癌症的治疗的制作方法

本发明提供了能够与缀合至化疗剂的nectin-4多肽结合的抗原结合蛋白，其用于增加肿瘤对所述化疗剂的敏感性，用于治疗以nectin-4表达性肿瘤细胞为特征的癌症。

背景技术：

1、在美国，2016年估计有超过70,000例膀胱癌新诊断，约16,000人死亡。尿路上皮癌涵盖膀胱癌、输尿管癌和肾盂癌，其发生率分别为50:3:1。尿路上皮癌是一个多灶性过程。患有上尿路癌的患者有30％到50％的机会在其生命中的某个阶段患上膀胱癌。当膀胱中的细胞开始异常或不受控制地生长时，就会发生膀胱癌。最常见的膀胱癌类型被称为尿路上皮癌(uc)。在uc中，膀胱内壁(尿路上皮)发生异常生长。随着疾病的进展，它可能会传播。它可以扩散到膀胱周围的区域或身体的其它部位(转移)。这被称为晚期尿路上皮癌。

2、尿路上皮癌(uc)的特征在于一系列不同细胞表面抗原的表达增加，因此为使用抗体-药物缀合物(adc)进行特异性治疗靶向提供了机会。在表面抗原中，有几种抗原已被证明适合adc的开发，包含trop-2(人类滋养层细胞表面抗原)、slitrk家族蛋白(例如slitrk6)、epcam、her2、tf-ag(thomsen-friedrich抗原)、fgf1v、fn14(fgf-诱导型14)、psma(前列腺特异性膜抗原)和nectin-4(脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白4，也被称为pvrl4。

3、nectin-4最初由lopez小组于2001年从人气管中克隆出来(参见reymond等人(2001)《生物化学杂志(j.biol.chem.)》276(46):43205-15)。据报道，nectin-4基因的拷贝数增加是癌变过程中的常见事件，并且其可以促进上皮-间质转化、侵袭和转移。虽然nectin-4蛋白在健康组织中的表达受限，但在几种肿瘤中的表达水平显著升高，并且在乳腺癌中尤其过度表达，该乳腺癌包括三阴性乳腺癌(tnbc)(参见m-rabet等人《肿瘤学年鉴(ann oncol.)》2017年4月1日；28(4):769-776)、胰腺癌和uc。然而，nectin-4也在非小细胞肺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌和食道癌肿瘤样本中表达。challita-eid等人(2016)《癌症研究(cancer res.)》76(10):3003-3013报道了在膀胱(60％)和乳腺(53％)肿瘤组织中通过免疫组织化学(h评分≥100)进行的中等至强染色。zeindler等人2019《医学前沿(front.med.)》6:200报道了在148例tnbc病例中有86例(58％)存在nectin-4的高表达。

4、challita-eid等人(2016),同上，开发了一种抗nectin-4抗体，该抗体与基于抗体ags-22的高效微管破坏剂mmae缀合。这项工作催生了adc候选药物维汀-恩弗妥单抗(enfortumab vedotin)(参见美国专利第8,637,642号和pct公布第wo2012/047724号，agensys公司(agensys inc.))，该药物在治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌患者的人体临床试验中取得了可喜的结果，这些患者以前曾在新辅助/辅助、局部晚期或转移性环境中接受过含铂化疗和pd-1/pd-l1检查点抑制剂。其它几个小组也提出了与多种毒性药剂结合的抗nectin-4药剂。pct专利申请wo2018/158398(inserm)报道了几种抗nectin-4抗体，并提出了与一系列细胞毒性药剂的潜在偶联。类似地，美国专利第8,637,642号(agensys公司)也提供了抗nectin-4抗体，并提出了与一系列细胞毒性药剂的潜在偶联。此外，bicycletherapeutics公司报道了一种抗nectin-4靶向剂的开发，该靶向剂包含nectin-4结合蛋白，该蛋白通过可切割接头缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)与细胞毒性澳瑞他汀(mmae)有效载荷缀合。迄今为止，已报道在缀合至化疗剂时具有活性的所有抗nectin-4抗体靶向nectin-4的ig样v型结构域，因此认为ig样v型结构域提供抗nectin-4 adc的最强内化。

5、维汀-恩弗妥单抗(抗nectin-4 adc)结合nectin-4的ig样v型结构域，该ig样v型结构域与高度内化抗nectin-4抗体相关。维汀-恩弗妥单抗在ev-201 2期研究(2019)中显示出令人印象深刻的治疗应答，其中uc的orr(客观应答率)为44％，cr(完全应答率)为12％，大约一半的患者停止治疗。如通过recist(48％)或临床症状(5％)所评估的，大部分停药是由于疾病进展。此外，18％的停药患者出现了不良事件，尤其是神经病变。因此，靶向nectin-4的adc具有局限性，并且本领域需要针对患有uc和其它癌症的患者的改善益处。

