富集的生物活性肾细胞群、其特征及其用途的制作方法

富集的生物活性肾细胞群、其特征及其用途
1.发明背景
2.慢性肾病(ckd)的特征在于如果不进行治疗干预则病情将会恶化的进行性肾病；最终患者可能会达到终末期肾病(esrd)。从美国到欧洲的患病率数据显示，大约10％的普通人群患有1-3期ckd(era,2009；usrds,2011；jha et al.chronic kidney disease:global dimension and perspectives.lancet.2013；382:260-72)。在世界范围内，ckd和esrd的发病率和患病率不断增加，而治疗结果仍然不佳(shaw et al.global estimates of the prevalence of diabetes for2010and 2030.diabetes res clin pract.2010；87:4-14)。1996年至2006年间，仅在美国，慢性肾病的患病率就增加了33％以上(u.s.renal data system.costs of ckd and esrd.minneapolis,mn,2007)。ckd发病率的不断上升对公共健康构成了重大威胁，预计其影响只会越来越大。
3.esrd的最大原因是糖尿病(postma and de zeeuw,2009)，而ckd的发病率持续增加，主要是由于2型糖尿病发病率的增加(postma and de zeeuw,2009)。由于潜在的合并症和/或危险因素(包括高血压和肾血管疾病)，ckd常常伴随着不良后果(khan et al.,2002；stenvinkel p.chronic kidney disease
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apublic health priority and harbinger of premature cardiovascular disease j intern med.2010；268:456-67)。由于严重的合并症，ckd患者过早死亡的可能性比存活并进展为esrd的可能性高出5-11倍(collins et al.,2003；smith et al.,2004)。为了生存，esrd患者需要肾脏替代治疗(透析或移植)。目前，美国有超过50万人需要透析或肾移植，在每年医疗保险费用中占据超过220亿美元(医疗保险预算总额的6％)(annual report of the u.s.organ procurement and transplantation network and the scientific registry of transplant recipients:transplant data 1998
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2007.rockville,md:hhs/hrsa/hsb/dot,2008)。肾移植是ckd的最终治疗标准，提供比透析更好的长期生存(和成本效益)；然而，器官仍然长期短缺。尽管尸体和活体肾脏捐献者数量有所增加，但美国每100名透析患者年移植率实际上正在下降。通过在疾病早期进行干预来预防或延缓ckd的不良后果是ckd治疗的主要策略。不幸的是，预防疾病进展的早期治疗方法尚未成功。
4.涉及组织工程和基于细胞的应用的新治疗范例可以提供肾功能的显著且持久的增强、减缓疾病进展并改善该患者群体的生活质量。这些下一代再生医学技术提供分离的肾细胞作为ckd的治疗选择(presnell et al.wo/2010/056328和ilagan et al.pct/us2011/036347)。将这些具有生物活性的肾细胞注射到ckd动物模型的肾脏中，可以导致动物存活和肾功能的显著改善。
5.本领域需要鉴定基于其再生或肾发生能力具有肾脏疾病治疗的治疗潜力的细胞，并确保基于肾细胞的治疗达到预期的功效水平。
6.发明概述
7.本公开描述了鉴定富集的异质肾细胞群是否具有治疗潜力的方法。在该方法中，测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达至少一种肾发生标志物。如果富集的异质肾细胞群的细胞表达至少一种肾发生标志物，则富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗潜力。至
少一种肾发生标志物包括six2、osr1、lhx1、ret和fgf8中的一种或多种。
8.本公开还描述了鉴定富集的异质肾细胞群是否具有治疗潜力的进一步方法。在该方法中，测定富集的异质肾细胞群的细胞中rhamm、c2、c3、c4、纤维蛋白原、凝血因子xiii、tek、kdr、notch1、notch3、timp3、vwf、adam15、gas6、igfbp1和tm4sf4基因中的一种或多种的表达水平。如果富集的异质肾细胞群的细胞中一种或多种基因的表达水平相对于对照肾细胞群的细胞中一种或多种基因的表达水平增加，则富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗潜力。
9.本公开描述了鉴定富集的异质肾细胞群具有治疗潜力的又一种方法。在该方法中，测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达six2、osr1、ret和足蛋白。如果测定富集的异质肾细胞群的细胞表达six2、osr1、ret和足蛋白，则富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗潜力。
10.本公开描述了鉴定富集的异质肾细胞群具有治疗潜力的又一种方法。在该方法中，测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达去肾病蛋白、足蛋白和lhx1。如果测定富集的异质肾细胞群的细胞表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1，则富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗潜力。
附图说明
11.图1a提供了描述检测到的由所选肾细胞群(例如，富集的异质肾细胞群)的细胞表达的细胞标志物、这些标志物的细胞来源以及在肾脏中表达这些标志物的细胞可能参与发育的结构的表格。
12.图1b提供了显示通过荧光激活细胞分选(facs)测定为表达图1a中描述的标志物的选定肾细胞群(例如，富集的异质肾细胞群)的细胞百分比的图。显示了平均百分比和95％ci。
13.图2提供了富集差异表达基因(deg)集的京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,kegg)通路的散点图。纵坐标表示通路名称，且横坐标表示富集系数。每个点的大小和颜色分别代表该通路中差异基因的数量和不同q值的范围。tgf-β信号传导通路、沙门氏菌感染、类风湿性关节炎、嘧啶代谢、癌症中的蛋白多糖、癌症中的通路、其他类型的o-聚糖生物合成、军团菌病、hippo信号传导通路、htlv-1感染、foxo信号传导通路、药物代谢-其他酶和细胞周期的暗点均处于较高的q值范围，接近1.00。糖尿病并发症中age-rage信号传导通路和阿米巴病的点均处于较低的q值范围，接近0.00。蛋白质消化和吸收、小细胞肺癌、ecm-受体相互作用、轴突引导以及精氨酸和脯氨酸代谢的点处于中低q值范围内。
14.图3提供了deg集的kegg通路注释图。
15.图4显示差异甲基化区域(dmr)平均甲基化水平分布的小提琴_箱线图。hyper-dmr是指样品中甲基化程度较高的dmr，hypo-dmr是指样品中甲基化程度较低的dmr。
16.图5a-h提供了来自细胞的facs分析的以下基因表达的散点图：(a)six2、(b)osr1、(c)lhx1、(d)ret、(e)肾病蛋白、(f)足蛋白、(g)fgf8和(h)rack-1。(a)
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(h)中每个的顶部散点图使用了对阴性细胞进行门控的同种型对照抗体。(a)
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(h)中的每个的底部散点图均使用抗原特异性抗体来检测阳性细胞，门控远离阴性细胞。阳性细胞群位于纵轴右侧或横轴
上方。
17.发明详述
18.肾脏是一个复杂的器官，由许多不同的细胞类型组成，包括足细胞、系膜细胞、内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞和众多干细胞和祖细胞群，它们在肾实质中组织成离散的、特化的功能单位或肾单位，用于选择性地过滤脉管系统中的电解质。肾脏的这种复杂性使得生成固态肾脏器官替代结构异常困难。
19.哺乳动物肾脏发育的复杂过程始于被称为中间中胚层的中胚层区域。前肾或“第一肾脏”代表中间中胚层产生的肾脏发育中谱系规范的初始步骤。前肾是小而空心的上皮管状细胞球，与前肾管相连。然后前肾管向尾部延伸，而前肾本身退化。中间中胚层现在形成第二肾脏或中肾，也称为中肾管。在女性中，这种现象会消退，但在男性中，其最终会变成附睾，或者说睾丸和膀胱之间的结缔组织。中肾肾脏由约30个肾小管组成。中肾小管的侧端与中肾管融合，打开从排泄单位到泄殖腔的通道。泄殖腔最终变成膀胱和直肠。最后，最终肾脏或后肾间质从输尿管芽发育而来，输尿管芽从肾管萌发并广泛分支，其中每个新生长的尖端获得后肾胚组织的帽状聚集体，从而赋予后肾分叶状外观。
20.输尿管芽和后肾间质之间的双向信号传导最终负责介导肾发生的重要事件。输尿管芽是e10.5时肾管的分支，向周围的后肾间质发出信号，诱导后肾间质细胞在侵入的输尿管芽尖端周围凝聚。然后这些间充质凝聚物经历间充质-上皮转变，形成称为肾囊泡的原始上皮囊泡。输尿管芽的持续分支导致集合管系统和肾盂组件的发育。与此同时，肾小泡发生一系列系统的形态变化，最终与输尿管芽上皮融合以形成连续的上皮小管，即s形体。内皮细胞对s形体的浸润导致肾小球脉管系统的形成。输尿管芽上皮响应来自邻近后肾间质的信号传导而持续分支形态发生，进而导致在输尿管芽尖端诱导新的后肾间质聚集体和持续的肾发生事件。输尿管芽分支形态发生和额外间充质凝聚物诱导的迭代过程沿着发育中肾脏的径向轴继续，其中最年轻的肾单位被诱导到外周。
21.发育中肾脏的分支形态发生和伴随的肾发生的分子遗传学是复杂的。简而言之，输尿管芽的诱导是通过其受体ret上调分泌的生长因子gdnf来触发的。ret沿前肾管的表达在输尿管芽形成部位最高。gdnf或ret的敲除突变是胚胎致死性的，并且与输尿管出芽失败以及随后的肾脏和输尿管形成的终止有关。gdnf表达上调是通过转录因子(包括pax2、six1、2、4)的作用实现的。
22.后肾间质凝聚物转化为肾小泡过程中的间质-上皮转化主要由wnt家族蛋白(包括wnt9b和wnt4)控制。因此，wnt4的敲除在出生后24小时内死亡；肾脏小且异常，由未分化的后肾间质组成。调节输尿管芽分支和肾发生方面的其他生长因子包括tgf-β、fgf2、fgf7、lif和lim1。多个相互作用的信号传导通路还参与输尿管芽分支和肾发生两方面的调节。这些包括经典的wnt/β-连环蛋白通路、sonic hedgehog通路以及tgf-β超家族信号传导通路的bmp和fgf成员。
23.中间中胚层沿前/后轴的区域化以某些关键转录因子(包括pax2、pax8、osr1和wt1)的表达为标志。osr1最初指定来自近轴板和侧板命运的中间中胚层，但其对于帽间充质的特化和存活至关重要。osr1表达变得仅限于帽间充质，并且osr1缺失小鼠无法显示关键帽间充质基因(pax2、six2、gdnf、eya1和sall1)的表达。相比之下，尽管在这些谱系分离之前osr1在后肾间充质中表达，但foxd1+基质室的形成并不需要osr1。
24.wnt9b基因在诱导后肾发育之前在上皮wolffian管中表达。wnt9b在输尿管芽中继续表达，其中表达在茎部区域比在尖端更明显。wnt9b在小鼠集合管中的表达一直维持到成年。wnt9b介导的帽间充质诱导启动wnt4、成纤维细胞生长因子8(fgf8)、配对盒8(pax8)和lim同源盒蛋白1(lhx1)编码基因的表达。这些基因无法在wnt9b缺陷的胚胎肾的帽间充质中表达，并且没有肾单位形成，因此wnt9b敲除小鼠在出生后很快死亡。
25.观察到的多个标志物的表达通常与胚胎肾发生过程中最早的信号传导事件相关，可以表明富集的异质肾细胞群(在从肾脏分离并经过分离步骤后扩增)可能已经去分化并获得了更多的肾祖细胞样特性。因此，将具有这些肾祖细胞样特性的富集的异质肾细胞群引入患病肾实质中可能会触发通常介导肾发生的关键信号传导级联的发生，但在成人肾实质的背景下被解释为再生。
26.本文描述了将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法、鉴定为具有治疗潜力的异质肾细胞群以及具有治疗潜力的异质肾细胞群的方法和用途。
27.在将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，富集的异质肾细胞群的治疗潜力可以是治疗肾脏疾病、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷。
28.如果富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗肾脏疾病的潜力，则该肾脏疾病可能与任何阶段或程度的急性或慢性肾衰竭相关，所述急性或慢性肾衰竭导致肾脏执行以下功能的能力丧失：血液过滤和消除血液中多余的液体、电解质和废物。肾脏疾病可以包括内分泌功能障碍，如贫血，例如促红细胞生成素缺乏，以及矿物质失衡，例如维生素d缺乏。肾脏疾病可以起源于肾脏，或者也可以继发于另一种疾病，例如心力衰竭、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病或肝脏疾病。替代性地，肾脏疾病可能在肾脏急性损伤后发生，或者可能是肾脏和/或泌尿道异常的结果。
29.如果富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗潜力，则富集的异质肾细胞群可以在需要此类治疗的患者中恢复肾功能、稳定肾功能、改善肾功能、减少肾纤维化、减少肾脏炎症、诱导肾脏中的小管生成、诱导肾脏中的肾发生、诱导肾脏中的肾小球生成、或在肾脏中具有再生作用。如果富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗潜力，则富集的异质肾细胞群可以在需要此类治疗的患者中恢复矿物质平衡或减轻贫血。如果富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗潜力，则其可以在需要肾病治疗的患者中延迟或防止透析的需要，或者其可以延迟或防止进行肾移植的需要。
30.在将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，可以测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达至少一种肾发生标志物。在该方法中测定其表达的至少一种肾发生标志物可以是six同源盒2(six2)、奇略过相关1(odd-skipped-related 1；osr1)、lim同源盒1(lhx1)、转染期重排(rearragnged during transfection；ret)或成纤维细胞生长因子8(fgf8)中的任意一种。在该方法中测定其表达的至少一种肾发生标志物可以是或可以包括six2、osr1、lhx1、ret和fgf8中的任意一种、任意两种、任意三种、任意四种或全部。
31.在这些将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，测定至少一种肾发生标志物的表达可以是或可以包括测定肾发生标志物six2、osr1、lhx1、ret或fgf8中的任意两种的表达。如果测定的是这些肾发生标志物中的任意两种的表达，则这两种肾发生标志物可以是或可以包括six2和osr1、或six2和lhx1、或six2和ret、或six2和fgf8、或osr1和lhx1、或osr1和ret、或osr1和fgf8、或lhx1和ret、或lhx1和fgf8、或ret和fgf8。
32.在将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，测定至少一种肾发生标志物的表达可以是或可以包括测定肾发生标志物six2、osr1、lhx1、ret或fgf8中的任意三种的表达的测定。如果测定的是这些肾发生物中的任意三种的表达，则这三种肾发生标志物可以是或可以包括six2、osr1和lhx1，或six2、osr1和ret，或six2、osr1和fgf8，或six2、lhx1和ret，或six2、lhx1和fgf8，或six2、ret和fgf8，或osr1、lhx1和ret，或osr1、lhx1和fgf8，或osr1、ret和fgf8，或lhx1、ret和fgf8。
33.在鉴定富集的异质肾细胞群具有治疗潜力的方法中，测定至少一种肾发生标志物的表达可以是或可以包括测定肾发生标志物six2、osr1、lhx1、ret或fgf8中的任意四种的表达。如果测定的是这些肾发生标志物中的任意四种的表达，则这四种肾发生标志物可以是或可以包括six2、osr1、lhx1和ret，或six2、osr1、lhx1和fgf8，或six2、lhx1、ret和fgf8，或six2、osr1、ret和fgf8或osr1、lhx1、ret和fgf8中的任一种。
34.将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，至少一种肾发生标志物的表达的测定可以是或可以包括肾发生标志物six2、osr1、lhx1、ret或fgf8中的每种的表达的测定。
35.在将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，测定异质富集的肾细胞群的细胞表达至少一种(例如，任意一种、或任意两种、或任意三种、或任意四种或所有五种)肾发生标志物可以将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力。
36.在将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，测定至少一种肾发生标志物的表达还可以包括测定富集的异质肾细胞群中表达至少一种肾发生标志物的细胞的百分比。如果测定了富集的异质肾细胞群中表达至少一种肾发生标志物的细胞的百分比，则可以测定表达肾发生标志物six2、osr1、lhx1、ret和fgf8中的任意一种、任意两种、任意三种、任意四种或所有五种的细胞的百分比。如果测定了富集的异质肾细胞群中表达至少一种肾发生标志物的细胞的百分比，则如果富集的异质肾细胞群表达肾发生标志物six2、osr1、lhx1、ret和fgf8中的任意一种、任意两种、任意三种、任意四种或全部五种的细胞达到约某个或特定的百分比，则可以将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力。
