流感疫苗建立在两种保守的流感血凝素构建体之上。最初的通用流感疫苗的设计遵循两种抗体cr6261和cr8020的反应性模式，所述两种抗体与茎区α螺旋结构中的表位结合。针对此区域的抗体中和病毒颗粒。这些抗体似乎通过阻止全长ha经历ph诱导的融合至膜所必需的构象变化来抑制ha功能。cr6261和cr8020中和范围广泛的ha靶标，因为这些区域因其功能而高度保守。显示cr6261中和第1组亚型1、2、5、6、9、13和16中的ha。显示cr8020结合第2组ha的3、4、7、10、14和15。在这两组之后设计两种保守的血凝素抗原导致约为55％的平均序列同一性。尽管无头构建体是一种很有前途的通用流感疫苗方法，但技术问题阻碍了这种方法的更广泛发展。双抗原构建体方法的低同一性分数导致低亲和力免疫反应。此外，增加抗原构建体的数量以克服低序列重叠使得此方法困难且昂贵。无头ha不能形成可以在鸡蛋培养物中繁殖以被灭活为疫苗的活流感病毒。因此，它们必须通过另外的方式生产。

18、fdad载体系统克服了这些生产问题。无头ha不需要在流感病毒或病毒样颗粒中起作用，它们只需要在体内的转导细胞中表达。此外，fdad可以轻松地以它们的大负载递送超过两个ha构建体。fdad疫苗的多价性不会显著增加工程化或生产的复杂性。因此，可以经济高效地生产多价通用流感疫苗。

技术实现思路

1、在一个实施方式中，本公开内容提供了用于疫苗的组合物。根据本公开内容的实施方式，用于疫苗的组合物包含至少两种不同的流感血凝素(ha)衍生抗原，其中衍生所述抗原的ha蛋白包含高变区，并且所述高变区从所述至少两种不同的流感ha衍生抗原中缺失，并且其中所述至少两种不同的流感ha衍生抗原中的每一种与超过一种流感血清型的ha分子具有超过至少60的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的。

2、在一个实施方式中，相似性为至少70，或至少80。

3、在一个实施方式中，所述高变区被所述至少两种不同的流感ha衍生抗原中的肽接头替代。

4、在一个实施方式中，所述至少两种不同的流感ha衍生抗原是蛋白质。在另一个实施方式中，所述至少两种不同的流感ha衍生抗原是编码衍生所述抗原的所述ha蛋白的rna和dna中的一种。在又一个实施方式中，所述rna和dna中的一种在病毒载体中。

5、在一个实施方式中，使用血清型h3的流感ha的氨基酸编号定位所述高变区在位置52和277处的保守半胱氨酸之间。

6、在另一个实施方式中，所述组合物包含超过两种不同的流感ha衍生抗原。

7、在一个实施方式中，本公开内容提供了一种用于生产通用流感病毒疫苗的方法。根据本公开内容的实施方式，一种用于生产通用流感病毒疫苗的方法包括获得第一流感ha衍生抗原，其与第一多种流感血清型的ha分子具有超过至少60的相似性，如通过embossexplorer cons程序计算的；以及获得第二流感ha衍生抗原，其与第二多种流感血清型的ha分子具有超过至少60的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的，其中所述第一多种流感血清型和所述第二多种流感血清型由不同的血清型组成。

8、在一个实施方式中，所述第一多种流感血清型和所述第二多种流感血清型由不同且不重叠的血清型组成。

9、在一个实施方式中，衍生所述第一流感ha衍生抗原和所述第二流感ha衍生抗原的所述ha蛋白含有高变区，并且所述高变区从所述第一流感ha衍生抗原和所述第二流感ha衍生抗原中缺失。

10、在一个实施方式中，相似性独立地为至少70，或至少80。

11、在一个实施方式中，所述高变区被肽接头替代。

12、在一个实施方式中，所述第一流感ha衍生抗原和所述第二流感ha衍生抗原是蛋白质。在另一个实施方式中，所述第一流感ha衍生抗原和所述第二流感ha衍生抗原是编码衍生所述抗原的所述ha蛋白的rna和dna中的一种。在又一个实施方式中，所述方法包括将编码所述ha蛋白的所述rna和dna中的一种封装到病毒载体中。

13、在一个实施方式中，所述方法包括获得至少第三流感ha衍生抗原，其与第三多种流感血清型的ha分子具有超过至少60的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的。

14、在一个实施方式中，本公开内容提供了一种针对至少两种不同的流感血清型对动物进行疫苗接种的方法。根据本公开内容的实施方式，所述方法包括提供疫苗组合物，其包含至少两种不同的流感血凝素(ha)衍生抗原，其中衍生所述抗原的ha蛋白包含高变区，并且所述高变区从所述至少两种不同的流感ha衍生抗原中缺失，并且其中所述至少两种不同的流感ha衍生抗原中的每一种与超过一种流感血清型的ha分子具有超过至少60的相似性，如通过emboss explorer cons程序计算的；以及将所述疫苗组合物递送至动物。

15、序列表说明

16、seq id no.1：示出了如图1所示的红色流感血清型的共有序列。

17、seq id no.2：示出了如图1所示的橙色流感血清型的共有序列。

18、seq id no.3：示出了如图1所示的黄色流感血清型的共有序列。

19、seq id no.4：示出了如图1所示的绿色流感血清型的共有序列。

20、seq id no.5：示出了如图1所示的蓝色流感血清型的共有序列。

21、seq id no.6：示出了如图1所示的紫色流感血清型的共有序列。