6、在uc中，当癌症尚未扩散到身体的远处部位或癌症已经扩散时，通常首先用基于顺铂的方案(有或没有放射)治疗个体。喜树碱化合物通常不用于治疗uc。de jonge等人,2004《试验性新药(invest new drugs)》22:329-333研究了喜树碱类似物rfs2000在晚期或转移性尿路上皮肿瘤患者中的作用。de jonge等人2004得出的结论是，该喜树碱类似物对先前化疗失败的晚期/转移性尿路上皮肿瘤患者没有显著活性，并且此研究的结果不建议进一步研究rfs2000。在过去的几十年中，已经制造了大量的喜树碱类似物，其中包括依喜替康(exatecan)。abou-alfa等人,2006《临床肿瘤学杂志(journal of clinicaloncology)》24(27):4441-4447在一项349名患者的3期临床试验中评估了依喜替康治疗胰腺癌的效果，发现除了吉西他滨(gemcitabine)外，依喜替康的功效并不优于单独使用吉西他滨。

技术实现思路

1、已经开发了许多高功效的细胞毒性剂(诸如吡咯并苯二氮卓和澳瑞他汀)用于与抗体缀合，然而在用于治疗的剂量下，掺入这些剂的adc由于该剂的毒性仍然引起严重的副作用。其它细胞毒性剂(诸如喜树碱)毒性较低，但其本身也具有有限的抗肿瘤活性。细胞毒性剂的抗肿瘤活性可以通过与抗nectin-4抗体缀合而增强，然而如本文所证明的，当与金标准抗nectin-4抗体(诸如恩弗妥单抗(asg-22))缀合时，基于喜树碱类似物的adc在体内测试时仍具有局限性。发明人在本文中提供了用于改善细胞毒性剂向nectin-4阳性肿瘤的递送的方法。特别地，本技术显示，通过将细胞毒性剂缀合至抗体，该抗体结合nectin-4的桥接ig样v和ig样c2 1型结构域的结构域或区域，可以获得强抗肿瘤作用。桥接ig样v和ig样c21型结构域的结构域与细胞间相互作用相关，在本文中也称为vc1桥接结构域、vc1决定簇或vc1表位。使用展现出与nectin-4突变体的结合降低的adc靶向此结构域导致抗肿瘤活性的效力是具有高细胞内内化潜力的金标准抗ig样v型结构域adc的3倍，这些nectin-4突变体与野生型或非突变nectin-4相比具有vc1桥接结构域氨基酸取代(残基k197和/或s199处，如包含k197t/s199a双重取代的突变体举例说明)。有可能细胞间相互作用是通过第一细胞上的nectin-4与第二细胞上的nectin-1和/或nectin-4的相互作用(nectin-4:nectin-1或nectin-4:nectin-4相互作用)来介导。

2、此外，本技术显示，通过用细胞内可切割的接头使结合vc桥接结构域的抗体官能化，可以在以具有高pgp表达的肿瘤为特征的癌症中获得特别强的抗肿瘤作用，该细胞内可切割的接头在接头切割时释放出依喜替康。抗nectin-4-依喜替康adc允许在mdr-高肿瘤模型中的有效抗肿瘤作用，该mdr-高肿瘤模型对替代释放喜树碱类似物dxd的相同抗体有抗性。

3、在一些方面，提供了一种抗体(例如，全长抗体、抗体片段)，该抗体特异性结合人nectin-4多肽并且能够使肿瘤对细胞毒性剂(或例如包含此类抗体的蛋白质)敏化，用于治疗癌症和/或抑制抗癌药物抗性的方法中。任选地，结合人nectin-4多肽的抗体与细胞毒性剂(例如，化疗剂)组合使用(施用)。

4、本公开的一个目的是提供一种抗癌组合物，该抗癌组合物包含癌症敏化组合物和抗癌剂(例如，细胞毒性剂、化疗剂)，其中癌症敏化组合物包含结合nectin-4多肽的vc1桥接结构域的抗体(例如，全长抗体、抗体片段)。

5、在一些方面，提供了一种抗体(例如全长抗体、抗体片段)，该抗体结合人nectin-4多肽并且能够使肿瘤对细胞毒性剂敏化，用于制备抗体药物缀合物。

6、在一些方面，提供了通过将细胞毒性剂与结合nectin-4的vc1桥接结构域的抗体(例如全长抗体、抗体片段)缀合，来将细胞毒性剂(例如，喜树碱、依喜替康)递送至肿瘤(例如，实体瘤内的肿瘤细胞)的改进方法。

7、在本文涉及免疫缀合物或adc的任何实施方案中，细胞毒性剂可通过接头与抗体缀合或结合，该接头包含细胞内可切割的部分(例如，寡肽、二肽、三肽或四肽)和任选地自消除间隔子。在任何实施方案中，细胞毒性剂通过接头与抗体缀合或结合，该接头包含细胞内可切割的部分和任选地自消除间隔子，导致例如在肿瘤或肿瘤细胞中，切割可切割部分时释放细胞毒性剂(例如，喜树碱类似物、依喜替康、具有化合物1、2或13的结构的化合物)。