37.如果在该方法中测定了富集的异质肾细胞群中表达six2的细胞的百分比，并且测定了富集的异质肾细胞群中至少约0.02％的细胞表达six2，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。替代性地，如果富集的异质肾细胞群中表达six2的细胞的百分比测定为至少约0.04％、或至少约0.1％、或至少约0.5％、或至少约1.0％、或至少约1.5％、或至少约2.0％、或至少约2.5％、或至少约3.0％、或至少约3.5％、或至少约4.0％、或至少约4.5％、或至少约5.0％、或至少约5.5％，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。如果富集的异质肾细胞群中表达six2的细胞的百分比测定为大于0％且最高达至多约15.0％、大于0％且最高达至多约10.0％、或大于0％且最高达至多约9.5％、或大于0％且最高达至多约9.0％、或大于0％且最高达至多约8.5％、或大于0％且最高达至多约8.0％、或大于0％且最高达至多约7.5％、或大于0％且最高达至多约7.0％、或大于0％且最高达至多约6.5％、或大于0％且最高达至多约6.0％，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。此外，如果富集的异质肾细胞群中表达six2的细胞的百分比测定为约0.02％至约15.0％之间、或约0.02％至约10.0％之间、或约0.02％至约9.0％之间、或约0.02％至约8.0％之间、或约0.02％至约7.0％之间、或约0.02％至约6.0％之间、或约0.04％至约
15.0％之间、或约0.04％至约10.0％之间、或约0.04％至约9.0％之间、或约0.04％至约8.0％之间、或约0.04％至约7.0％之间、或约0.04％至约6.0％之间、或约1.0％至约15.0％之间、或约1.0％至约10.0％之间、或约1.0％至约9.0％之间、或约1.0％至约8.0％之间、或约1.0％至约7.0％之间、或约1.0％至约6.0％之间，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
38.如果在该方法中测定了富集的异质肾细胞群中表达osr1的细胞的百分比，并且测定了富集的异质肾细胞群中至少约30％的细胞表达osr1，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。替代性地，如果富集的异质肾细胞群中表达osr1的细胞的百分比测定为至少约35％、或至少约36％、或至少约37％、或至少约38％、或至少约39％、或至少约40％、或至少约41％、或至少约42％、或至少约43％、或至少约44％、或至少约45％、或至少约50％，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。如果富集的异质肾细胞群中表达osr1的细胞的百分比测定为大于0％且最高达至多约90％、或大于0％且最高达至多约88％、或大于0％且最高达至多约86％、或大于0％且最高达至多约84％、或大于0％且最高达至多约82％、或大于0％且最高达至多约80％、或大于0％且最高达至多约75％、或大于0％且最高达至多约70％，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。此外，如果富集的异质肾细胞群中表达osr1的细胞的百分比测定为在约30％与约90％之间、或在约30％与约88％之间、或在约30％与约86％之间、或在约30％至约84％之间、或在约30％至约82％之间、或在约30％与约80％之间、或在34％与90％之间、或在约34％与约88％之间、或在约34％与约86％之间、或在约34％与约84％之间、或在约34％与约82％之间、或在约34％与约80％之间、或在约36％与约90％之间、或在约36％与约88％之间、或在约36％与约86％之间、或在约36％与约84％之间、或在约36％与约82％之间、或在约36％与约80％之间、或在约40％与约90％之间、或在约40％与约85％之间、或在约45％与约90％之间、或在约45％与约85％之间、或在约50％与约90％之间、或在约50％与约85％之间、或在约55％与约90％之间、或在约55％与约85％之间、或在约60％与约90％之间、或在约60％与约85％之间、或在约65％与约90％之间、或在约65％与约85％之间、或在约70％与约90％之间、或在约70％与约85％之间，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有再生潜力。
39.如果在该方法中测定了富集的异质肾细胞群中表达lhx1的细胞的百分比，并且测定了富集的异质肾细胞群中至少约5％的细胞表达lhx1，则异质富集肾细胞群可以被鉴定为具有再生潜力。替代性地，如果富集的异质肾细胞群中表达lhx1的细胞的百分比测定为至少约6％、或至少约7％、或至少约8％、或至少约9％或至少约10，则异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。如果富集的异质肾细胞群中表达lhx1的细胞的百分比测定为大于0％且最高达至多75％、或大于0％且最高达至多70％、或大于0％且最高达至多约65％、或大于0％且最高达至多约64％、或大于0％且最高达至多约63％、或大于0％且最高达至多约62％、或大于0％且最高达至多约61％、或大于0％且最高达至多约60％、或大于0％且最高达至多约59％、或大于0％且最高达至多约58％、或大于0％且最高达至多约57％、或大于0％且最高达至多约56％、或大于0％且最高达至多约55％，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。此外，如果富集的异质肾细胞群中表达lhx1的细胞的百分比测定为在约6％与约60％之间、或在约6％与约59％之间、或在约6％与约58％之间、或约6％与约57％之间、或在约6％与约56％之间、或在约6％与约55％之间、或在约6％与约54％之间、或
在约8％与约60％之间、或在约8％与约59％之间、或在约8％与约58％之间、或在约8％与约57％之间、或在约8％与约56％之间、或在约8％与约55％之间、或在约8％与约54％之间、或在约10％与约60％之间、或在约10％与约59％之间、或在约10％与约58％之间、或在约10％与约57％之间、或在约10％与约56％之间、或在约10％与约55％之间、或在约10％与约54％之间、或在约16％与80％之间、或在约16％与70％之间、或在约16％与约60％之间、或在约16％与约58％之间、或在约16％与约56％之间、或在约16％与约54％之间、或在约16％与约52％之间、或在约16％与约50％之间、或在22％与约60％之间、或在约22％与约58％之间、或约22％与约56％之间、或约22％与约54％之间、或约22％与约52％之间、或约22％与约50％之间，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有再生潜力。
40.如果在该方法中测定了富集的异质肾细胞群中表达ret的细胞的百分比，并且测定了富集的异质肾细胞群中至少约45％的细胞表达ret，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。替代性地，如果富集的异质肾细胞群中表达ret的细胞百分比测定为至少约22％、至少约24％、至少约26％、至少约28％、至少约30％、至少约32％、至少约34％、至少约36％、至少约38％、至少约40％、至少约42％、至少约44％、至少约46％、或至少约47％、或至少约48％、或至少约49％、或至少约50％、或至少约51％、或至少约52％、或至少约53％、或至少约54％，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。如果富集的异质肾细胞群中表达ret的细胞的百分比测定为大于0％且最高达至多约95％、或大于0％且最高达至多约94％、或大于0％且最高达至多约93％、或大于0％且最高达至多约92％、或大于0％且最高达至多约91％、或大于0％且最高达至多约90％、或大于0％且最高达至多约89％、或大于0％且最高达至多约88％、或大于0％且最高达至多约87％、或大于0％且最高达至多约86％、或大于0％且最高达至多约85％，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。此外，如果富集的异质肾细胞群中表达ret的细胞百分比测定为在约45％与约95％之间、或在约45％与约94％之间、或在约45％与约93％之间、或在约45％与约92％之间、或在约45％与约91％之间、或在约45％与约90％之间、或在约45％与约89％之间、或在约45％与约88％之间、或在约47％与约95％之间、或在约47％与约94％之间、或在约47％与约93％之间、或在约47％与约92％之间、或在约47％与约91％之间、或在约47％与约90％之间、或在约47％与约89％之间、或在约47％与约88％之间、或在约49％与约95％之间、或在约49％与约94％之间、或在约49％与约93％之间、或在约49％与约92％之间、或在约49％与约91％之间、或在约49％与约90％之间、或在约49％与约89％之间、或在约49％与约88％之间、或在约20％与约60％之间、或在约20％与约55％之间、或在约20％与约50％之间、或在约20％与约45％之间、或在约20％与约40％之间、或在约25％与约60％之间、或在约25％与约55％之间、或在约25％与约50％之间、或在约25％与约45％之间、或在约25％与约40％之间，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
41.如果在该方法中测定了富集的异质肾细胞群中表达fgf8的细胞的百分比，并且测定了富集的异质肾细胞群中至少约0.2％的细胞表达fgf8，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。替代性地，如果富集的异质肾细胞群中表达fgf8的细胞的百分比测定为至少约0.25％、或至少约0.3％、或至少约0.35％、或至少约0.4％、或至少约0.45％、或至少约0.48％、或至少约0.5％、或至少约0.55％、或至少约0.6％、或至少约0.8％、或至少约1.0％、或至少约1.5％、或至少约2.0％、或至少约2.5％，则富集的异质肾细胞群可以被
鉴定为具有治疗潜力。如果富集的异质肾细胞群中表达fgf8的细胞的百分比测定为大于0％且最高达至多约65％、或大于0％且最高达至多约64％、或大于0％且最高达至多约63％、或大于0％且最高达至多约62％、或大于0％且最高达至多约61％、或大于0％且最高达至多约60％、或大于0％且最高达至多约59％、或大于0％且最高达至多约58％、或大于0％且最高达至多约57％、或大于0％且最高达至多约56％、或大于0％且最高达至多约55％，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。此外，如果富集的异质肾细胞群中表达fgf8的细胞百分比测定为在约0.3％与约64％之间、或在约0.3％与约63％之间、或在约0.3％与约62％之间、或在约0.3％与约61％之间、或在约0.3％与约60％之间、或在约0.3％与约59％之间、或在约0.3％与约58％之间、或在约0.3％与约57％之间、或在约0.4％与约64％之间、或在约0.4％与约63％之间、或在约0.4％与约62％之间、或在约0.4％与约61％之间、或在约0.4％与约60％之间、或在约0.4％与约59％之间、或在约0.4％与约58％之间、或在约0.4％与约57％之间、或在约0.5％与约64％之间、或在约0.5％与约63％之间、或在约0.5％与约62％之间、或在约0.5％与约61％之间、或在约0.5％与约60％之间、或在约0.5％与约59％之间、或在约0.5％与约58％之间、或在约0.5％与约57％之间、或在约1％与约64％之间、或在约1％与约54％之间、或在约1％与约44％之间、或在约1％与约34％之间、或在1％与约24％之间、或在约2％与约64％之间、或在约2％与约54％之间、或在约2％与约44％之间、或在约2％与约34％之间、或在2％与约24％之间、或在约3％与约64％之间、或在约3％与约54％之间、或在约3％与约44％之间、或在约3％与约34％之间、或在3％与约24％之间，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
42.将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法可以包括确定异质肾细胞群中表达肾发生标志物six2、osr1、lhx1、ret和fgf8中任意两种、任意三种、任意四种或所有五种的组合的细胞的百分比的步骤。例如，如果测定了以下任意两种、任意三种、任意四种或所有五种的组合，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力：异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约6％的细胞表达six2，异质肾细胞群的至少约36％的细胞表达osr1，富集的异质肾细胞群的至少约8％的细胞表达lhx1，富集的异质肾细胞群的至少约49％的细胞表达ret，和/或富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约59％的细胞表达fgf8。在另一个实例中，如果测定了以下任意两种、任意三种、任意四种或所有五种，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力：富集的异质肾细胞群的至少约0.04％的细胞表达six2，富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约85％的的细胞表达osr1，富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约58％的细胞表达lhx1，富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约90％的细胞表达ret，和/或富集的异质肾细胞群的至少约0.48％的细胞表达fgf8。如果测定了以下任意两种、任意三种、任意四种或所有五种，则富集的异质肾细胞群可以进一步被鉴定为具有治疗潜力：富集的异质肾细胞群的约0.04％与约6.0％之间的细胞表达six2，富集的异质肾细胞群的约36％与约85％之间的细胞表达osr1，富集的异质肾细胞群的约8％与约58％之间的细胞表达lhx1，富集的异质肾细胞群的约49％与约90％之间的细胞表达ret并且约0.48％和/或约59％之间的细胞表达fgf8。可以以这些百分比测定其表达的任意两种、任意三种、任意四种或所有五种肾发生标志物的组合可以是以下任一个组合：six2和osr1；或six2和lhx1；或six2和ret；或six2和fgf8；或osr1和lhx1；或osr1和ret；或osr1和fgf8；或lhx1和ret；或lhx1和fgf8；或ret和fgf8；或six2、
osr1和lhx1；或six2、osr1和ret；或six2、osr1和fgf8；或six2、lhx1和ret；或six2、lhx1和fgf8；或six2、ret和fgf8；或osr1、lhx1和ret；或osr1、lhx1和fgf8；或osr1、ret和fgf8；或lhx1、ret和fgf8；或six2、osr1、lhx1和ret；six2、osr1、lhx1和fgf8；six2、lhx1、ret和fgf8；six2、osr1、ret和fgf8；osr1、lhx1、ret和fgf8；或six2、osr1、lhx1、ret和fgf8。
43.在将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，如果测定了以下任意两种、任意三种、任意四种或所有五种，则富集的异质肾细胞群可以被选择性地鉴定为具有治疗潜力：异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约10％的细胞表达six2，异质肾细胞群的至少约30％的细胞表达osr1，富集的异质肾细胞群的至少约5％的细胞表达lhx1，富集的异质肾细胞群的至少约40％的细胞表达ret，和/或富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约60％的细胞表达fgf8。在另一个实例中，如果测定了以下任意两种、任意三种、任意四种或所有五种，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力：富集的异质肾细胞群的至少约0.02％的细胞表达six2，富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约90％的的细胞表达osr1，富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约65％的细胞表达lhx1，富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约95％的细胞表达ret，和/或富集的异质肾细胞群的至少约0.4％的细胞表达fgf8。此外，如果测定了以下任意两种、任意三种、任意四种或所有五种，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力：富集的异质肾细胞群的约0.02％与约10.0％之间的细胞表达six2，富集的异质肾细胞群的约30％与约90％之间的细胞表达osr1，富集的异质肾细胞群的约5％与约65％之间的细胞表达lhx1，富集的异质肾细胞群的约40％与约95％之间的细胞表达ret和/或约0.4％与约60％之间的细胞表达fgf8。可以以这些百分比测定其表达的任意两种、任意三种、任意四种或所有五种肾发生标志物的组合可以是以下任一个组合：six2和osr1；或six2和lhx1；或six2和ret；或six2和fgf8；或osr1和lhx1；或osr1和ret；或osr1和fgf8；或lhx1和ret；或lhx1和fgf8；或ret和fgf8；或six2、osr1和lhx1；或six2、osr1和ret；或six2、osr1和fgf8；或six2、lhx1和ret；或six2、lhx1和fgf8；或six2、ret和fgf8；或osr1、lhx1和ret；或osr1、lhx1和fgf8；或osr1、ret和fgf8；或lhx1、ret和fgf8；或six2、osr1、lhx1和ret；six2、osr1、lhx1和fgf8；six2、lhx1、ret和fgf8；six2、osr1、ret和fgf8；osr1、lhx1、ret和fgf8；或six2、osr1、lhx1、ret和fgf8。