8、细胞毒性剂的改善的递送和/或对化疗剂或细胞毒性剂的敏化可能是nectin-4表达性肿瘤细胞的簇形成和/或非锚定依赖性生长的抗体介导的抑制的结果，导致adc的改善的肿瘤穿透。

9、根据本发明的一个方面，提供了一种任选地用于治疗癌症的敏化剂-细胞毒性药物缀合物，其中该敏化剂-细胞毒性药物缀合物包含：(a)结合人nectin-4的vc1桥接结构域的至少一个抗原结合结构域，任选地其中该抗原结合结构域包含(i)重链可变区，该重链可变区包含与具有抗体5e7、10b12、6c11b或6a7的kabat重链cdr1、2和3和人框架区(例如，来自本文公开的人v基因(ighv)组)的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列，和/或(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含与具有抗体5e7、10b12、6c11b或6a7的kabat轻链cdr1、2和3和人框架区(例如，来自本文公开的人v基因(igkv)组)的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列，和(b)至少一个细胞毒性药物部分。多肽(i)和(ii)可指定为彼此缔合(例如，通过共价键和/或非共价键)以形成结合nectin-4的抗原结合结构域。

10、在一个方面，掺入本公开的抗体的adc提供增强的效力，并且因此对于治疗患有特别抗性疾病的患者的具有较低nectin-4表达(例如，低于高表达)或异质nectin-4表达(例如，尿路上皮癌)的疾病特别有利。在一些实施方案中，这允许治疗不依赖于或不需要在治疗之前评估或检测肿瘤中的nectin-4表达水平。

11、在一个方面，掺入本公开的抗体的adc提供adc的增强的肿瘤穿透，这可以改善抗肿瘤活性、减少所需的adc的量和/或减少与细胞毒性剂相关的毒性。与金标准内化抗nectin-4抗体(例如，ig v型结构域抗体)相比的这种改善的治疗窗口的结果是，本公开的adc对于治疗患有对其它治疗有抗性的疾病的患者是有利的，常规adc不适用于这些患者(例如，由于毒性)，并且/或者对于与额外的治疗剂组合使用是有利的，这些额外的治疗剂作为介导其自身毒性的单一剂(例如，单独的化疗剂或掺入到adc中)。

12、在一些方面，提供了一种特异性结合nectin-4的抗体(例如，全长抗体、抗体片段)，其中该抗体结合人nectin-4的vc1桥接结构域。

13、在一些方面，提供了一种特异性结合nectin-4的抗体(例如，全长抗体、抗体片段)，其中相比于与野生型人nectin-4多肽的结合，该抗体展现出与包含残基k197和/或s199(参考seq id no:1)处的氨基酸取代的突变体人nectin-4多肽的结合降低。

14、在一些方面，提供了一种抗体(例如，全长抗体、抗体片段)，该抗体包含抗体5e7、10b12、6c11b或6a7的重链和轻链cdr。

15、在任何方面，本公开的抗体用于制备抗体药物缀合物。在任何方面，本公开的抗体用于减少nectin-4表达性肿瘤细胞之间的细胞间粘附、抑制nectin-4:nectin-1相互作用、抑制nectin-4:nectin-4相互作用、减少nectin-4表达性肿瘤细胞的生长和/或减少nectin-4表达性肿瘤细胞的簇形成(例如，用于上述的方法中)。

16、在一些方面，提供了一种抗体(例如，全长抗体、抗体片段)，该抗体结合人nectin-4多肽并且能够减少nectin-4表达性肿瘤细胞之间的细胞间粘附和/或减少nectin-4表达性肿瘤细胞的生长和/或簇形成(例如，如使用三维或非粘附性肿瘤细胞培养物所评估的；肿瘤球状体测定)，用于制备抗体药物缀合物。

17、在一些方面，提供了一种抗体(例如，全长抗体、抗体片段)，该抗体能够抑制nectin-4:nectin-1相互作用和/或nectin-4:nectin-4相互作用(例如，抗体能够减少第一细胞上的nectin-4与第二细胞上的nectin-1和/或nectin-4的相互作用，任选地其中细胞是肿瘤细胞)。

18、在一些方面，抗体药物缀合物的制备包括将抗体与细胞毒性剂缀合的步骤(例如，通过接头部分，接头部分进一步包含细胞内可切割的部分)。

19、在一些方面，提供了制备抗体药物缀合物的方法，这些方法包括将根据本公开的抗nectin-4抗体与细胞毒性剂缀合。

20、还提供了一种抗体药物缀合物，该抗体药物缀合物包含与细胞毒性剂缀合的抗nectin-4抗体。

21、还提供了治疗癌症的方法，这些方法包括施用包含与细胞毒性剂缀合的抗nectin-4抗体的抗体药物缀合物。

22、本公开的抗nectin-4抗体提供的增加的抗肿瘤效力和更大的治疗窗口(例如，特别是与喜树碱衍生物缀合时)提供了在患有肿瘤的个体中改善治疗结果的可能性，这些肿瘤对包含抗her2剂(例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)，包含曲妥珠单抗的adc)的组合物的治疗具有抗性、无应答或在该治疗后已进展。改善的治疗窗口提供了与其它剂(特别是化疗剂和/或抗her2剂)组合治疗的可能性。

23、在一些方面，提供了一种与细胞毒性剂(任选地化疗剂)缀合的nectin-4结合剂，以及其在治疗nectin-4表达性癌症中的用途，该癌症例如uc、乳腺癌(例如，tnbc)、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌或食道癌，其中结合剂是结合人nectin-4多肽并且能够使肿瘤或肿瘤细胞(特别是转移性癌症)对细胞毒性剂敏化的抗体。

24、在一些方面，提供了一种与细胞毒性剂(任选地化疗剂)缀合的nectin-4结合剂，以及其在治疗nectin-4表达性癌症中的用途，这些癌症例如uc、乳腺癌(例如，tnbc)、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌或食道癌，其中结合剂是结合人nectin-4的vc1桥接结构域的抗体；例如与桥接ig样c2 1型结构域和ig样v型结构域的一段氨基酸结合、与至少部分位于桥接ig样c2 1型结构域和ig样v型结构域的氨基酸内的表位结合。

25、与nectin-4的vc1桥接结构域结合的特征可任选地表征为结合(例如，至少部分地)(a)人nectin-4多肽ig样v型结构域和(b)人nectin-4多肽ig样c2 1型结构域的能力。在另一个方面，与nectin-4的vc1桥接结构域结合的特征可任选地表征为保留与其中ig样v型结构域已经缺失的nectin-4多肽(例如，nectin-4多肽，该多肽包含ig样c2 1型结构域和ig样c2 2型结构域，但缺乏ig样v型结构域；seq id no:32的多肽)的部分结合，任选地其中相比于与野生型nectin-4蛋白的结合，该抗体以降低的水平保留与缺失ig样v型结构域的nectin-4蛋白的结合；任选地进一步，其中该抗nectin-4抗体不结合缺乏ig样v型和ig样c21型结构域的nectin-4多肽，例如具有seq id no:33的氨基酸序列的多肽。在另一个方面，与nectin-4的vc1桥接结构域结合的特征可任选地表征为展现出与包含残基a72、g73、s195、k197、s199、l150、s152、q234和i236(参考seq id no:1)处的一个或多个氨基酸取代的突变体nectin-4多肽的结合降低，任选地相比于与野生型人nectin-4多肽的结合，与包含残基k197、s199和/或q234处的一个或多个氨基酸取代的突变体nectin-4多肽的结合降低，任选地相比于与野生型人nectin-4多肽的结合，与包含残基k197和/或s199处的一个或多个氨基酸取代的突变体nectin-4多肽的结合降低。任选地，使用制备成表达nectin-4多肽的细胞通过流式细胞术来评估结合，并且确定荧光强度水平(例如，mfi)。

26、在一个实施方案中，提供了一种作为抗体5e7、10b12、6c11b或6a7的功能保守变体的nectin-4结合抗体或抗体片段。在一个实施方案中，nectin-4结合抗体包含：(i)vh结构域，该结构域包含与选自包含seq id no:6、24、42或50的组的序列所定义的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列(任选地其中每个重链框架区被人重链框架区取代)，和/或(ii)vl结构域，该结构域包含与选自包含seq id no:7、25、43或51的组的序列所定义的氨基酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列(任选地其中每个轻链框架区被人轻链框架区取代)。

27、在一个实施方案中，提供了一种nectin-4结合抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：(i)重链可变区，该重链可变区包含seq id no:8、9和10的氨基酸序列(kabat h-cdr 1、2和3)，和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含seq id no:11、12和13的氨基酸序列(kabat l-cdr 1、2和3)。

28、在一个实施方案中，提供了一种nectin-4结合抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：(i)重链可变区，该重链可变区包含seq id no:14、15和16的氨基酸序列(h-cdr 1、2和3)，和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含seq id no:17、18和13的氨基酸序列(l-cdr1、2和3)。

29、在一个实施方案中，提供了一种nectin-4结合抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：(i)重链可变区，该重链可变区包含seq id no:19、20和21的氨基酸序列(h-cdr 1、2和3)，和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含seq id no:22、18和23的氨基酸序列(l-cdr1、2和3)。

30、在一个实施方案中，提供了一种nectin-4结合抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：(i)重链可变区，该重链可变区包含seq id no:44、45和46的氨基酸序列(h-cdr 1、2和3)，和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含seq id no:47、48和49的氨基酸序列(l-cdr1、2和3)。

31、在一个实施方案中，提供了一种nectin-4结合抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：(i)重链可变区，该重链可变区包含seq id no:52、53和54的氨基酸序列(h-cdr 1、2和3)，和(ii)轻链可变区，该轻链可变区包含seq id no:55、56和57的氨基酸序列(l-cdr1、2和3)。