44.在将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，如果测定了以下任意两种、任意三种、任意四种或所有五种，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力：异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约3％的细胞表达six2，异质肾细胞群的至少约60％的细胞表达osr1，富集的异质肾细胞群的至少约25％的细胞表达lhx1，富集的异质肾细胞群的至少约65％的细胞表达ret，和/或富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约35％的细胞表达fgf8。在另一个实例中，如果测定了以下任意两种、任意三种、任意四种或所有五种，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力：富集的异质肾细胞群的至少约0.5％的细胞表达six2，富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约80％的的细胞表达osr1，富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约55％的细胞表达lhx1，富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约90％的细胞表达ret，和/或富集的异质肾细胞群的至少约5％的细胞表达fgf8。此外，如果测定了以下任意两种、任意三种、任意四种或所有五种，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力：富集的异质肾细胞群的约0.5％与
约3.0％之间的细胞表达six2，富集的异质肾细胞群的约60％与约80％之间的细胞表达osr1，富集的异质肾细胞群的约25％与约55％之间的细胞表达lhx1，富集的异质肾细胞群的约65％与约90％之间的细胞表达ret和/或约5％与约35％之间的细胞表达fgf8。可以以这些百分比测定其表达的任意两种、任意三种、任意四种或所有五种肾发生标志物的组合可以是以下任一个组合：six2和osr1；或six2和lhx1；或six2和ret；或six2和fgf8；或osr1和lhx1；或osr1和ret；或osr1和fgf8；或lhx1和ret；或lhx1和fgf8；或ret和fgf8；或six2、osr1和lhx1；或six2、osr1和ret；或six2、osr1和fgf8；或six2、lhx1和ret；或six2、lhx1和fgf8；或six2、ret和fgf8；或osr1、lhx1和ret；或osr1、lhx1和fgf8；或osr1、ret和fgf8；或lhx1、ret和fgf8；或six2、osr1、lhx1和ret；six2、osr1、lhx1和fgf8；six2、lhx1、ret和fgf8；six2、osr1、ret和fgf8；osr1、lhx1、ret和fgf8；或six2、osr1、lhx1、ret和fgf8。
45.在将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，如果测定了以下任意两种、任意三种、任意四种或所有五种，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力：异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约10％的细胞表达six2，异质肾细胞群的至少约35％的细胞表达osr1，富集的异质肾细胞群的至少约8％的细胞表达lhx1，富集的异质肾细胞群的至少约20％的细胞表达ret，和/或富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约60％的细胞表达fgf8。在另一个实例中，如果测定了以下任意两种、任意三种、任意四种或所有五种，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力：富集的异质肾细胞群的至少约0.2％的细胞表达six2，富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约85％的的细胞表达osr1，富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约65％的细胞表达lhx1，富集的异质肾细胞群的大于0％且最高达至多约90％的细胞表达ret，和/或富集的异质肾细胞群的至少约0.5％的细胞表达fgf8。此外，如果测定了以下任意两种、任意三种、任意四种或所有五种，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力：富集的异质肾细胞群的约0.2％与约10.0％之间的细胞表达six2，富集的异质肾细胞群的约35％与约85％之间的细胞表达osr1，富集的异质肾细胞群的约8％与约65％之间的细胞表达lhx1，富集的异质肾细胞群的约20％与约90％之间的细胞表达ret和/或约0.5％与约60％之间的细胞表达fgf8。可以以这些百分比测定其表达的任意两种、任意三种、任意四种或所有五种肾发生标志物的组合可以是以下任一个组合：six2和osr1；或six2和lhx1；或six2和ret；或six2和fgf8；或osr1和lhx1；或osr1和ret；或osr1和fgf8；或lhx1和ret；或lhx1和fgf8；或ret和fgf8；或six2、osr1和lhx1；或six2、osr1和ret；或six2、osr1和fgf8；或six2、lhx1和ret；或six2、lhx1和fgf8；或six2、ret和fgf8；或osr1、lhx1和ret；或osr1、lhx1和fgf8；或osr1、ret和fgf8；或lhx1、ret和fgf8；或six2、osr1、lhx1和ret；six2、osr1、lhx1和fgf8；six2、lhx1、ret和fgf8；six2、osr1、ret和fgf8；osr1、lhx1、ret和fgf8；或six2、osr1、lhx1、ret和fgf8。
46.应当理解，如果表达某种标志物的细胞百分比被提供为“约”特定数字的百分比，例如约5％，则细胞百分比不需要恰好是该特定数字，例如恰好5％。相反，应当理解，如果表达某种标志物的细胞百分比被提供为“约”特定数字，例如约5％，则表达某种标志物的细胞百分比可以在该特定数字最高达10％的范围内，例如在4.5％与5.5％之间。
47.在将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，可以测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达一种或多种另外的标志物，即除了肾发生标志物six2、osr1、lhx1、ret和fgf8之外的标志物。一种或多种另外的标志物可以是或者可以包括足细胞标志物、上
皮标志物、发育标志物或mirna中的一种或多种。如果一种或多种另外的标志物包括足细胞标志物，则一种或多种另外的标志物可以包括一种或多种肾病蛋白、epicam、nphs2(编码足蛋白)、足蛋白、威尔姆斯肿瘤蛋白(wt1)或足细胞标志蛋白。如果一种或多种另外的标志物包括上皮细胞标志物，则一种或多种另外的标志物可以包括e-钙粘蛋白、n-钙粘蛋白、cubulin/megalin、维生素d-25羟化酶(cyp2r1)、γ-谷氨酰转移酶1(ggt1)、肝脏富集转录蛋白(lap)、细胞角蛋白(ck)18、水通道蛋白(aqp)2、肾损伤分子(kim1)、促红细胞生成素(epo)、激酶插入结构域受体(kdr)、上皮细胞粘附分子(ecam)或aqp1中的一种或多种。如果一种或多种另外的标志物包括发育标志物，则发育标志物可以包括嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)、sonic hedgehog(shh)、notch、c-x-c基序趋化因子受体4(cxcr4)、lunatic fringe(lfng)或il-11中的一种或多种。一种或多种另外的标志物可以是或可以包括活化的c激酶1(rack-1)的受体。如果一种或多种另外的标志物包括mirna，则mirna可以是mir22、mir181或mir145中的一种或多种。
48.如果一种或多种另外的标志物包括足细胞标志物，则足细胞标志物可以是肾病蛋白。在此方法中，如果进一步测定富集的异质肾细胞群的细胞表达肾病蛋白，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。如果一种或多种另外的标志物是或包括肾病蛋白，则可以测定富集的异质肾细胞群中表达肾病蛋白的细胞的百分比。如果测定了富集的异质肾细胞群中表达肾病蛋白的细胞的百分比，则如果至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的异质肾细胞群的细胞表达肾病蛋白，富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。如果测定了富集的异质肾细胞群中表达肾病蛋白的细胞的百分比，则如果在约4％与约95％之间、或在约10％与约95％之间、或在约15％与约95％之间、或在约20％与约95％之间、或在约25％与约95％之间、或在约30％与约95％之间、或在35％与约95％之间、或在约40％与约95％之间、或在约45％与95％之间、或在约50％与约95％之间、或在约55％与约95％之间、或在约60％与约95％之间、或在约65％与约95％之间、或在70％与约95％之间、或在约75％与约95％之间、或在约80％与约95％之间、或在约85％与约95％之间的异质肾细胞群的细胞表达肾病蛋白，富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
49.如果一种或多种另外的标志物是或包括足细胞标志物，则足细胞标志物可以是足蛋白。在此方法中，如果进一步测定富集的异质肾细胞群的细胞表达足蛋白，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。如果一种或多种另外的标志物是或包括足蛋白，则可以测定富集的异质肾细胞群中表达足蛋白的细胞的百分比。如果测定了富集的异质肾细胞群中表达足蛋白的细胞的百分比，则如果至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％或至少约98％的异质肾细胞群的细胞表达足蛋白，富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
50.如果一种或多种另外的标志物包括足细胞标志物，则足细胞标志物可以包括肾病蛋白和足蛋白两者。在此方法中，如果进一步测定富集的异质肾细胞群的细胞表达肾病蛋白和足蛋白，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。如果一种或多种另外的标志物包括肾病蛋白和足蛋白，则可以测定富集的异质肾细胞群中表达肾病蛋白和足蛋白
的细胞的百分比。如果测定了富集的异质肾细胞群中表达肾病蛋白和足蛋白的细胞的百分比，则如果至少4％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达表达足蛋白，或者如果至少8％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，如果至少10％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少12％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少14％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少20％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少25％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少30％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少35％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少40％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少45％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少50％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少55％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少60％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少65％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少70％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，或者如果至少75％的细胞表达肾病蛋白并且至少约90％的细胞表达足蛋白，富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
51.如果一种或多种另外的标志物是或包括rack-1，则如果该群体的细胞表达rack-1，富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。如果一种或多种另外的标志物是或包括rack-1，则可以测定富集的异质肾细胞群中表达rack-1的细胞的百分比。如果测定了富集的异质肾细胞群中表达rack-1的细胞的百分比，则如果至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％或至少约98％的异质肾细胞群的细胞表达rack-1，富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
52.如果一种或多种另外的标志物包括上皮细胞标志物，则上皮细胞标志物可以是cyp2r1。在此方法中，如果进一步测定富集的异质肾细胞群的细胞表达cyp2r1，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。如果一种或多种另外的标志物是或包括cyp2r1，则可以测定富集的异质肾细胞群中表达cyp2r1的细胞的百分比。如果测定了富集的异质肾细胞群中表达cyp2r1的细胞的百分比，则如果在约75％与约100％之间、或在约80％与约100％之间、或在约85％与约100％之间、或在约86％与约100％之间、或在约87％与约100％之间、或在约88％与约100％之间、或在约75％与约97％之间、或在约80％与约97％之间、或在约85％与约97％之间、或在约86％与约97％之间、或在约87％与约97％之间、或在约88％与约97％之间的异质肾细胞群的细胞表达cyp2r1，富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
53.如果一种或多种另外的标志物包括发育标志物，则发育标志物可以是cxcr4。在此方法中，如果进一步测定富集的异质肾细胞群的细胞表达cxcr4，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。如果一种或多种另外的标志物是或包括cxcr4，则可以测定富集的异质肾细胞群中表达cxcr4的细胞的百分比。如果测定了富集的异质肾细胞群中表达cxcr4的细胞的百分比，则如果大于约15％、或大于约16％、或大于约17％、或大于约18％、或大于约19％、或大于约20％、或大于约21％、或大于约22％、或大于约23％、或大于约
24％、或大于约25％的异质肾细胞群的细胞表达cxcr4，富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
54.一种或多种另外的标志物可以包括骨形态发生蛋白(bmp)4、bmp7、神经胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、同源盒蛋白hox11、眼睛缺失同源物1(eya1)、sal1和six4(six同源盒4)中的一种或多种的组合。一种或多种另外的标志物可以包括配对盒2(pax2)、具有富含glu/asp的羧基端结构域1的cbp/p300相互作用反式激活子(cited1)、成纤维细胞生长因子受体(fgfr)1、fgf7、fgf10、同源盒蛋白hox10、capsuling/edicardin/tcf21(pod1)pod1和粘蛋白1(muc1)中的一种或多种的组合。一种或多种另外的标志物可以包括透明质酸介导的运动性受体(rhamm)、补体成分c2、补体成分c3、补体成分c4、纤维蛋白原、凝血因子xiii、tek酪氨酸激酶、kdr、notch1、notch3、timp3、冯维勒布兰德(von willebrand)因子(vwf)、adam15、生长停滞特异性6(gas6)、胰岛素样生长因子结合蛋白(igfbp)1或跨膜4超家族成员4(tm4sf4)中的一种或多种的组合。一种或多种另外的标志物可以包括rhamm。
55.一种或多种另外的标志物可以包括cdk2a、白介素11(il11)、转录生长因子(tgf)β2、纤连蛋白(fn)1、含半胱氨酸丰富分泌蛋白lccl结构域2(crispld2)、胶原1型α1链(col1a1)、赖氨酰氧化酶(lox)、runt相关转录因子2(runx2)、lunatic fringe(lfng)、脑源性神经营养因子(bdnf)、密蛋白(cldn)3、尿苷磷酸化酶(upp)1、kruppel样因子(klf)14、糖基转移酶样(gyltl)1b、甘露糖苷酶α1c类成员1(man1c1)、多肽n-乙酰半乳糖胺基转移酶9(galnt9)、水通道蛋白(aqp1)、溶质载体家族47成员1(slc47a1)、wnk赖氨酸缺陷蛋白激酶(wnk)2、钙敏感受体(casr)、视黄酸诱导2(rai2)、质膜囊泡相关蛋白(plvap)、shisa家族成员(shisa)3、前列腺雄激素调节粘蛋白样蛋白1(parm1)、fgf11、叉头框e1(foxe1)、wnt家族成员(wnt)5a、wnt10a、tgfβ1和胰岛素样生长因子结合蛋白(igfbp)3中的一种或多种的组合。一种或多种另外的标志物可以包括il11、tgfβ2、crispld2、lox、lnfg、bdnf、wnt5a或igfbp3中的任意一种或多种。
56.在鉴定富集的异质肾细胞群具有治疗潜力的一些方法中，可以测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达six2、osr1、ret和足蛋白。在此类方法中，如果测定富集的异质肾细胞群的细胞表达six2、osr1、ret和足蛋白，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。测定富集的异质肾细胞群的细胞表达six2、osr、ret和足蛋白可以包括测定富集的异质肾细胞群中表达six2、osr、ret和足蛋白的细胞的百分比。
57.如果测定富集的异质肾细胞群的细胞表达six2、osr、ret和足蛋白包括测定富集的异质肾细胞群中表达six2、osr、ret和足蛋白的细胞的百分比，则该群体的细胞中表达以下的百分比：(i)six2可以大于0％且最高达至多15.0％、或大于0％且最高达至多约10.0％、或大于0％且最高达至多约9.5％、或大于0％且最高达至多约9.0％、或大于0％且最高达至多约8.5％、或大于0％且最高达至多约8.0％、或大于0％且最高达至多约7.5％、或大于0％且最高达至多约7.0％、或大于0％且最高达至多约6.5％、或大于0％且最高达至多约6.0％、或在约0.02％至约15％之间、或在约0.02％至约10.0％之间、或在约0.02％至约9.0％之间、或在约0.02％至约8.0％之间、或在约0.02％至约7.0％之间、或在约0.02％至约6.0％之间、或在约0.04％至约15％之间、或在约0.04％至约10.0％之间、或在约0.04％至约9.0％之间、或在约0.04％至约8.0％之间、或在约0.04％至约7.0％之间、或在约0.04％至约6.0％之间、或在约1.0％至约15.0％之间、或在约1.0％至约10.0％之间、或
在约1.0％至约9.0％之间、或在约1.0％至约8.0％之间、或在约1.0％至约7.0％之间、或在约1.0％至约6.0％之间；(ii)osr可以大于0％且高达至多约90％、或大于0％且最高达至多约88％、或大于0％且最高达至多约86％、或大于0％且最高达至多约84％、或大于0％且最高达至多约82％、或大于0％且最高达至多约80％、或大于0％且最高达至多约75％、或大于0％且最高达至多约70％、在约30％与约90％之间、或在约30％与约88％之间、或在约30％与约86％之间、或在约30％与约84％之间、或在约30％与约82％之间、或在约30％与约80％之间、或在34％与90％之间、或在约34％与约88％之间、或在约34％与约86％之间、或在约34％与约84％之间、或在约34％与约82％之间、或在约34％与约80％之间、或在约36％与约90％之间、或在约36％与约88％之间、或在约36％与约86％之间、或在约36％与约84％之间、或在约36％与约82％之间、或在约36％与约80％之间、或在约40％与约90％之间、或在约40％与约85％之间、或在约45％与约90％之间、或在约45％与约85％之间、或在约50％与约90％之间、或在约50％与约85％之间、或在约55％与约90％之间、或在约55％与约85％之间、或在约60％与约90％之间、或在约60％与约85％之间、或在约65％与约90％之间、或在约65％与约85％之间、或在约70％与约90％之间、或在约70％与约85％之间；(iii)ret可以大于0％且最高达至多约94％、或大于0％且最高达至多约93％、或大于0％且最高达至多约92％、或大于0％且最高达至多约91％、或大于0％且最高达至多约90％、或大于0％且最高达至多约89％、或大于0％且最高达至多约88％、或大于0％且最高达至多约87％、或大于0％且最高达至多约86％、或大于0％且最高达至多约85％、或在约45％与约95％之间、或在约45％与约94％之间、或在约45％与约93％之间、或在约45％与约92％之间、或在约45％与约91％之间、或在约45％与约90％之间、或在约45％与约89％之间、或在约45％与约88％之间、或在约47％与约95％之间、或在约47％与约94％之间、或在约47％与约93％之间、或在约47％与约92％之间、或在约47％与约91％之间、或在约47％与约90％之间、或在约47％与约89％之间、或在约47％与约88％之间、或在约49％与约95％之间、或在约49％与约94％之间、或在约49％与约93％之间、或在约49％与约92％之间、或在约49％与约91％之间、或在约49％与约90％之间、或在约49％与约89％之间、或在约49％与约88％之间、或在约20％与约60％之间、或在约20％与约55％之间、或在约20％与约50％之间、或在约20％与约45％之间、或在约20％与约40％之间、或在约25％与约60％之间、或在约25％与约55％之间、或在约25％与约50％之间、或在约25％与约45％之间、或在约25％与约40％之间；(iv)足蛋白可以是至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％或至少约98％。
58.在将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，其中测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达six2、osr1、ret和足蛋白，可以进一步测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达lhx1、fgf8、rack-1和肾病蛋白中的一种或多种。在这些方法中，如果测定富集的异质肾细胞群的细胞表达six2、osr、ret和足蛋白，并且进一步测定富集的异质群体的细胞表达lhx1、fgf8、rack-1和肾病蛋白中的一种或多种，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
59.在这些方法中，测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达six2、osr1、ret和足蛋白，并进一步测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达lhx1、fgf8、rack-1和肾病蛋白中的一种或多种，可以是测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达以下任一项：six2、osr1、
ret、足蛋白和lhx1；或six2、osr1、ret、足蛋白和fgf8；或six2、osr1、ret、足蛋白和rack-1；或six2、osr1、ret、足蛋白和肾病蛋白；或six2、osr1、ret、足蛋白、lhx1和fgf8；或six2、osr1、ret、足蛋白、lhx1和rack-1；或six2、osr1、ret、足蛋白、lhx1和肾病蛋白；或six2、osr1、ret、足蛋白、fgf8和rack-1；或six2、osr1、ret、足蛋白、fgf8和肾病蛋白；或six2、osr1、ret、足蛋白、rack-1和肾病蛋白；或six2、osr1、ret、足蛋白、lhx1、fgf8和rack-1；或six2、osr1、ret、足蛋白、lhx1、fgf8和肾病蛋白；或six2、osr1、ret、足蛋白、lhx、rack-1和肾病蛋白；或six2、osr1、ret、足蛋白、fgf8、rack-1和肾病蛋白；或six2、osr1、ret、足蛋白、lhx、fgf8、rack-1和肾病蛋白。
60.测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达six2、osr1、ret和足蛋白，以及是否进一步表达lhx1、fgf8、rack-1和肾病蛋白中的一种或多种，可以是测定表达six2、osr1、ret、足蛋白并且进一步表达lhx1、fgf8、rack-1和肾病蛋白中的一种或多种的细胞的百分比。如果测定富集的异质肾细胞群的细胞表达six2、osr、ret和足蛋白，并且进一步表达lhx1、fgf8、rack-1中的一种或多种，则该群体的细胞中表达以下的百分比：(i)six2可以大于0％且最高达至多15％、或可以大于0％且最高达至多约10.0％、或大于0％且最高达至多约9.5％、或大于0％且最高达至多约9.0％、或大于0％且最高达至多约8.5％、或大于0％且最高达至多约8.0％、或大于0％且最高达至多约7.5％、或大于0％且最高达至多约7.0％、或大于0％且最高达至多约6.5％、或大于0％且最高达至多约6.0％、或在约0.02％至约15.0％之间、或在约0.02％至约10.0％之间、或在约0.02％至约9.0％之间、或在约0.02％与约8.0％之间、或在约0.02％与约7.0％之间、或在约0.02％与约6.0％之间、或在约0.04％与约15％之间、或在约0.04％至约10.0％之间、或在约0.04％至约9.0％之间、或在约0.04％与约8.0％之间、或在约0.04％与约7.0％之间、或在约0.04％与约6.0％之间、或在约1.0％至约15.0％之间、或在约1.0％至约10.0％之间、或在约1.0％至约9.0％之间、或在约1.0％与约8.0％之间、或在约1.0％与约7.0％之间、或在约1.0％与约6.0％之间；(ii)osrl可以大于0％且最高达至多约90％、或大于0％且最高达至多约88％、或大于0％且最高达至多约86％、或大于0％且最高达至多约84％、或大于0％且最高达至多约82％、或大于0％且最高达至多约80％、或大于0％且最高达至多约75％或大于0％且最高达至多约70％、在约30％与约90％之间、或在约30％与约88％之间、或在约30％与约86％之间、或在约30％与84％之间、或在约30％与约82％之间、或在约30％与约80％之间、或在34％与90％之间、或在约34％与约88％之间、或在约34％与约86％之间、或在约34％与约84％之间、或在约34％与约82％之间、或在约34％与约80％之间、或在约36％与约90％之间、或在约36％与约88％之间、或在约36％与约86％之间、或在约36％与约84％之间、或在约36％与约82％之间、或在约36％与约80％之间、或在约40％与约90％之间、或在约40％与约85％之间、或在约45％与约90％之间、或在约45％与约85％之间、或在约50％与约90％之间、或在约50％与约85％之间、或在约55％与约90％之间、或在约55％与约85％之间、或在约60％与约90％之间、或在约60％与约85％之间、或在约65％与约90％之间、或在约65％与约85％之间、或在约70％与约90％之间、或在约70％与约85％之间；(iii)ret可以大于0％且最高达至多约94％、或大于0％且最高达至多约93％、或大于0％且最高达至多约92％、或大于0％且最高达至多约91％、或大于0％且最高达至多约90％、或大于0％且最高达至多约89％、或大于0％且最高达至多约88％、或大于0％且最高达至多约87％、或大于0％且最高达至多约
86％、或大于0％且最高达至多约85％、或在约45％与约95％之间、或在约45％与约94％之间、或在约45％与约93％之间、或在约45％与约92％之间、或在约45％与约91％之间、或在约45％与约90％之间、或在约45％与约89％之间、或在约45％与约88％之间、或在约47％与约95％之间、或在约47％与约94％之间、或在约47％与约93％之间、或在约47％与约92％之间、或在约47％与约91％之间、或在约47％与约90％之间、或在约47％与约89％之间、或在约47％与约88％之间、或在约49％与约95％之间、或在约49％与约94％之间、或在约49％与约93％之间、或在约49％与约92％之间、或在约49％与约91％之间、或在约49％与约90％之间、或在约49％与约89％之间、或在约49％与约88％之间、或在约20％与约60％之间、或在约20％与约55％之间、或在约20％与约50％之间、或在约20％与约45％之间、或在约20％与约40％之间、或在约25％与约60％之间、或在约25％与约55％之间、或在约25％与约50％之间、或在约25％与约45％之间、或在约25％与约40％之间；(iv)足蛋白可以是至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％或至少约98％；并且任选地，(v)lhxl可以是至少约5％、至少约6％、或至少约7％、或至少约8％、或至少约9％、或至少约10％、大于0％且最高达至多约80％、或大于0％且最高达至多约70％、或大于0％且最高达至多约65％、或大于0％且最高达至多约64％、或大于0％且最高达至多约63％、或大于0％且最高达至多约62％、或大于0％且最高达至多约61％、或大于0％且最高达至多约60％、或大于0％且最高达至多约59％、或大于0％且最高达至多约58％、或大于0％且最高达至多约57％、或大于0％且最高达至多约56％、或大于0％且最高达至多约55％、在约6％与约60％之间、或在约6％与约59％之间、或在约6％与约58％之间、或在约6％与约57％之间、或约6％与约56％之间、或在约6％与约55％之间、或在约6％与约54％之间、或在约8％与约60％之间、或在约8％与约59％之间、或在约8％与约58％之间、或在约8％与约57％之间、或在约8％与约56％之间、或在约8％与约55％之间、或在约8％与约54％之间、或在约10％与约60％之间、或在约10％与约59％之间、或在约10％与约58％之间、或在约10％与约57％之间、或在约10％与约56％之间、或在约10％与约55％之间、或在约10％与约54％之间、或在约16％与约80％之间、或在约16％与约70％之间、或在约16％与约60％之间、或在约16％与约58％之间、或在约16％与约56％之间、或在约16％与约54％之间、或在约16％与约52％之间、或在约16％与约50％之间、或在22％与约60％之间、或在约22％与约58％之间、或在约22％与约56％之间、或在约22％与约54％之间、或在约22％与约52％之间、或在约22％与约50％之间，并且任选地(vi)fgf8可以是至少约0.2％、至少约0.45％、或至少约0.48％、或至少约0.5％、或至少约0.55％、或至少约0.6％、或至少约0.8％、或至少约1.0％、或至少约1.5％、或至少约2.0％或为约2.5％、大于0％且最高达至多约65％、或大于0％且最高达至多约64％、或大于0％且最高达至多约63％、或大于0％且最高达至多约62％、或大于0％且最高达至多约61％、或大于0％且最高达至多约60％、或大于0％且最高达至多约59％、或至多约58％、或大于0％且最高达至多约57％、或大于0％且最高达至多约56％、或大于0％且最高达至多约55％、在约0.3％与约64％之间、或在约0.3％与约63％之间、或在约0.3％与约62％之间、或在约0.3％与约61％之间、或在约0.3％与约60％之间、或在约0.3％与约59％之间、或在约0.3％与约58％之间、或在约0.3％与约57％之间、或在约0.4％与约64％之间、或在约0.4％与约63％之间、或在约0.4％与约62％之间、或在约0.4％与约61％之间、或在约0.4％与约60％之间、或在约0.4％与约
59％之间、或在约0.4％与约58％之间、或在约0.4％与约57％之间、或在约0.5％与约64％之间、或在约0.5％与约63％之间、或在约0.5％与约62％之间、或在约0.5％与约61％之间、或在约0.5％与约60％之间、或在约0.5％与约59％之间、或在约0.5％与约58％之间、或在约0.5％与约57％之间、或在约1％与约64％之间、或在约1％与约54％之间、或在约1％与约44％之间、或在约1％与约34％之间、或在1％与约24％之间、或在约2％与约64％之间、或在约2％与约54％之间、或在约2％与约44％之间、或在约2％与约34％之间、或在2％与约24％之间、或在约3％与约64％之间、或在约3％与约54％之间、或在约3％与约44％之间、或在约3％与约34％之间、或在3％与约24％之间；并且任选地，(vii)rack-1可以是至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％或至少约98％；并且任选地，(viii)肾单位可以是至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、约4％至约95％、或在约10％与约95％之间、或在约15％与约95％之间、或在约20％与约95％之间、或在约25％与约95％之间、以及在约30％与约95％之间、或在35％与约95％之间、或在约40％与约95％之间、或在约45％与95％之间、或在约50％与约95％之间、或在约55％与约95％之间、或在约60％与约95％之间、或在约65％与约95％之间、或在70％与约95％之间、或在约75％与约95％之间、或在约80％与约95％之间、或在约85％与约95％之间。
61.在鉴定富集的异质肾细胞群具有治疗潜力的一些其他方法中，可以测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1。在此类方法中，如果测定富集的异质肾细胞群的细胞表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
62.测定富集的异质肾细胞群的细胞表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1可以包括测定富集的异质肾细胞群中表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1的细胞的百分比。如果测定包括测定富集的异质肾细胞群中表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1的细胞的百分比，则为了将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力，该细胞群的细胞中表达以下的百分比：(i)肾病蛋白可以是至少约70％、至少约72％、至少约75％、至少约77％、至少约80％、至少约82％、至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约92％、至少约95％或至少约97％；(ii)足蛋白可以是至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％或至少约98％；(iii)lhxl可以是至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、在约15％与约80％之间、在约20％与约80％之间、在约15％与约75％之间、在约15％与约70％之间、或在约20％与约80％之间。
63.在将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，其中测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1，可以进一步测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达肾发生标志物six2、osr1、ret或fgf8中的一种或多种。在这些方法中，如果测定富集的异质肾细胞群的细胞表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1，并且进一步测定富集的异质群的细胞表达six2、osr1、ret或fgf8中的一种或多种，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
64.在这些方法中，测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1，并是否进一步表达six2、osr1、ret或fgf8中的一种或多种，可以是测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达以下任意一种：肾病蛋白、足蛋白、lhx1和six2；肾病蛋白、足蛋白、lhx1和osr1、肾病蛋白、足蛋白、lhx1和ret；肾病蛋白、足蛋白、lhx1和fgf8；肾病蛋白、足蛋白、lhx1、six2和osr1；肾病蛋白、足蛋白、lhx1、six2和ret；肾病蛋白、足蛋白、lhx1、six2和fgf8；肾病蛋白、足蛋白、lhx1、osr1和ret；肾病蛋白、足蛋白、lhx1、ors1和fgf8；肾病蛋白、足蛋白、lhx1、ret和fgf8；肾病蛋白、足蛋白、lhx1、six2、osr1和ret；肾病蛋白、足蛋白、lhx1、six2、ret和fgf8；肾病蛋白、足蛋白、lhx1、osr1、ret和fgf8；肾病蛋白、足蛋白、lhx1、six2、osr1和fgf8；或肾病蛋白、足蛋白、lhx1、six2、osr1、ret和fgf8。