32、在本文的任何实施方案中，抗nectin-4抗体或抗体片段或包含此类抗体或片段的抗体-药物缀合物能够在与肿瘤细胞表面上的nectin-4结合时经历细胞内内化。

33、在本文的任何实施方案中，抗nectin-4抗体与细胞毒性剂缀合。在本文的任何实施方案中，与细胞毒性剂缀合的抗nectin-4抗体与另外的细胞毒性剂(例如，化疗剂、由p-糖蛋白(pgp，人mdr1基因的产物)转运的化疗剂、铂剂、紫杉烷)组合使用，其中另外的细胞毒性剂与缀合至细胞毒性剂的抗nectin-4抗体分开施用。

34、在一个方面，提供了一种在有需要的个体中治疗癌症和/或杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括向所述个体施用治疗有效量的本公开的特异性结合人nectin-4多肽的抗体，任选地其中该抗体通过接头与细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)缀合。

35、在一个方面，本发明提供了治疗方法，这些治疗方法可用于患有nectin-4表达性癌症的个体，而不管肿瘤细胞上的nectin-4表达水平如何。

36、在一个方面，本公开提供了治疗方法，这些治疗方法可有利地用于其肿瘤细胞表达p-糖蛋白(pgp)的个体。

37、在一个方面，本公开提供了治疗方法，这些治疗方法可有利地用于已经接受过用化疗剂(例如，由p-糖蛋白(pgp)转运的化疗剂、铂类药剂(例如，奥沙利铂、顺铂、卡波铂、奈达铂、菲铂、吡铂、沙铂)、紫杉烷(例如，紫杉醇(taxoltm)和多西他赛(taxoteretm))进行的先前治疗的个体。

38、在一方面，本发明提供了治疗方法，这些治疗方法可有利地用于其肿瘤或癌症具有抗性，即对用包含抗her2抗体的组合物(例如曲妥珠单抗，一种包含重和轻可变区、cdr或多肽链曲妥珠单抗的adc)进行的治疗无应答或在该治疗后已进展的个体。

39、在一个方面，本发明提供了治疗方法，这些治疗方法可用于以较低或低于常规抗nectin-4 adc所用剂量的剂量介导个体中的抗肿瘤作用，例如，小于3mg/kg体重、小于1.25mg/kg体重、小于1mg/kg体重、小于125mg固定剂量。

40、在一个方面，本发明提供了治疗方法，这些治疗方法可用于患有现有神经病、糖尿病或高血糖、心功能不全、眼部病变的个体。

41、在一个方面，本发明提供了治疗方法，这些治疗方法可用于患有nectin-4表达性癌症的个体，该癌症的特征在于nectin-4多肽的低或中等水平的肿瘤细胞表达(例如，nectin-4多肽在肿瘤细胞膜处的表达)。

42、在一个方面，抗nectin-4抗体或抗体片段通过细胞内可切割的(例如，蛋白酶可切割的)寡肽(例如，二肽、三肽、四肽或五肽)与细胞毒性剂缀合。在一个方面，抗nectin-4抗体或抗体片段通过细胞内可切割的(例如，蛋白酶可切割的)二肽、三肽、四肽或五肽和自消除间隔子与细胞毒性剂(例如，喜树碱衍生物)缀合。在一个方面，抗nectin-4抗体或抗体片段通过细胞内可切割的(例如，蛋白酶可切割的)四肽或五肽和自消除或非自消除间隔子与细胞毒性剂(例如，喜树碱衍生物)缀合。

43、在一个方面，细胞毒性剂是高度有效的化疗剂，任选地是选自由以下组成的组的细胞毒性剂：紫杉烷类、蒽环类(anthracyclines)、喜树碱类、埃博霉素类(epothilones)、丝裂霉素类(mytomycins)、康普瑞汀类(combretastatins)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)、氮芥类(nitrogen mustards)、美登木素类(maytansinoids)、倍癌霉素类(duocarmycins)、微管溶素类(tubulysins)、尾海兔素类(dolastatins)和澳瑞他汀类、烯二炔类(例如，卡奇霉素类(calicheamicins)、埃斯波霉素类(esperamicins)、shishijimicins和namenamicins)、吡咯并苯二氮卓类(例如，吡咯并苯二氮卓二聚体和吲哚并-吡咯并苯二氮卓二聚体)、鹅膏毒素类(amatoxins)和乙烯亚胺类。在一个实施方案中，细胞毒性剂是dna损伤剂，包括例如dna嵌入剂，例如将其自身插入到细胞的dna结构中并结合dna从而引起dna损伤的剂(例如柔红霉素(daunorubicin))。化合物包括拓扑异构酶抑制剂，即阻断拓扑异构酶(拓扑异构酶i和ii)作用的化学化合物。此类化合物用于广泛的实体瘤和血液恶性肿瘤，特别是淋巴瘤。拓扑异构酶i抑制剂包括喜树碱类，例如伊立替康(irinotecan)(被批准用于治疗结肠癌)、拓扑替康(topotecan)(被批准用于治疗卵巢癌和肺癌)、喜树碱、片螺素d(lamellarin d)、茚并异喹啉(indenoisoquinoline)、茚替康(indimitecan)。另外的喜树碱类包括斯拉替康(silatecan)、柯西替康(cositecan)、依喜替康、勒托替康(lurtotecan)、吉马替康(gimatecan)、贝洛替卡(belotecan)和鲁比替康(rubitecan)。拓扑异构酶ii抑制剂包括例如依托泊苷(etoposide)(vp-16)、替尼泊苷(teniposide)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素、米托蒽醌(mitoxantrone)、安吖啶(amsacrine)、玫瑰树碱(ellipticines)、金精三羧酸(aurintricarboxylic acid)和hu-331(由大麻二酚(cannabidiol)合成的喹诺酮(quinolone))。

44、任选地，将所述抗体用式i到xi中任一个的接头-毒素官能化。

45、在一个方面，细胞毒性剂是喜树碱类似物，例如依喜替康、dxd或sn-38分子。

46、在一个方面，本发明提供了本公开的nectin-4结合抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段与喜树碱(例如喜树碱类似物、依喜替康或依喜替康衍生物、dxd分子或sn-38分子)缀合(例如共价结合)。

47、在本文的任何实施方案中，与喜树碱类似物，例如依喜替康或sn-38分子缀合(例如共价结合)的本公开的nectin-4结合抗体或抗体片段可以被表征为包含具有一个或多个氨基酸残基(例如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺残基、非天然氨基酸残基)的与人nectin-4多肽特异性结合的抗体，该一个或多个氨基酸残基通过接头用包含化合物1或2的结构的分子官能化，或用式i或ii的接头-喜树碱分子官能化。在本文的任何实施方案中，nectin-4抗体或抗体片段可以被表征为用具有式iii、iv、v、vi、vii、vii、ix、x或xi结构的接头-喜树碱分子官能化，或用化合物3到12中任一个官能化。

48、在一个实施方案中，与喜树碱衍生物缀合的nectin-4抗体或抗体片段是与依喜替康分子，例如具有化合物1(1a或1b)的结构的分子缀合的nectin-4抗体或抗体片段。在任何实施方案中，可切割接头或包含接头的免疫缀合物或adc可以表征为例如在接头的酶促切割时，释放依喜替康分子，例如具有化合物1(1a或1b)的结构的分子。在一个实施方案中，与喜树碱衍生物缀合的nectin-4抗体或抗体片段是与sn-38分子，例如具有化合物2的结构的分子缀合的nectin-4抗体或抗体片段。在一个实施方案中，nectin-4抗体或抗体片段可以被表征为包含具有一个或多个氨基酸残基(例如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺或非天然氨基酸残基)的与人nectin-4多肽特异性结合的抗体，该一个或多个氨基酸残基通过接头(例如，具有或不具有另外的间隔子，例如本文所述的间隔子(y')的可切割接头分子)用具有以下结构的分子官能化：

49、

50、或

51、

52、或

53、

54、在一个实施方案中，与细胞毒性剂缀合的nectin-4抗体或抗体片段可以被指定为由式(i)表示的免疫缀合物：

55、ab–x–z式(i)

56、其中，

57、ab是特异性结合人nectin-4多肽的抗体或抗体片段(例如，结合人nectin-4的vc1桥接结构域的抗体或抗体片段；和/或相比于与野生型人nectin-4多肽的结合，展现出与包含残基k197和/或s199(参考seq id no:1)处的氨基酸取代的突变体人nectin-4多肽的结合降低的抗体或抗体片段)；

58、x是连接ab和z的接头分子(例如，与ab和z中的每一个共价结合)，其中x包含例如在生理条件下，任选地在细胞内条件下可切割的部分，任选地蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽，任选地其中x进一步包含定位在可切割部分和z之间的自消除或非自消除间隔子系统(y')，任选地其中x进一步包含定位在ab和可切割部分之间的间隔子(y)；并且

59、z是细胞毒性剂，任选地其中z是喜树碱类似物，任选地其中z是依喜替康，任选地其中z是依喜替康并且接头的切割导致释放具有化合物1的结构的化合物(依喜替康)。

60、在一个实施方案中，与细胞毒性剂缀合的nectin-4抗体或抗体片段可以被指定为由式(i)表示的免疫缀合物：

61、ab–x–z式(i)

62、其中，

63、ab是根据本公开的特异性结合人nectin-4多肽的抗体或抗体片段；

64、x是连接ab和z的接头分子(例如，与ab和z中的每一个共价结合)，其中x包含缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸二肽，其中x进一步包含定位在可切割部分和z之间的自消除或非自消除间隔子系统(y')，并且其中x进一步包含定位在ab和可切割部分之间的间隔子(y)；并且