65.测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1，并且是否进一步表达six2、osr1、ret和fgf8中的一种或多种，可以是测定表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1并且进一步表达six2、osr1、ret和fgf8中的一种或多种的细胞的百分比。如果测定了该群体中表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1以及six2、osr1、ret和fgf8中的一种或多种的细胞百分比，则为了鉴定富集的异质肾细胞群具有治疗潜力，表达以下的细胞的百分比：(i)肾病蛋白可以是至少约70％、至少约72％、至少约75％、至少约77％、至少约80％、至少约82％、至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约92％、至少约95％或至少约97％；(ii)足蛋白可以是至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％或至少约98％；(iii)lhxl可以是至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、在约15％与约80％之间、在约20％与约80％之间、在约15％与约75％之间、在约15％与约70％之间、或约20％与约80％之间；并且任选地，(iv)six2可以大于0％且最高达至多约15.0％、或大于0％且最高达至多约13％、或大于0％且最高达至多约11％、或大于0％且最高达至多约9％、或大于0％且最高达至多约7％、或大于0％且最高达至多约5％、或大于0％且最高达至多约3％、或在约0.02％与约15％之间、或在约0.02％与约13％之间、或在约0.02％与约11％之间、或在约0.02％与约9％之间、或在约0.02％与约7％之间、或在约0.02％与约5％之间、或在约0.02％与约3％之间、或在约0.04％与约15％之间、或在约0.04％与约13％之间、或在约0.04％与约11％之间、或在约0.04％与约9％之间、或在约0.04％与约7％之间、或在约0.04％与约5％之间、或在约0.04％与约3％之间、或在约1％与约15％之间、或在约1％与约13％之间、或在约1％与约11％之间、或在约1％与约9％之间、或在约1％与约7％之间、或在约1％与约5％之间、或在约1％与约3％之间；并且任选地，(v)osrl可以大于0％且高达至多约90％、或大于0％且最高达至多约88％、或大于0％且最高达至多约86％、或大于0％且最高达至多约84％、或大于0％且最高达至多约82％、或大于0％且最高达至多约80％、或大于0％且最高达至多约75％、或大于0％且最高达至多约70％、在约30％与约90％之间、或在约30％与约88％之间、或在约30％与约86％之间、或在约30％与约84％之间、或在约30％与约82％之间、或在约30％与约80％之间、或在34％与90％之间、或在约34％与约88％之间、或在约34％与约86％之间、或在约34％与约84％之间、或在约34％与约82％之间、或在约34％与约80％之间、或在约36％与约90％之间、或在约36％与约88％之间、或在约36％与约86％之间、或在约36％与约84％之间、或在约36％与约82％之间、或在约36％与约80％之间、或在约40％与约90％
之间、或在约40％与约85％之间、或在约45％与约90％之间、或在约45％与约85％之间、或在约50％与约90％之间、或在约50％与约85％之间、或在约55％与约90％之间、或在约55％与约85％之间、或在约60％与约90％之间、或在约60％与约85％之间、或在约65％与约90％之间、或在约65％与约85％之间、或在约70％与约90％之间、或在约70％与约85％之间；并且任选地，(vi)ret可以大于0％且最高达至多约94％、或大于0％且最高达至多约93％、或大于0％且最高达至多约92％、或大于0％且最高达至多约91％、或大于0％且最高达至多约90％、或大于0％且最高达至多约89％、或大于0％且最高达至多约88％、或大于0％且最高达至多约87％、或大于0％且最高达至多约86％、或大于0％且最高达至多约85％、或在约45％与约95％之间、或在约45％与约94％之间、或在约45％与约93％之间、或在约45％与约92％之间、或在约45％与约91％之间、或在约45％与约90％之间、或在约45％与约89％之间、或在约45％与约88％之间、或在约47％与约95％之间、或在约47％与约94％之间、或在约47％与约93％之间、或在约47％与约92％之间、或在约47％与约91％之间、或在约47％与约90％之间、或在约47％与约89％之间、或在约47％与约88％之间、或在约49％与约95％之间、或在约49％与约94％之间、或在约49％与约93％之间、或在约49％与约92％之间、或在约49％与约91％之间、或在约49％与约90％之间、或在约49％与约89％之间、或在约49％与约88％之间、或在约20％与约60％之间、或在约20％与约55％之间、或在约20％与约50％之间、或在约20％与约45％之间、或在约20％与约40％之间、或在约25％与约60％之间、或在约25％与约55％之间、或在约25％与约50％之间、或在约25％与约45％之间、或在约25％与约40％之间；并且任选地，(vii)fgf8可以是至少约0.2％、至少约0.45％、或至少约0.48％、或至少约0.5％、或至少约0.55％、或至少约0.6％、或至少约0.8％、或至少约1.0％、或至少约1.5％、或至少约2.0％或为约2.5％、大于0％且最高达至多约65％、或大于0％且最高达至多约64％、或大于0％且最高达至多约63％、或大于0％且最高达至多约62％、或大于0％且最高达至多约61％、或大于0％且最高达至多约60％、或大于0％且最高达至多约59％、或至多约58％、或大于0％且最高达至多约57％、或大于0％且最高达至多约56％、或大于0％且最高达至多约55％、在约0.3％与约64％之间、或在约0.3％与约63％之间、或在约0.3％与约62％之间、或在约0.3％与约61％之间、或在约0.3％与约60％之间、或在约0.3％与约59％之间、或在约0.3％与约58％之间、或在约0.3％与约57％之间、或在约0.4％与约64％之间、或在约0.4％与约63％之间、或在约0.4％与约62％之间、或在约0.4％与约61％之间、或在约0.4％与约60％之间、或在约0.4％与约59％之间、或在约0.4％与约58％之间、或在约0.4％与约57％之间、或在约0.5％与约64％之间、或在约0.5％与约63％之间、或在约0.5％与约62％之间、或在约0.5％与约61％之间、或在约0.5％与约60％之间、或在约0.5％与约59％之间、或在约0.5％与约58％之间、或在约0.5％与约57％之间、或在约1％与约64％之间、或在约1％与约54％之间、或在约1％与约44％之间、或在约1％与约34％之间、或在1％与约24％之间、或在约2％与约64％之间、或在约2％与约54％之间、或在约2％与约44％之间、或在约2％与约34％之间、或在2％与约24％之间、或在约3％与约64％之间、或在约3％与约54％之间、或在约3％与约44％之间、或在约3％与约34％之间、或在3％与约24％之间。
66.在将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的方法中，其中测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1，可以进一步测定富集的异质肾细胞群的
细胞是否表达rack1，作为补充或替代，测定细胞是否表达肾发生标志物six2、osr1、ret或fgf8中的一种或多种。在这些方法中，如果异质性肾细胞群的细胞表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1，并且进一步表达rack-1，则富集的异质性肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
67.在这些方法中，测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达rack1可以是测定富集的异质肾细胞群中除了表达肾病蛋白、足蛋白和lhx1的细胞的百分比之外，表达rack1的细胞的百分比，以及任选地表达six1、osr1、ret和fgf8中的一种或多种的细胞的百分比。如果作为该方法的一部分测定富集的异质肾细胞群中表达rack1的细胞的百分比，则将富集的肾细胞群鉴定为具有治疗潜力的百分比可以是至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％或至少约98％。
68.在鉴定富集的异质肾细胞群具有治疗潜力的又一种方法中，可以测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达γ-谷氨酰转肽酶(ggt)-1、ck18和足蛋白。在此类方法中，如果测定富集的异质肾细胞群的细胞表达ggt-1、ck18和足蛋白，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。测定富集的异质肾细胞群的细胞表达ggt-1ck18和足蛋白可以包括测定富集的异质肾细胞群中表达ggt-1、ck18和足蛋白的细胞的百分比。如果测定富集的异质肾细胞群的细胞表达ggt-1、ck18和足蛋白，如果以下情况则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力：(i)该群体的至少4.5％或至少10％或至少18％的细胞表达ggt-1，(ii)该群体的至少80％的细胞表达ck18，和(iii)该群体的至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％或至少约98％的细胞表达足蛋白。在这些方法中，群体的细胞在细胞培养基中分泌的vegf和/或kim-1可以进一步鉴定细胞是否具有治疗潜力。
69.在鉴定富集的异质肾细胞群具有治疗潜力的一些方法中，不必测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达至少一种肾发生标志物。在这些鉴定富集的异质肾细胞群具有治疗潜力的替代方法中，可以通过测定rhamm、c2、c3、c4、纤维蛋白原、凝血因子xiii、tek、kdr、notch1、notch3、timp3、vwf、adam15、gas6、igfbp1或tm4sf4基因中的一种或多种的表达水平来鉴定细胞具有治疗潜力。在这些替代方法中，可测定其表达水平的一种或多种基因可以是rhamm。在这些替代方法中，如果所测定的富集的异质肾细胞群的细胞的一种或多种基因的表达水平相对于对照肾细胞群的细胞的一种或多种基因的表达增加，则富集的异质肾细胞群可以被鉴定为具有治疗潜力。
70.此外，在鉴定富集的异质肾细胞群具有治疗潜力的任何方法中，可以进一步对富集的异质肾细胞群进行转录或转录组特征分析。如果对富集的异质肾细胞群进行转录或转录组特征分析，如果测定富集的异质肾细胞群的细胞的补体或补体级联、血管发育、血管形态发生、脉管系统发育或对受伤的应答相关的转录途径或特征上调和/或与细胞外基质-受体相互作用相关的转录途径或特征下调，则可以将其鉴定为具有治疗潜力。
71.如本文所讨论的可用于鉴定富集的异质肾细胞群具有治疗潜力的标志物，例如six2、osr1、ret、lhx1、fgf8、肾病蛋白、足蛋白和rack-1，也可用于鉴定患者是否需要用富集的异质肾细胞群进行治疗的方法，例如需要治疗肾脏疾病、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的患者，将是对该治疗的中度至高反应者或低反应者。在此类方法中，如果患者被鉴定为中度至高反应者，则该患者可以被鉴定为对治疗的反应可能是预估肾小球滤过率(egfr)增加的患者。如果患者被鉴定为低响应者，则该患者可以被鉴定为对治疗的反应可
能是egfr斜率改善但egfr没有增加的患者。为了鉴定患者是否可能是中度至高反应者或低反应者，可以测定富集的异质肾细胞群中表达一种或多种标志物(例如，six2、osr1、ret、lhx1、fgf8、肾病蛋白、足蛋白和rack-1)的细胞百分比。例如，为了鉴定患者是中度至高反应者还是低反应者，可以测定富集的异质肾细胞群中表达lhx1的细胞的百分比。如果异质肾细胞群中表达lhx1的细胞百分比测定为至少50％，则患者可以被鉴定为中度至高反应者。如果异质肾细胞群中表达lhx1的细胞百分比测定为低于50％，则患者可以被鉴定为低反应者。作为另一个实例，为了鉴定患者是中度至高反应者还是低反应者，可以测定富集的异质肾细胞群中表达six2的细胞的百分比。如果异质肾细胞群中表达six2的细胞百分比测定为至少3.5％，则患者可以被鉴定为中度至高反应者。如果异质肾细胞群中表达six2的细胞百分比测定为小于3.5％但大于0％，则患者可以被鉴定为低反应者。可以测定lhx1和six2两者的百分比来将患者鉴定为中度至高响应者或低响应者。
72.在鉴定富集的异质肾细胞群具有治疗潜力的任何方法中，测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达一种或多种例如肾发生标志物和/或进一步的标记物(或测定一种或多种基因的表达水平)可以是测定富集的异质肾细胞群的细胞是否表达核酸(例如，mrna或mirna)或多肽形式的标志物(或者可以是测定一种或多种基因的表达水平)。标志物(或其表达或表达水平被测定的基因)可以是膜结合的或膜缔合的，其可以是细胞内的或者其可以是从细胞分泌的。富集的异质肾细胞群的细胞对一种或多种例如肾发生标志物和/或进一步的标志物的表达(或基因的表达水平)可以经由适合于检测标志物的存在(或基因的表达水品)的任何测定来测定。许多此类测定是本领域已知的。例如，如果以多肽形式测定标志物(或测定基因的表达水平和表达)，则可以通过诸如western印迹、荧光激活细胞分选(facs)、酶联免疫吸附测定(elisa)等测定来测定。如果以核酸形式测定标志物(或测定基因的表达水平和表达)，则可以通过诸如southern印迹、聚合酶链式反应(pcr)或逆转录酶pcr、基因表达的系列分析(sage)、mass array或荧光原位杂交(fish)的测定来测定。无论测定是否确定富集的异源肾细胞群的细胞是否表达肾发生和/或进一步的标志物(或测定一种或多种基因的表达水平)，测定可以包括标记的检测试剂，用于确定标志物(或表达水平已测定的基因)是否存在和/或表达标志物(或基因)的细胞的百分比。标记的检测试剂可以包括(i)与标志物(或基因的表达产物)直接或间接复合的部分和(ii)检测部分。非限制性检测部分包括放射性同位素(例如
35
s、
14
c、
125
i、3h和
131
i)、胶体金颗粒、荧光标记(例如德克萨斯红、罗丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白、藻青蛋白、spectrum orange、spectrum green1)和酶底物(例如萤火虫萤光素酶、细菌萤光素酶、萤光素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β半乳糖苷酶)。
73.可以在任何方法中鉴定为具有治疗潜力的富集的异质肾细胞群可以富集一种或多种肾细胞类型，如肾上皮细胞、肾小管细胞、肾小管上皮细胞或肾近端肾小管细胞。富集的异质肾细胞群对这些一种或多种肾细胞类型的富集可以是指与患者的肾组织、患者的肾活检、或从患者的肾组织或肾活检建立的细胞的体外培养物(其统称为“起始肾细胞群”)相比，富集的异质肾细胞群具有更大百分比的一种或多种肾细胞类型。如果从患者的肾组织或患者的肾活检建立细胞的体外培养物，则起始肾细胞群可以是包含肾组织或肾活检的解离细胞(例如，经由切碎和/或酶消化从肾组织或肾活检解离的细胞)的肾细胞制剂，可能已经或可能没有经过处理以去除红细胞和碎片。富集的异质肾细胞群的实例是如本文实施例
中所述的选定肾细胞群(src)。
74.富集的异质肾细胞群可以富集一种或多种肾细胞类型，因为其是从起始肾细胞群(例如，患者的肾组织、患者的肾活检或从患者的肾组织或肾活检建立的细胞的体外培养物)经由包括分离步骤的方法制备的。分离步骤可以是基于浮力密度分离传代不超过一次、两次或三次的起始肾细胞群的细胞的步骤。如果分离步骤是基于细胞的浮力密度来分离细胞的步骤，则分离步骤可利用单步或多步连续或不连续密度梯度，使用密度梯度介质例如甘油、葡萄糖optiprep、percoll或ficoll-paque。以这种方式使用此类密度梯度培养基可以导致起始肾细胞群(或已经传代至多一次、两次或三次的起始肾细胞群)的细胞分离成一个或多个可区分的级分，其中富集的异质肾细胞群的细胞可以清楚地鉴定和分离。可区分的级分可以是其中级分中细胞的浮力密度大于约1.045g/ml、或大于1.045g/ml、或大于或等于1.045g/ml的那些级分。可区分的级分可以是其中级分中细胞的浮力密度大于约1.04g/ml、或大于1.04g/ml、或大于或等于1.04g/ml、或大于约1.0419g/ml、或大于1.0419g/ml、或大于或等于1.0419g/ml的那些级分。可区分的级分可以是其中浮力密度在约1.045g/ml与约1.091g/ml之间、或在约1.045g/ml与约1.052g/ml之间的那些级分。替代性地，分离步骤可以是基于起始肾细胞群的细胞(或已传代不超过一次、两次或三次的起始肾细胞群的细胞)是否表达在其表面表达特定标志物来分离它们的步骤。如果分离步骤基于其特定细胞表面标志物的表达来分离细胞，则分离步骤可以是利用流式细胞术的步骤。流式细胞术可以从起始肾细胞群(或已传代至多一次、两次或三次的起始肾细胞群)中分选出细胞，如果它们表达特定的表面标志物，如肾病蛋白(其是例如肾上皮细胞、肾小管细胞、肾小管上皮细胞或肾近端肾小管细胞的特征)，从而形成分离的富集异质肾细胞群。
75.可以在分离步骤之前在低氧条件下培养已从起始肾细胞群(或已传代至多一次、两次或三次的起始肾细胞群)制备的富集的异质肾细胞群。如果在分离步骤之前在低氧条件下培养细胞，则可以在氧水平低于约20％、或低于约15％、或低于约10％、或低于约9％、或低于约8％、或低于约7％、或低于约6％、或低于约5％氧、或低于约4％氧、或低于约3％氧或低于约2％氧的条件下培养细胞。如果细胞在低氧条件下培养，则可以将细胞在低氧条件下培养至少6小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少14小时、至少16小时、至少20小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时、至少42小时或至少48小时。
76.一般而言，富集的异质肾细胞群的制备物可以来自任何起始细胞群，例如，从患者的肾组织或患者的肾活检建立的细胞的体外培养物。如果富集的异质肾细胞群是由从患者的肾组织或肾活检建立的细胞的体外培养物制备的，则体外培养物的细胞可以通过传代至多一次、或至多两次或至少三次来扩增。替代性地，如果需要，可以冷冻保存从肾组织或肾活检建立的细胞的体外培养物的细胞，然后通过传代至多一次、或至多两次或至多三次来扩增。一旦细胞被扩增，扩增的细胞就可以被冷冻保存。然后，无论是否冷冻保存，扩增的细胞都可以经历分离步骤，或者可以经历低氧培养条件，随后进行分离步骤。通过进行分离步骤可分离富集的异质肾细胞群。一旦分离出富集的肾细胞群，就可以在用作治疗剂之前将其冷冻和/或分析。