65、z是细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地是依喜替康分子或sn-38分子。

66、在一个实施方案中，提供了一种将细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)递送或靶向至肿瘤的方法、一种在肿瘤中(例如在患有癌症的受试者中)释放细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物、dxd、依喜替康)的方法、或一种使肿瘤或癌症对细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)敏化的方法，该方法包括向患有癌症的受试者施用由式(i)表示的免疫缀合物：

67、ab–x–z式(i)

68、其中，

69、ab是特异性结合人nectin-4多肽的抗体或抗体片段；

70、x是连接ab和z的接头分子(例如，与ab和z中的每一个共价结合)，其中x包含例如在生理条件下，任选地在细胞内条件下可切割的部分，任选地蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽，任选地其中x进一步包含定位在可切割部分和z之间的自消除或非自消除间隔子系统(y')，任选地其中x进一步包含定位在ab和可切割部分之间的间隔子(y)；并且

71、z是细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地是依喜替康分子或sn-38分子，任选地其中z是依喜替康并且其中接头的切割导致释放具有化合物1的结构的化合物(依喜替康)。

72、在一个实施方案中，与细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)缀合的抗体或抗体片段可以被指定为由式(ii)表示的免疫缀合物：

73、ab–(x–(z)n)m式(ii)

74、其中，

75、ab是根据本公开的特异性结合人nectin-4多肽的抗体或抗体片段；

76、x是连接ab和z的接头分子，其中x包括例如在生理条件下，任选地在细胞内条件下可切割的部分，任选地蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽，任选地其中x进一步包括定位在所述可切割部分和z之间的自消除或非自消除间隔子系统(y')，任选地其中x进一步包括定位在ab和所述可切割部分之间的间隔子(y)；

77、z是细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地z是包含依喜替康分子或sn-38分子的分子，例如具有化合物1或2的结构的分子；

78、n为1；并且

79、m为4到8，或任选地m为选自4、5、6、7或8的整数。

80、在一个实施方案中，与细胞毒性剂(任选地喜树碱类似物)缀合的nectin-4抗体或抗体片段可以表征为由式(ii)表示的免疫缀合物的组合物：

81、ab–(x–(z)n)m式(ii)

82、其中，

83、ab是根据本公开的特异性结合人nectin-4多肽的抗体或抗体片段；

84、x是连接ab和z的分子，其中x包括例如在生理条件下，任选地在细胞内条件下可切割的部分，任选地蛋白酶可切割的二肽、三肽、四肽或五肽，任选地其中x进一步包括定位在所述可切割部分和z之间的自消除或非自消除间隔子系统(y')，任选地其中x进一步包括定位在ab和所述可切割部分之间的间隔子(y)；

85、z是细胞毒性剂，任选地是喜树碱类似物，任选地z是包含依喜替康分子或sn-38分子的分子；

86、其中n为1，并且该组合物中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的免疫缀合物具有介于2和4之间、介于4和8之间，任选地介于6和8之间的m(x-z部分的数量)。任选地该组合物中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的免疫缀合物的m为，或至少为4、6、7或8。

87、在式i或ii中，(x-z)部分可以任选地被表征为具有式iii到xi中任一个或化合物3-12中任一个的结构。

88、在式i或ii中，分子x或间隔子y可以任选地被指定为包含反应性基团(r)或反应性基团(r)与抗原结合蛋白(例如，抗体)的氨基酸或与附接至抗体或抗体片段的氨基酸的互补反应性基团(r')的反应的残基。

89、在本文的任何实施方案中，依喜替康分子可以被指定为通过依喜替康的位置1处的胺与接头(x)结合(当依喜替康分子是接头的一部分时，nh替换位置1处的nh2)。在一个实施方案中，依喜替康与接头(x)结合，例如与x的对氨基苄氧羰基(pab)自消除间隔子部分的羰基结合。在本文的任何实施方案中，sn-38分子可以被指定为通过位置9处的oh与接头(x)结合(当化合物2中所示的sn-38分子是接头的一部分时，o替换位置9处的oh)。

90、在一个实施方案中，与依喜替康缀合的nectin-4结合剂可以被表征为包含具有一个或多个氨基酸残基(例如半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基)的与人nectin-4多肽特异性结合的抗体，该一个或多个氨基酸残基通过间隔子(y)用包含以下结构的接头-依喜替康分子官能化：

91、

92、在一个实施方案中，与依喜替康缀合的nectin-4抗体或抗体片段可以被表征为包含具有一个或多个氨基酸残基(例如半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基)的与人nectin-4多肽特异性结合的抗体，该一个或多个氨基酸残基通过间隔子(y)用包含以下结构的接头-依喜替康官能化：

93、

94、在一个实施方案中，与依喜替康缀合的nectin-4抗体或抗体片段可以被表征为包含具有一个或多个氨基酸残基(例如半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基)的与人nectin-4多肽特异性结合的抗体，该一个或多个氨基酸残基通过间隔子(y)用包含以下结构的接头-依喜替康分子官能化：

95、

96、在一个实施方案中，与依喜替康缀合的nectin-4抗体或抗体片段可以被表征为包含具有一个或多个氨基酸残基(例如半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基)的与人nectin-4多肽特异性结合的抗体，该一个或多个氨基酸残基通过间隔子(y)用包含以下结构的接头-依喜替康分子官能化：

97、

98、间隔子(y)可以被指定为或包含取代或未经取代的烷基或杂烷基链，任选地其中y的链长为2-40个原子，任选地2-30个、2-20个、4-40个、4-30个或4-20个原子，任选地其中一个或多个原子可以不是碳，例如是氧、硫、氮或其它原子，任选地其中链的任何碳被烷氧基、羟基、烷基羰氧基、烷基-s-、硫醇、烷基-c(o)s-、胺、烷基胺、酰胺或烷基酰胺取代。例如，y可以包括一个或多个环氧乙烷单体，任选地y包括聚环氧乙烷部分，任选地y包括结构-(ch2ch2o)x-，其中x为1到12，任选地1到8，任选地1到6。

99、在一个方面，本发明提供了一种治疗，与现有的抗nectin-4 adc疗法(例如与澳瑞他汀；维汀-恩弗妥单抗缀合的抗nectin-4抗体或抗体片段)相比，该治疗显示出改善的功效和/或改善的(更低的)耐药性。在一个方面，提供了一种在有需要的个体中治疗和/或预防癌症和/或杀死肿瘤细胞的方法，其中该治疗包括以每月1到2次的频率(例如每两周一次、每三周一次或每四周一次)施用2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次与喜树碱衍生物(例如依喜替康或sn-38分子)缀合的nectin-4结合剂。

100、在一个方面，本发明提供了一种在有需要的个体中治疗和/或预防癌症和/或杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括用与喜树碱分子缀合的nectin-4结合抗体或抗体片段(例如，与一个或多个喜树碱部分缀合的抗nectin-4抗体或抗体片段)治疗所述个体，任选地其中该喜树碱是依喜替康、dxd或sn-38。在一个实施方案中，所述个体患有nectin-4表达性肿瘤，任选地其中该肿瘤是her2表达性肿瘤或her阴性肿瘤，例如尿路上皮癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌或食道癌。在一个实施方案中，所述个体患有pgp表达性肿瘤。在一个实施例中，所述癌症或肿瘤是晚期复发性或转移性癌症，任选地是晚期复发性或转移性尿路上皮癌。在一个实施例中，所述癌症或肿瘤是三阴性乳腺癌(tnbc)。

101、在一个方面，本发明提供了一种在有需要的个体中治疗癌症、杀死肿瘤细胞和/或将细胞毒性剂递送至肿瘤的方法，该方法包括向所述个体施用治疗有效量的抗体-药物缀合物，该抗体-药物缀合物包含通过可切割接头缀合至化合物1的依喜替康的抗nectin-4抗体，任选地其中接头的切割导致释放具有化合物1的结构的化合物(依喜替康)，任选地其中可切割接头包含可切割的寡肽(例如，二肽、三肽或四肽、val-cit、val-phe、val-ala)和自消解间隔子(例如pab)，并且其中所述个体患有在用结合剂(任选地nectin-4结合剂)治疗后已经复发和/或已经进展的癌症，该结合剂通过接头缀合至能够被pgp转运的细胞毒性剂(例如，接头是在切割时释放细胞毒性剂的细胞内可切割的接头)。在任何实施方案中，能够被pgp转运的细胞毒性剂是除依喜替康以外的喜树碱类似物，任选地其中能够被pgp转运的细胞毒性剂是五环喜树碱类似物、六环喜树碱、德卢替康(deruxtecan)或dxd，任选地其中接头的裂解导致释放除依喜替康以外的喜树碱类似物(例如，dxd，具有化合物13的结构)。在一个实施方案中，通过接头与能够被pgp转运的细胞毒性剂缀合的结合剂包含通过接头与具有化合物13结构的化合物(dxd，德卢替康)缀合的结合nectin-4的抗体，任选地其中接头包含可切割的含有甘氨酸的寡肽接头，例如含有甘氨酸和苯丙氨酸的寡肽接头，ggfg接头。在一个实施方案中，通过可切割接头与化合物1的依喜替康缀合的抗nectin-4抗体包含与人nectin-4多肽的vc1桥接结构域结合的抗体，例如本公开的抗体。

102、在本文任何实施例的一个方面中，所述个体已经接受过放射疗法、手术、化疗和/或用生物剂治疗的先前治疗。

103、还提供了本公开的免疫缀合物的组合物。还提供了药学上可接受的组合物和试剂盒，其包括本公开的免疫缀合物，以及通常可以是促进组合物的调配、递送、稳定性或其它特性的活性成分或非活性成分的一种或多种另外的成分(例如，各种载体)。还提供了筛选、测试和制备抗nectin-4抗体和抗体片段以及包含它们的免疫缀合物或adc的方法，以及用于其中的工具和试剂。

104、在本文提供的本发明的描述中将更加充分地描述这些方面，并且额外的方面、特征和优点将是显而易见的。