77.此外，在从起始肾细胞群制备富集的异质肾细胞群时，可以生成一种或多种对照肾细胞群。对照肾细胞群可以是在分离步骤之前在富集的异质肾细胞群的制备中使起始肾细胞群经历一个或多个步骤或条件而生成的任何肾细胞群。对照肾细胞群可以是在对起始
肾细胞群进行扩增步骤之后从起始肾细胞群生成的肾细胞群，例如通过在扩增步骤之前将起始肾细胞群传代至多一次、两次或三次。替代性地，对照肾细胞群可以是在分离步骤之前、在低氧条件下培养起始肾细胞群之后由起始肾细胞群生成的肾细胞群。在另一个实例中，对照肾细胞群可以是在进行分离步骤之前，由于起始肾细胞群已经传代至多一次、两次或三次并且在缺氧条件下培养而从起始肾细胞群生成的肾细胞群。在又一个实例中，对照肾细胞群可以是在进行分离步骤之前，由于起始肾细胞群已经通过传代至多一次、两次或三次扩增和/或已经在缺氧条件下培养和/或已经冷冻保存而从起始肾细胞群生成的肾细胞群。对照肾细胞群可以是从已经经历了为进行分离步骤做准备的全套步骤或条件，但尚未经历分离步骤的起始肾细胞群生成的肾细胞群。
78.此类对照肾细胞群可用于本文提供的方法中，其中如果富集的肾细胞群的细胞的一种或多种基因(例如，rhamm、c2、c3、c4、纤维蛋白原、凝血因子xiii、tek、kdr、notch1、notch3、timp3、vwf、adam15、gas6、igfbp1或tm4sf4)的表达水平相对于对照肾细胞群的细胞的一种或多种基因的表达水平增加，则富集的异质肾细胞群体可以被鉴定为具有治疗潜力。一种或多种基因的表达水平的增加可以是至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的增加。在此类方法中，一种或多种基因可以是或可以包括rhamm，并且富集的异质肾细胞群中的rhamm表达水平相对于对照群的增加可以是至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的增加。在此类方法中，表达水平的增加可以是表达一种或多种基因的细胞百分比的增加，或者可以是一种或多种基因的表达总量(根据细胞数量调整)的增加。
79.如果根据本文公开的任何方法将富集的异质肾细胞群鉴定为具有治疗潜力，则其可以包含在药物组合物中，或在治疗有此需要的患者的肾脏疾病的方法中施用，和/或用于制备治疗肾脏疾病的药物。如果富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗潜力并且被包含在药物组合物中，则其可以配制为水凝胶组合物或液体组合物。其可以包含或可以不包含透明质酸。
80.如果药物组合物被配制为水凝胶组合物，则富集的异质肾细胞组合物的细胞可以与温度敏感的细胞稳定生物材料组合，该生物材料在约8℃或以下维持凝胶状态，在约环境温度或以上维持基本上液态，并且在约8℃与约环境温度或以上之间处于固-液过渡状态。水凝胶组合物中包含的温度敏感细胞稳定生物材料可以是重组来源的细胞外基质蛋白、源自肾脏或另一组织或器官的细胞外基质、或明胶中的一种或多种。如果温度敏感细胞稳定生物材料包括明胶，则明胶可以衍生自i型αi胶原，如猪i型αi胶原或重组人i型αi胶原。如果温度敏感性细胞稳定生物材料包含明胶，则明胶可以约0.5％(w/v)至约1％(w/v)或约0.8％(w/v)至约0.9％(w/v)或约0.88％(w/v)存在于药物组合物中。富集的异质肾细胞群的细胞可以分散在整个生物材料中，或者基本上均匀地分布在整个生物材料中。
81.如果药物组合物被配制为液体组合物，则富集的异质肾细胞群可以与任何合适的液体(例如，适当的细胞储存或培养基、盐水或其组合)组合用于立即使用或冷冻储存直至
使用。
82.如果富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗潜力，则可以在治疗肾脏疾病的方法中向患者施用富集的异质肾细胞群或包含富集的异质肾细胞群的药物组合物。如果富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗潜力，则富集的异质肾细胞群或包含富集的异质肾细胞群的药物组合物可用于制备治疗肾脏疾病的药物。肾脏疾病可以处于急性或慢性肾衰竭的任何阶段或程度。其可能起源于肾脏，也可能继发于另一种疾病，例如心力衰竭、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病或肝脏疾病。替代性地，肾脏疾病可以是由肾脏急性损伤引起的肾脏疾病，或者是肾脏和/或泌尿道异常的结果。肾脏疾病可以进一步包括内分泌功能障碍，如贫血，例如促红细胞生成素缺乏，以及矿物质失衡，例如维生素d缺乏。
83.如果富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗潜力，则施用富集的异质肾细胞群或包含富集的异质肾细胞群的药物组合物可以治疗肾脏疾病。其可以通过恢复肾功能、稳定肾功能、改善肾功能、减少肾纤维化、减少肾炎症、诱导需要此类治疗的患者的肾脏来治疗肾脏疾病。治疗肾脏疾病可能在需要此类治疗的患者中恢复矿物质平衡或减轻贫血。治疗肾脏疾病可以在需要治疗肾脏疾病的患者中延迟或防止透析的需要，或者可以延迟或防止进行肾脏移植的需要。如果治疗肾脏疾病延迟了患者对透析的需要或对肾移植的需要，则该延迟可以是至少1年、至少1.5年、至少2年、至少2.5年、至少3年、至少3.5年、至少4年、至少4.5年、至少5年、至少5.5年、至少6年、至少6.5年、至少7年、至少7.5年、至少8年、至少8.5年、至少9年、至少9.5年或至少10年。治疗肾脏疾病可以通过观察患者的血清白蛋白、白蛋白与球蛋白比率(a/g比率)、血清磷、血清钠、肾脏大小(可通过超声测量)、血清钙、磷:钙比率、血清钾、蛋白尿、尿肌酐、血清肌酐、血氮尿素(bun)、胆固醇水平、甘油三酯水平和肾小球滤过率(gfr)、体重、血压(平均全身血压、舒张压或收缩压)和身体耐力表现的改善来确定。
84.如果富集的异质肾细胞群被鉴定为具有治疗潜力，则可以通过本领域已知的任何合适的施用途径将其施用至患者。例如，富集的异质肾细胞群或包含富集的异质肾细胞群的药物组合物可以全身施用至需要肾脏疾病治疗的患者。富集的异质肾细胞群或包含富集的异质肾细胞群的药物组合物可以施用至需要肾脏疾病治疗的患者的肾脏处或肾脏内。如果将富集的异质肾细胞群施用至需要肾脏疾病治疗的患者的肾脏处或肾脏内，则其可以通过单次或多次注射来施用。其可以经由直接剖腹手术、经由直接腹腔镜检查、经腹或经皮施用。富集的异质肾细胞群或包含富集的异质肾细胞群的药物组合物可以通过经皮注射到肾脏的肾皮质中施用，或者可以通过经皮插入引导套管以刺穿肾包膜然后将富集的异质肾细胞群注射到肾脏内来施用。
85.通过任何合适的途径以治疗有效剂量施用富集的异质肾细胞群或包含富集的异质肾细胞群的药物组合物。用于施用至需要肾脏疾病治疗的患者的治疗有效剂量或量可以包括每克估计的患者肾脏重量约1-9x106个富集的异质肾细胞群细胞。药物组合物的治疗有效量可以是每克估计的患者肾脏重量约富集的异质肾细胞群1x106个细胞、1x106个细胞、约2x106个细胞、2x106个细胞、约3x106个细胞、3x106个细胞、约4x106个细胞、4x106个细胞、4x106个细胞、约5x106个细胞、或5x106个细胞的剂量。
86.本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文所述的具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在由所附权利要求所涵盖。
87.本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本说明书，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地且单独地表明通过引用整体并入本文。
实施例
88.实施例1：富集异质肾细胞群的制备
89.溶液。在一种制备富集的异质肾细胞群的方法中，使用表1中提供的试剂从肾组织或活检样品制备富集的异质肾细胞群。
90.表1：培养基和溶液
[0091][0092][0093]
dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs)适用于所有细胞洗涤。
[0094]
从肾脏样品中分离细胞。在该方法中，经由肾活检获得的肾组织用作制备未富集的肾细胞的源材料。一般而言，制备中使用的肾组织可以由皮质组织、皮质髓质连接组织或髓质组织中的一种或多种组成。优选皮质髓质连接组织。可能需要来自ckd肾脏的多个活检
核心(至少2个)以避免疤痕组织。肾组织由临床医生从患者身上获取。如有必要，组织可以在组织运输介质中运输。
[0095]
在处理组织进行细胞提取之前，用组织洗涤溶液洗涤组织，以减少进入的生物负载。
[0096]
将肾组织切碎并在消化溶液中解离。将所得细胞悬浮液中和、洗涤并重悬于dulbecco’s modified eagle培养基(d-mem)+10％胎牛血清(fbs)(invitrogen,carlsbad calif.)中，洗涤并重悬于肾细胞生长培养基(rcgm)中。在rcgm中开始在经组织培养处理的聚苯乙烯烧瓶或培养皿上进行培养。例如，将一份活检样品铺在装有8ml rcgm的t25 nunc烧瓶中。
[0097]
未富集的异质肾培养物的扩增。肾细胞扩增取决于接收的组织量以及从传入组织中分离肾细胞的成功与否。如果需要，可以冷冻保存分离的细胞。由于从个体患者分离的细胞固有的可变性，肾细胞生长动力学可能因样品而异。
[0098]
已开发出明确的细胞扩增工艺，并且该工艺适应由于传入组织的可变性而产生的细胞回收范围。表2.肾细胞的扩增涉及使用规定的细胞培养程序在肾细胞生长培养基中的封闭培养容器(例如，t型烧瓶、细胞工厂、)中进行连续传代。
[0099]
表2：人体活检肾细胞产量
[0100][0101]
一旦在最初的t型烧瓶(第0代)中观察到细胞生长并且没有可见的污染迹象，则随后每2-4天更换培养基。通过在显微镜下目视观察培养物来评估细胞以验证肾细胞形态。由于细胞聚集在一起，培养物典型地表现出紧密的路面或鹅卵石外观。这些形态特征在扩增过程中可能会发生变化，并且可能不会在每次传代中都出现。使用整个细胞扩增过程中使用的培养容器中不同汇合水平的细胞图像库来估计细胞培养汇合度。
[0102]
当培养容器至少50％汇合时，通过胰蛋白酶消化对肾细胞进行传代。将分离的细胞收集到含有肾细胞生长培养基的容器中，进行计数并计算细胞活力。在每次细胞传代时，将细胞以500-4000个细胞/cm2接种到足够数量的培养容器中，以将细胞数量扩大至治疗配制或评估所需的细胞数量。培养容器置于5％co2环境的37℃培养箱中。如上所述，监测细胞形态和汇合度，并且每2-4天更换一次组织培养基。表3列出了在来自人供体的肾活检的细胞分离和扩增过程中观察到的人肾细胞的活力。
[0103]
表3：培养物中人肾细胞的细胞活力
[0104]
传代细胞活力(平均％)范围(％)p0(n＝82)89.268.7
–
99.1p1(n＝82)96.489.3
–
99.1p2(n＝82)97.491.9
–
100p3(n＝91)94.778.1
–
100
[0105]
不同患者的组织固有的变异性可能导致培养物中细胞产量的不同。因此，严格定
义细胞传代的时间或每次传代所需的培养容器的数量和类型以达到靶标细胞数量是不切实际的。通常肾细胞会经历2或3次传代；然而，培养持续时间和细胞产量可能会根据细胞生长速率而变化。
[0106]
使用tryple(invitrogen)分离细胞以进行收获或传代。经由台盼蓝排除法评估活力，并使用血细胞计数器或使用自动计数系统(nexcelom bioscience，lawrence mass.)或使用nc-200nucleocounter的ao/dapi手动进行计数。
[0107]
培养细胞的冷冻保存。可以冷冻保存扩增的肾细胞，以适应个体患者细胞生长的固有变异性，并在需要时按照预先确定的临床时间表递送治疗剂，例如富集的异质肾细胞群。如果需要治疗剂量/额外的治疗剂量(例如，由于患者生病、不可预见的过程事件等而延迟的情况下需要额外的剂量)，冷冻保存的细胞还可以提供备用细胞来源。已经建立了用于冷冻保存细胞并在解冻后恢复存活的功能性细胞的条件。
[0108]
如果冷冻保存扩增的肾细胞，则将细胞悬浮在冷冻保存溶液中至终浓度约50x106个细胞/ml，并分配到小瓶中。将含有约50x106个细胞/ml的1ml小瓶置于受控速率冷冻机的冷冻室中并以预编程速率冷冻。冷冻后，将细胞转移至液氮冷冻机中进行过程中储存。
[0109]
富集的异质肾细胞群的制备。富集的异质肾细胞群可以从冷冻保存的细胞生长的最终培养容器中制备或直接从扩增培养物中制备。
[0110]
对于冷冻保存的细胞，将细胞解冻并铺在组织培养容器上进行最后的扩增步骤。当最终的培养容器大约50％-100％汇合时，细胞就准备好进行富集异质肾细胞分离的处理。nka的培养基交换和最终洗涤稀释了最终产品中任何残留的冷冻保存溶液。
[0111]
一旦最终的细胞培养容器达到至少50％汇合，将培养容器转移至低氧培养箱中，在37℃、5％co2环境中设置2％氧气，并培养过夜。细胞可在氧气浓度设置为2％的控氧培养箱中保存少于24小时或过夜。暴露于生理上更相关的低氧(2％)环境提高了细胞分离效率，并能够更好地检测缺氧诱导的标志物如vegf。
[0112]
将细胞暴露于低氧条件足够时间(过夜至48小时)后，用tryple(invitrogen)分离细胞。经由台盼蓝排除法评估活力，并使用血细胞计数器或使用自动计数系统(nexcelom bioscience，lawrence mass.)或使用nc-200nucleocounter的ao/dapi手动进行计数。用optimem洗涤细胞一次并在dpbs中重悬至约850x106个细胞/ml。
[0113]
跨密度边界/界面的离心用于根据细胞浮力密度分离收获的肾细胞群。通过在optimem中的7％碘克沙醇溶液(optiprep；60％(w/v))上离心分离肾细胞悬浮液。
[0114]
制备7％optiprep密度界面溶液，并在使用前测量指示期望密度的折射率(r.i.1.3456+/-0.0004)。收获的肾细胞分层在溶液顶部。密度界面在室温下(无制动)在离心管或细胞处理器(例如，cobe 2991)中以800x g离心20分钟。离心后收集表现出大于约1.045g/ml的浮力密度的细胞级分作为明显的沉淀。排除并丢弃保持浮力密度小于1.045g/ml的细胞。
[0115]
将富集的异质肾细胞群沉淀重悬于dpbs中。通过4次dpbs清洗步骤，可最大程度地减少最终产品中剩余optiprep、fbs、培养基和辅助材料的残留。
[0116]
实施例2：富集异质肾细胞群的肾发生标志物表达的鉴定和测定表明其治疗潜力
[0117]
引言。复杂组织和器官(包括肾脏)的再生可能会利用发育和器官发生中常见的机制要素。通常与胚胎肾发生期间最早的信号传导事件相关的多个标志物的表达将表明富集
的异质肾细胞群，例如经由实施例1中描述的方法制备的，已去分化并获得了更多的肾祖细胞样特性。将具有这些特征的富集异质肾细胞群引入患病肾实质中可以触发通常介导肾发生的关键信号传导级联的发生，但其(在成人肾实质的背景下)可以解释为再生。
[0118]
方法。通过facs分析测试例如如实施例1中所述制备的富集的异质肾细胞群的肾发生标志物的表达。用于检测细胞的肾发生标志物表达的抗体在表4中鉴定。
[0119]
表4：可用于facs分析以检测肾细胞群表达的发育标志物的抗体
[0120]
抗原抗体缀合物目录#供应商pax2兔单克隆无ep3251/ab79389abcamfoxd1兔，多克隆，n端无ab179940abcamsix2单克隆six1,h4pesc377193-pescbtosr1单克隆igga,c8pesc376545-pescbtbmp7兔多克隆，全长无ab27569abcambim兔单克隆，hy36alexafluor488ab200667abcamlim1兔多克隆无nb110-12933novus biosal1单克隆igg2a无ab41974abcamgdnf兔单克隆无ab176564abcamret兔单克隆alexafluor488ab237105abcamwnt9b兔多克隆无nbp1-44348novus biobmp4兔单克隆alexafluor488ab200794abcamwt1兔单克隆无ab89901abcamwnt4兔多克隆无ab91226abcampax8单克隆igg1无ab53490abcamfgf8单克隆，全蛋白无ab89550abcamlhx1单克隆igg2apesc-515631pescbtnotch1兔多克隆无ab118824abcammuc1兔单克隆无ab109185abcam
[0121]
用于facs的细胞制备。为了进行facs分析，通过胰蛋白酶消化收获富集的异质肾细胞群的细胞并在400g下离心10分钟以形成细胞沉淀。将细胞沉淀用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次，并重悬于含皂苷的4％多聚甲醛溶液中，以在需要检测细胞内抗原时进行细胞透化，以进行固定。固定后，将细胞沉淀并用1x洗涤缓冲液(becton dickenson，专有组合物)洗涤两次，并重悬于100μl至200μl洗涤缓冲液中。
[0122]
facs染色和分析。如表4所示，通过添加2μg一抗(直接标记或未标记)进行facs染色，在4℃下染色20分钟。将细胞与抗体孵育后，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次。如果需要，例如如果一抗未标记，则用带有可检测荧光团(如alexafluor 488)的适当二抗进一步对细胞进行免疫标记。为了在facs分析期间允许适当的通道门控，与主要染色反应平行地设置适当的同种型对照和二抗对照。
[0123]
所有细胞群再次用洗涤缓冲液洗涤并重悬于200μl pbs中。在macsquant分析仪上对免疫染色富集的异质肾细胞群进行分析。
[0124]
结果。在总共18个临床富集的异质肾细胞群样品中，观察到5种肾发生标志物的特
定表达水平。参见表5和表6。
[0125]
表5：具有治疗潜力的富集异质肾细胞群中肾发生标志物的表达
[0126]
样品six2osr1lhx1retfgf8nka-013043.7713.642.490nka-031078.6621.4810.150nka-0564.3665.193.8414.250.49nka-0480.1271.5311.669.340.25nka-0280.1872.7713.9218.80.63nka-039084.495.656.491nka-0300.1896.2825.1419.11.39nka-0230.5894.3731.7810.860.54nka-0320.9996.7238.332.070.23nka-0704.0897.1942.581.331.08nka-0878.1198.2990.791.980.31nka-0891.791.9531.461.291.15nka-0420.2452.820.871.420.01nka-0340.9857.232.531.262.65nka-0923.1174.953.970.580.11nka-0630.3267.28.681.450.16nka-0970.0669.296.431.090.08nka-0751.1281.86.6311.370.52
[0127]
表6：具有治疗潜力的富集的异质肾细胞群中表达肾发生标志物的细胞百分比范围的总结
[0128]
标志物低(细胞％)高(细胞％)six20.046osr136.384.43lhx18.557.1ret49.189.4fgf80.4858.55
[0129]
还发现具有治疗潜力的富集的异质肾细胞群中约4.34至98.72百分比的细胞表达肾病蛋白。
[0130]
对临床富集的异质肾细胞群样品进行进一步分析，再次测定5种肾发生标志物的表达水平。除了5种肾发生标志物之外，还测定了肾病蛋白和足蛋白(可能对肾发生过程中肾小球发育重要)和rack-1的特定水平。参见图1b。
[0131]
肾脏的再生可能需要利用发育和器官发生中常见的机制要素。通常与胚胎肾发生中最早的信号传导事件相关的标志物的表达将表明富集的异质肾细胞群，例如如实施例1所述制备的，已去分化并获得了更多的肾祖细胞样特性。因此，将此种富集的异质肾细胞群引入患病肾脏可以触发通常介导肾发生的关键信号传导级联的发生，但(在成人实质的背景下)可以解释为再生。肾发生标志物six2、osr1、lhx1、ret和fgf8的表达可以解释富集的
异质肾细胞群如何能够提供治疗益处的机制，例如经由对患病肾脏的再生作用。例如按照实施例1中描述的方法制备的富集的异质肾细胞群已证明在需要肾脏疾病治疗的患者中具有治疗效果，如延迟透析、降低白蛋白与肌酸酐的比率和增加egfr。以下简要描述了每种肾发生标志物及其在肾发生中的作用。
[0132]
six2是脊椎动物基因家族的成员，其编码与果蝇“sine oculis”同源盒蛋白同源的蛋白。six2蛋白是一种转录因子，在肾脏、颅骨和胃等多个器官的发育中发挥重要作用。在肾脏发育过程中，six2通过对抗输尿管芽发出的诱导信号，维持帽间充质多能肾单位祖细胞处于未分化状态，并与wnt9b合作促进更新祖细胞增殖。six2可能通过其与tcf7l2和osr1的相互作用发挥作用，以典型的wnt信号传导独立方式阻止帽间充质中分化基因(如wnt4)的转录。此外，其独立于osr1发挥作用，激活许多帽间充质基因(包括其本身、gdnf和osr1)的表达。
[0133]
osr1是中间中胚层(其将形成性腺和肾脏)的最早标志物。这种表达对于中间中胚层的形成不是必需的，而对于向肾和性腺结构的分化至关重要。osr1作用于参与早期泌尿生殖发育的转录因子lhx1、pax2和wt1的上游并引起其表达。在正常肾脏发育中，pax2-eya1-hox11复合物的激活以及随后six2和gdnf表达的激活允许输尿管芽的分支和肾单位形成帽间充质的维持。six2经由gdnf-ret信号传导通路维持帽间质和gdnf的自我更新状态，是吸引和分支正在生长的输尿管芽所必需的。在发育中的肾脏中，表达osr1的细胞将变成系膜细胞、周细胞、输尿管平滑肌和肾被膜。表达osr1的细胞将分化成的细胞类型由表达丧失的时间决定-将成为脉管系统或输尿管上皮一部分的细胞会早期(e8.5)失去osr1的表达，而那些成为肾单位的细胞会稍后(e11.5)失去表达。缺乏osr1表达的小鼠的肾脏形成的所有三个阶段都受到影响，并且与wt1和pax2表达减少的小鼠相似-wollfian管异常、中肾小管较少、并且形成肾脏的后肾和性腺缺失。在胚胎第10.5天，缺乏osr1表达的胚胎无法长出输尿管芽，而输尿管芽会迁移到未压实的后肾间质中。输尿管芽诱导信号的缺乏与下游pax2表达的减少组合导致肾细胞凋亡和发育不全。
[0134]
lhx1是一种转录因子。在脊椎动物胚胎中，肾脏衍生自中间中胚层。lim类同源盒转录因子lhx1在中间中胚层早期表达，是肾间质中最早表达的基因之一。非洲爪蟾胚胎中lhx1的缺失会导致肾区几乎完全丧失。
[0135]
除其他外，ret对于正常的肾脏发育和精子的产生(精子发生)是必需的。ret蛋白跨越细胞膜，因此该蛋白的一端保留在细胞内，另一端从细胞外表面突出。这种蛋白质的定位使其能够与细胞外的特定因子相互作用，并接收帮助细胞对其环境做出反应的信号。当刺激生长和发育的分子(生长因子)附着在ret蛋白上时，就会触发细胞内一系列复杂的化学反应。这些反应指示细胞经历某些变化，如分裂或成熟以承担特殊功能。
[0136]
fgf8基因编码成纤维细胞生长因子8(fgf8)。这种蛋白质是称为成纤维细胞生长因子的蛋白质家族的一部分，该蛋白质家族参与许多过程，包括细胞分裂、细胞生长和成熟的调节以及出生前的发育。fgf8附着(结合)到细胞表面的另一种称为成纤维细胞生长因子受体1(fgfr1)的蛋白质，从而触发细胞内的一系列化学反应。
[0137]
已鉴定出一组由具有治疗潜力的富集的异质肾细胞群表达的肾发生标志物。这些标志物的表达提供了证据，表明富集的异质肾细胞群的细胞具有影响介导肾发生或肾脏再生的信号传导级联的能力，从而提供治疗效果。值得注意的是，标志物的表达存在一些差
异，这是由于细胞的自体来源而可预期的。
[0138]
实施例3：鉴定对富集的异质肾细胞群的治疗生物活性具有机制意义的转录调节。
[0139]
引言：为了进一步了解富集的异质肾细胞群的修复、恢复和/或再生活性的潜在机制，对其中包括的肾细胞亚群进行全基因组转录组分析。通过preg(预梯度分级)材料的密度梯度分离制备的四种组分富集的肾细胞亚群(b2、b3、b4和b5)包含在富集的异质肾细胞群中。在本实施例中，分别分析、比较和对照啮齿动物preg材料和构成啮齿动物富集的异质肾细胞群的四种组分富集的肾细胞亚群(b2、b3、b4和b5)的转录组谱。通过分别分析四种组分富集的肾细胞亚群(b2、b3、b4和b5)中的每一种，并将它们的转录组谱与preg材料的转录组谱进行比较，可以了解每种组分对富集异质肾细胞群观察到的修复、恢复和再生生物活性的贡献。
[0140]
材料和方法/肾细胞群的制备：来自3个独立供体(5周龄、雄性、同基因lewis实验室大鼠)的肾脏用作本分析中表征的所有肾细胞群和亚群的3个独立生物复制的起始材料。已详细描述了从整个大鼠肾脏中制备选定的生物活性原代肾细胞(a.t.,guthrie,k.i.,kelley,r.methods mol biol 1001,53,2013；kelley,r.,et al.american journal of physiology&renal physiology 299,1026,2010；kelley,r.,et al.cell transplantation 22,1023,2013)。简言之，从5周龄雄性lewis大鼠(hilltop labs，scottsdale，pa，usa)收获整个肾脏，并在含有4.0单位/ml分散酶(stem cell technologies,inc.,vancouver,bc,加拿大)和300单位/ml胶原酶iv(worthington biochemical,lakewood,nj,usa)的缓冲液中酶解肾组织。通过15％碘克沙醇(axis shield,norton,ma,usa)离心去除红细胞和碎片。将原代肾细胞接种到组织培养处理的聚苯乙烯板(nunc,rochester,ny,usa)上，并在含有5％胎牛血清(fbs)、2.5μg egf、25mg牛垂体提取物(bpe)、1x its(胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠培养基补充剂)和抗生素/抗真菌剂(均来自invitrogen,carlsbad,ca,usa)的50:50培养基(即高葡萄糖dulbecco’s modified eagle培养基(dmem):角化细胞无血清培养基(ksfm)的的1:1混合物)中培养。在培养后细胞分离之前，将原代肾细胞培养物从大气氧条件(21％)转移至更生理相关的低氧(2％)环境24小时，以提高细胞分离效率。在2ml未补充的ksfm(uksfm)中制备为75x106个细胞的原代肾细胞培养物的分离，通过专门针对啮齿类动物的四步碘克沙醇(optiprep；uksfm中的60％w/v)密度梯度离心(16％、13％、11％和7％)于15ml锥形聚丙烯管中进行分离，并在室温下以800xg离心20分钟(无制动)。离心后，经由移液器从梯度中提取细胞亚级分，并收集为4个不同的条带(b1-b4)和沉淀(b5)。所有条带在使用前用无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤3次。从每只啮齿动物收集梯度前样品(“preg”)和全肾组织样品(“macro”)用于比较目的。用于每种啮齿动物细胞群的培养条件总结于下表7中。
[0141]
表7：培养条件和梯度负载1[0142]
[0143]1梯度负载是指加载到碘克沙醇梯度上的preg细胞的数量，用于分离成富集的异质肾细胞(例如，src)群中包含的组分富集的肾细胞群。
[0144]
材料和方法/转录本分析：用于全基因组转录本分析的rna是根据制造商的说明使用qiagen的rna分离试剂盒制备的。将来自每个样品的2μgrna按照下表8归一化，用于在affymetrix genechip大鼠基因组230 2.0阵列(韦克森林大学健康科学微阵列核心设施(wake forest university health sciences microarray core facility)，winston-salem,nc)上进行全基因组转录本分析。
[0145]
表8：rna浓度和归一化
[0146][0147]
通过在总体积20μl中重悬总共2μg rna来对rna进行归一化。在表2中，“vol,2μg”列列出了代表总共2μg rna的rna制备物的体积。“norm20μl”列列出了要添加的额外缓冲液的体积，以构成20μl的最终体积。
[0148]
材料和方法/数据分析：affymetrix genechip数据使用rma进行归一化(rafael et al.,2003.nucleic acids research 31:e15)。使用配对t检验将每个组分富集的肾细胞亚群(b1、b2、b3、b4、b5)的基因表达谱与preg材料中的基因表达谱进行比较。通过配对t检验检测p《0.05的差异表达基因，然后通过david(http://david.abcc.ncifcrf.gov)进行分析，检测基因本体论(go)类别和京都基因与基因组百科全书(kegg)在每个级分和preg之间显著不同的通路。对于go分析使用了go-bp-fat，这是david提供的go生物过程类别，以最大限度地减少冗余并增加go条目的特异性。bonferroni调整应用于go和kegg通路分析生成的p值，以进行多重测试校正。kegg通路图是使用bioconductor中的pathview(weijun luo and cory brouwer.bioinformatics,29(14):1830-1831,2013)生成的。go类别的基因网络
是使用qiagen的ingenuity pathway analysis(qiagen redwood city,www.qiagen.com/ingenuity)生成的。
[0149]
结果/亚级分b1：相对于preg材料，b1亚群的go分析显示，与细胞周期(p＝9.40e-04)、细胞分裂(p＝9.81e-05)和细胞周期阶段(p＝0.016)调节相关的go类别显著下调(表9)。kegg通路分析也产生了类似的结果(表9)。下调的周期通路基因分布在细胞周期的各个阶段，包括细胞生长(g1、g2)、dna复制(s)和有丝分裂(m)。例如，相对于preg，b1中受到负调节的关键细胞周期调节蛋白包括cdk2、cdk7、cyce、cdc45、orc、chk1、chk2、mad2、cdc20和apc。此外，与转录调控相关的go/kegg类别，包括转录调控(p＝0.001)、rna代谢过程调控(p＝0.044)和剪接体(p＝0.002)均显著下调(表9)。
[0150]
表9：与preg相比b1中显著上调或下调的go类别和kegg通路。
[0151][0152][0153]
这些转录组数据表明，b1亚群的增殖和再生潜力明显较低，这与在ckd啮齿动物模型中观察到的b1细胞对肾脏病理生理学没有功能影响一致(bruce,a.t.,guthrie,k.i.,kelley,r.methods mol biol 1001,53,2013；kelley,r.,et al.american journal of physiology&renal physiology 299,1026,2010；kelley,r.,et al.cell transplantation 22,1023,2013)。
[0154]
相对于preg材料，b1亚群中显著上调的go/kegg类别包括参与免疫反应的细胞因子介导的信号传导通路(p＝0.023)和参与外来物质和细胞废物的消化的溶酶体(p＝4.44e-04)。细胞黏附(p＝0.045)也得到上调(表9)。这些数据再次与在ckd啮齿动物模型中观察到的b1细胞对肾脏病理生理学没有功能影响的情况一致。b1富集的肾细胞亚群不是富集的异质肾细胞群的组分。
[0155]
结果/亚级分b2：发现b2的转录组谱在通路水平上与preg相似。没有go/kegg类别被鉴定为显著上调。仅发现一种通路，即ecm-受体相互作用(rno04512)相对于preg材料显著下调(p＝0.039)。与ecm-受体相互作用下调一致，许多ecm蛋白，包括胶原蛋白、层粘连蛋白、络丝蛋白、腱生蛋白、玻连蛋白和血小板反应蛋白(thbs)，在b2中显著下调；众所周知，细胞外基质(ecm)组分的过度沉积会导致组织纤维化(liu y.kidney international 69,213,2006；kisseleva and brenner,2008.proc am thorac soc 5:338-42；el-nahas,
2003.kidney int 64:1553-63)。此外，肾纤维化是从慢性肾病(cdk)到终末期肾病的疾病进展的标志。
[0156]
与ecm相关基因观察到的负调控转录组谱相反，透明质酸介导的运动受体(rhamm；也称为cd168或透明质酸介导的运动受体(hmmr))表达在b2亚群中相对于preg材料特异性上调(倍数变化＝1.114，p＝0.030)。在许多体外和体内模型系统中，rhamm的表达与再生生物活性直接相关。例如，rhamm还被证明可以促进血管生成、3d唾液腺球体再生以及非洲爪蟾(xenopus)蝌蚪尾部和细胞运动中的每种。因此，rhamm表达水平的增加可能有利于组织再生(pradhan-bhatt et al.,2014.laryngoscope 124:456-461；contreras et al.,2009.development 136:2987-96；tolg et al.,2006.j cell biol 175:1017-28；savani rc,et al.2001.j.biol.chem.276(39):36770
–
8；hall cl,et al.1994..j.cell biol.126(2):575
–
88；hamilton sr,et al.2007.j.biol.chem.282(22):16667
–
80)。此外，透明质酸(ha)(rhamm是其受体)是显示出以下的ecm组分：存在于发育中肾脏的整个间质空间中(bakala,h.,et al.,1988.j morphol 196:1-14)；刺激输尿管芽分化为集合管；以及后肾间充质以与分子量无关的方式从间充质到上皮的转变。rhamm在b2亚群中显著上调，这些数据为肾组织工程和细胞医学带来了有趣的可能性。举例而言，设计用于以一定浓度释放确定分子量的ha的支架可以植入肾脏内，以期调节再生结果。
[0157]
结果/亚级分b3：kegg通路分析发现，相对于preg材料，b3亚群中与补体和凝血级联相关的类别显著上调(p＝0.008)(表10)。上调的基因包括补体成分基因，如c2、c3和c4，以及凝血相关基因，如纤维蛋白原(fg)和凝血因子xiii(f13)。补体和凝血系统被认为是抵御损伤和入侵者的“第一道防线”(choi g,et al.swiss med wkly.2006；136:139
–
144)。因此，该通路的上调表明免疫应答增强。与kegg分析一致，go分析也发现体液免疫应答显著增加(p＝0.025)(表10)。众所周知，细胞和体液免疫系统的多个组分有助于多个器官和组织(包括四肢、骨骼肌、心脏和神经系统)的修复、恢复或再生结果(aurora and olson,2014.cell stem cell 15:14-25)。
[0158]
表10：与preg相比b3上显著上调或下调的go类别和kegg通路
[0159][0160]
b3亚群中go类别的显著下调与肌动蛋白聚合和肌动蛋白丝长度的调节有关(表10)。肌动蛋白细胞骨架的动态重组是细胞迁移的主要驱动力。肌动蛋白聚合的抑制可能对细胞迁移和b3亚群的治疗功效产生不利影响。
[0161]
结果/亚级分b4：据观察，b4亚群在ckd啮齿动物模型中具有功能性结果。与观察到
的体内治疗生物活性一致，多种再生相关的go类别，包括脉管系统发育(p＝7.76e-07)、血管发育(p＝1.36e-06)、血管形态发生(p＝1.76e-06)、血管生成(p＝1.82e-06)和对受伤的应答(p＝1.35e-05)被发现在b4亚群中比preg材料显著上调(表11)。go类别血管生成对于肾脏、心脏和多个其他器官和组织的修复、恢复或再生至关重要(takiya and borojevic,2011.kidney int suppl 1:99-102；kramann and humphreys,2014.semin nephrol 34:374-83；park and gerecht,2014.development 141:2760-9；kaully et al.,2009.tissue eng part b 15:159-69)。发现血管生成和其他再生相关信号传导通路的关键受体(包括cxcr4、tek、fgfr1和kdr)上调。其中，sdf1/cxcr4轴对于响应基于异位细胞的疗法的肾脏修复、恢复或再生至关重要(togel and westenfelder,2011.kidney int suppl 1:87-89,sharmaet al.,2011.stem cells dev20:933-46；sagrinati,c.,et al.trends mol med 14,277,2008)。在go类别对受伤的应答中，许多上调的基因，如notch1、notch3、timp3、vwf、adam15、gas6、igfbp1和tm4sf4，也属于go类别伤口愈合和组织恢复、修复或再生。这些基因相对于preg的显著上调也与b4亚群的再生生物活性一致。
[0162]
表11：与preg相比b4中显著上调的go类别
[0163][0164]
此外，发现与preg材料相比，b4中细胞黏附相关的go类别显著上调(表11)。细胞黏附对于移植细胞至宿主环境的并入和功能整合至关重要。细胞黏附基因的诱导可能有利于移植细胞的归巢。
[0165]
没有发现b4中分析的通路显著下调。
[0166]
结果/亚级分b5：发现亚群b5是在基因表达水平上相对于preg材料最独特的级分。四十个go/kegg类别与preg显著不同(表12和表13)。
[0167]
表12：与preg相比b5中显著上调的go类别和kegg通路
[0168][0169]
表13：与preg相比b5中显著下调的go类别和kegg通路
[0170][0171][0172]
上调的go/kegg类别包括细胞黏附、血管生成、管的分支形态发生、细胞形态发生、上皮细胞增殖的调节、血管发育、血管形态发生、脉管系统发育、细胞组分形态发生、细胞形态发生、参与分化的细胞形态、管形态发生、细胞突起组织和形态发生、细胞部分形态发生、
分支结构的形态发生、发育成熟和对营养的反应等。这些显著上调的go/kegg类别中的大多数明显参与催化修复、恢复、或再生结果。
[0173]
正如在b4中观察到的，关键的促血管生成受体cxcr4、tek和kdr在b5中显著上调。此外，观察到促血管生成配体pgf、angpt2、angpt4、vegfa和pdgfa在b5亚群中相对于preg材料显著上调。这些配体的再生生物活性已得到充分证实。
[0174]
若干特别令人感兴趣的显著差异调节通路，包括经典的wnt/b-连环蛋白信号传导通路。相对于preg材料，典型的wnt/b-连环蛋白信号传导通路在b5亚群中显著下调(表13)。wnt信号传导与肾发生和器官发生密切相关，但在适当的情况下也可能是促纤维化的并有助于疾病状态的维持(kawakami etal.,2013.j pathol 229:221-31；shkreli et al.,2011.nat med 18:111-9；cisternas et al.,2014.curr mol med 14:510-22)。在src背景下，b5的相关wnt信号传导生物活性可能是其促纤维化作用；因此，wnt信号传导的任何减少都可能是植入纤维化患病肾脏后的期望结果(cuevas et al.,2015.biomed res int.文章id 726012)。
[0175]
同样有趣的是，相对于preg材料，b5亚群中go类别“管的分支形态发生”的表达上调。这是令人感兴趣的，因为哺乳动物的肾发生是由输尿管芽(肾管的衍生物)和周围的后肾间质之间的分支形态发生的迭代过程驱动的。输尿管芽上皮响应来自邻近后肾间质的信号传导而持续分支形态发生，进而导致在输尿管芽尖端诱导新的后肾间质聚集体和持续的肾发生事件。这个迭代过程沿着发育中的肾脏的径向轴继续，其中最年轻的肾单位被诱导到外围(由basu and ludlow,2012.birth defects research part c 96:30-38综述)。为此，在成年啮齿动物肾脏中植入富集的异质肾细胞群(例如，src)与从头诱导新肾单位样结构相关(basu,j.,et al.cell transplantation 20,1771,2011)。
[0176]
最后有趣的是，通过tgf-β1信号传导通路激活go类上皮细胞增殖的调节与富集的异质肾细胞群(例如，src)在促进宿主肾小管上皮细胞增殖中的潜在作用一致。事实上，为此，已观察到移植的富集异质肾细胞群在5/6nx模型中促进肾小管细胞增殖。富集的异质性肾细胞群(例如，src)治疗特别增加了肾小管上皮细胞中ki67+增殖细胞的数量。这种隔室特异性增殖可能是治疗结果的直接指标：上皮增殖导致肾功能的补充，而间质增殖导致纤维化。
[0177]
观察到与preg材料相比，b5亚群中与蛋白质代谢相关的多个go/kegg类别显著下调，这可能简单地表明b5亚群相对于preg材料的总体代谢率降低。
[0178]
总结。富集的异质肾细胞群，例如src，是通过preg材料的碘克沙醇梯度离心制备的。preg材料的碘克沙醇梯度离心导致preg材料分离成五个亚群(b1-b5)。b1-b5亚群的转录组分析鉴定了关键的转录组网络和伴随的信号传导通路，这些网络和伴随的信号传导通路可能是富集的异质肾细胞群(例如，src)的基础，作用机制如其在慢性肾病治疗中的修复、恢复和再生生物活性所表明的那样。最终富集的异质肾细胞群产品中包含的b2-b5亚群相对于preg材料的显著差异包括：b2亚群中与ecm-受体相互作用相关的go/kegg类别下调；b3亚群中与免疫应答相关的go/kegg类别上调，以及与肌动蛋白聚合调节相关的go/kegg类别下调；b4中与修复、恢复、再生和细胞黏附相关的go/kegg类别上调；以及b5中四十个差异调节的go/kegg类别，包括与修复、恢复或再生活性明确相关的多个类别。相对于preg材料，不包含在富集的异质肾细胞群中的亚群b1在与细胞周期和转录控制相关的go/kegg类别中
表现出显著下调，在与炎症相关的go/kegg类别中表现出显著上调。
[0179]
总而言之，转录组数据表明，用于治疗用途的富集的异质肾细胞群(例如，src)部分通过激活与促进再生相关的多个转录组网络同时抑制可能促进肾脏疾病和病理生理学持续发展的替代转录通路来催化肾脏的修复、恢复或再生结果。
[0180]
实施例4：鉴定对用于治疗慢性肾病的富集的异质人肾细胞群的再生生物活性具有机制意义的发育通路。
[0181]
引言：进一步建立在实施例3中的啮齿动物数据的基础上，对制备用于临床试验的人富集异质肾细胞群进行转录组和表观基因组分析。肾自体细胞疗法(react)是一种新型再生医学候选药物，用于治疗慢性肾病、糖尿病肾病以及肾脏和泌尿道先天性异常(stavas 2021.protocol and baseline data on renal autologous cell therapy injection in adults with chronic kidney disease secondary to congenital anomalies of the kidney and urinary tract.blood purif 50(4-5):678-683；stenvinkel p,j,bertram t,detwiler r,gerber d,brismar tb,et al.implantation of autologous selected renal cells in diabetic chronic kidney disease stages 3and 4-clinical experience of a“first in human”study.kidney int rep.2016 1(3):105
–
13)。react由富集的异质肾细胞群(在本实施例中称为src或src群)配制，由衍生自受试者自身肾活检的初始细胞群(在本实施例中称为brc0或brc0群的初始细胞群)制备或制造。对人src与brc0群的转录组和表观基因组谱进行比较，以确认并进一步探索用于治疗肾脏疾病的人src的修复和恢复活性的潜在机制。
[0182]
材料和方法/用于治疗慢性肾病的src的制备：先前已详细描述了从肾组织活检中制备选定肾细胞的方法(bruce,a.t.,guthrie,k.i.,kelley,r.ex vivo culture and separation of functional renal cells.methods mol biol 1001,53,2013；halberstadt et al.,2013,methods mol.biol.)。
[0183]
材料和方法/cdna文库构建：为了构建文库，从每个细胞群(n＝6)中提取rna。经过dnase i处理并进行质量控制(qc)后，使用200ng的高质量总rna进行文库构建。使用带有oligo(dt)的磁珠来分离mrna。通过加入片段化缓冲液对mrna进行随机片段化，然后在加入dntp、rnase h和dna聚合酶i后，使用mrna模板和随机六聚体引物合成cdna。纯化短片段并用eb缓冲液解析用于末端修复和单核苷酸a(腺嘌呤)添加。之后，将短片段与测序适体连接。通过大小选择和pcr富集完成双链cdna文库。在qc步骤中，使用agilent 2100生物分析仪和abi steponeplus实时pcr系统对样品文库进行定量和鉴定。最后，根据有效浓度和预期数据量合并后，使用cd genomics(shirley，ny)的illumina novaseq6000对合格的rna-seq文库进行测序。
[0184]
材料和方法/生物信息学分析：fastqc工具(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq)用于对原始读数的质量进行基本统计。trimmomatic(版本0.36)删除了测序适体和低质量数据(juhling,f.,et al.,metilene:fast and sensitive calling of differentially methylated regions from bisulfite sequencing data.genome res,2016.26(2):p.256-62)。过滤后的干净读数通过hisat2(kanehisa,m.,et al.,kegg for linking genomes to life and the environment.nucleic acids res,2008.36(database issue):p.d480-4)映射到参考基因组，并获得位置和基因特征。
cufflinks软件的cuffquant和cuffnorm组件用于使用基因上的映射读取位置信息来量化转录本和基因表达水平。分析不同表达水平下的基因数量以及每个单个基因的基因表达水平。deseq用于分析具有生物重复的样品的deg，而ebseq用于分析没有重复的样品。在分析过程中，首先对样品进行分组，以便稍后可以将每两组作为对照-治疗组进行两两比较。在此过程中，设定倍数变化≥2且fdr《0.01作为筛选标准。基因本体(go-gene ontology consortium，2000)富集分析是一套国际标准化的基因功能描述分类系统，试图鉴定与差异表达蛋白编码基因显著相关的go术语。go分子分为三大类：1)细胞组分：用于描述亚细胞结构、位置和大分子复合体(如核仁、端粒)和初始复合体的识别；2)分子功能：用于描述基因、基因产物、个体功能，如碳水化合物结合或atp水解酶活性；3)生物过程：用于描述参与生物过程(如有丝分裂或嘌呤代谢)的基因编码的产物。kegg通路用于鉴定与整个基因组背景相比在特定基因中显著富集的通路。该分析的公式为：
[0185][0186]
其中“n”是具有通路注释的所有基因的数量；“n”是n内候选基因的编号；并且“m”是用特定通路注释的基因的数量。fdr≤0.05的通路定义为显著富集通路。使用kobas(2.0)进行通路富集分析。
[0187]
材料和方法/简化代表性亚硫酸氢盐测序(rrbs)：使用nucleon
tm bacc基因组dna提取试剂盒(ge healthcare,life sciences)从细胞样品(brc0，src，n＝4)中分离基因组dna，并使用qubit高灵敏度测定(life technologies)定量双链dna含量。使用mspi(neb)消化每个细胞样品中的1μg基因组dna，然后使用premium rrbs试剂盒(diagenode)进行末端制备和适体连接。使用ampure xp珠(beckman coulter,inc.)进行大小选择，以获得mspi消化产物的dna级分，富集150-350bp范围内最富含cpg的区域。随后，使用zymo ez dna甲基化-gold试剂盒进行亚硫酸氢盐处理。然后使用25μl kapa hifi hotstart uracil+readymix(2x)和终浓度均为1μm的8-bp索引引物，通过十二个pcr循环扩增转化的dna，并使用ampure xp珠进行净化。将构建的rrbs文库发送至cd genomics(shirley,ny)进行测序和生物信息学分析。简而言之，使用qubit荧光计和quant-it dsdna hs测定试剂盒(invitrogen)对文库进行定量，并使用双端150bp策略在illumina hiseq平台上进行测序。
[0188]
材料和方法/rrbs数据分析：fastqc工具(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq)用于对原始读数的质量进行基本统计。然后，通过trimmomatic(版本0.36)删除了测序适体和测序数据的低质量数据(juhling,f.,et al.,metilene:fast and sensitive calling of differentially methylated regions from bisulfite sequencing data.genome res,2016.26(2):p.256-62)。使用bsmap软件将亚硫酸氢盐序列映射到参考基因组，其中参数为
‘‑
n 0-g 0-v 0.08-m 50-x 1000(kanehisa,m.,et al.,kegg for linking genomes to life and the environment.nucleic acids res,2008.36(database issue):p.d480-4)。收集比对的统计信息，仅保留唯一的映射读数用于以下分析。仅使用序列深度覆盖度至少为5的甲基化胞嘧啶。如果比对的碱基是c，则发生甲基化；相反，如果比对的碱基是t，则不会发生甲基化。单个胞嘧啶的甲基化水平计算为确定
的甲基化cpg胞嘧啶的测序深度与单个cpg胞嘧啶的总测序深度的比率，即ml＝mc/(mc+umc)，其中ml是甲基化水平，mc和umc分别表示支持甲基化c的读段数和支持非甲基化c的读段数。使用metilene软件(版本0.2-7)通过二元分割算法结合二维统计检验来鉴定dmr(差异甲基化区域)(参数:-m 300-m 5-d 0.1-t 1-f 1-v 0.7)(bruce et al.,2013.ex vivo culture and separation of functional renal cells.methods mol biol 1001:53-640.gene ontology(称为go,http://www.geneontology.org/)，应用dmr相关基因的富集分析来揭示感兴趣的生物过程。q值≤0.05的通路被认为显著富含dmr相关基因。基于dmr注释结果和kegg数据库(sha et al.,2021.genome-wide transcriptional profiling of selected renal cells(src):identification of functional pathways for regenerative bioactivity in treatment of chronic kidney disease.提交稿件)对观察到基因体及上下游区域(上游2k、基因体、下游2k)与dmr重叠的基因进行功能富集分析。
[0189]
结果/区分src和brc0群体细胞的差异表达转录本
[0190]
总共n＝6个个体供体用于制备总rna和cdna，用于文库构建和rna-eq分析，如材料和方法中所述。总共鉴定了221个deg来区分src群体和brc0群体。这221个deg由119个在src中相对于brc0特异性上调的基因和102个在src中相对于brc0特异性下调的基因组成。src中相对于brc0上调和下调的前20个基因的列表分别显示于表14和表15中。这些转录本的错误发现率(fdr)为10-6
或更小，反映了非常高的统计显著性。
[0191]
表14：src中相对于brc0上调的前20个基因
[0192][0193]
表15：src中相对于brc0下调的前20个基因
in tgf-β2heterozygous mutant mice,pedr.res 63:607-612)。此外，tgf-β2与fgf2协同作用，已被证明可在分离的啮齿动物后肾间充质外植体中诱导多管形成(plisov et al.,2001.tgf beta 2,lif and fgf2 cooperate to induce nephrogenesis,development 128:1045)。
[0200]
分支形态发生素crispld2(也称为ldl1)已被证明对发育中的输尿管分支尖端(ubt)有特定的定位模式(rutledge et al.,2017.cellular heterogeneity in the ureteric progenitor niche and distinct profiles of branching morphogenesis in organ development,development 144:3177)。对crispld2/ldl1表达的观察表明，后肾间充质细胞分泌的crispld2增强了肾集合系统的分支形态发生，这与其对肺芽枝化早期阶段的推定作用相似(quinlan et al.,2007.lgl1,anovel branching morphogen in developing kidney,is induced by retinoic acid.am j physiol renal physiol；293(4):f987-93)。
[0201]
已知lox和lox样蛋白家族通过其在细胞外基质组装和重组中的生物活性，在发育和器官发生中发挥多种作用。lox和lox样蛋白与多种组织和器官的发育有关，包括大脑、脊髓、肺、心脏、主动脉、牙齿、骨骼、软骨、肌肉和肌腱、皮肤和子宫(wei et al.,2020；role of the lysyl oxidase family in organ development(综述),exp.ther.med.20:163-172)。
[0202]
lfng是三种notch配体之一，其表达参与肾囊泡近端/远端极性的建立和划分。notch通路建立了近端极性，近端极性的建立通过逗号形体和s形体阶段进行，并且是近端小管和足细胞发育所必需的(o-brian and mcmahon,2014.induction and patterning of the metanephric nephron.semin cell dev biol.36:31-38)。在非洲爪蟾发育尾芽阶段的近端原肾的背前区中观察到了lfng和密切相关的糖基转移酶自由基边缘(radical fringe)的表达。lfng表达在e14.5小鼠胚胎中发育中肾单位的远端和近端部分不存在，但在未来的近端小管中强烈检测到(类似于notch配体dll1的表达)。到了e17.5，lfng表达被证明仅限于肾脏外周发育中肾单位的部分，这表明lfng可能受到未来近端小管细胞中notch信号传导的调节(leimeister et al.,2003.expression of notch pathway genes in the embryonic mouse metanephros suggests a role in proximal tubule development.gene expression patterns 3:595
–
598)。
[0203]
人胎儿肾脏中bdnf的表达分析表明bdnf位于发育中的原始肾小球结构和间充质衍生小管内上皮细胞的顶端区域。虽然在分化的远端小管中检测到bdnf，但在未诱导的间充质中未观察到bdnf的表达，这表明bdnf不参与早期诱导事件，而是参与肾单位组织的后期阶段(huber et al.,1996.neurotrophins and neurotrophin receptors in human fetal kidney.developmental biology 179:369-381)。有趣的是，bdnf还被证明可以通过micro-rna依赖性增加细胞骨架肌动蛋白聚合来介导体外和体内足细胞的修复(li et al.,2015.bdnf repairs podocyte damage by microrna-mediated increase of actin polymerization.j pathol 235:731-744)。斑马鱼幼体中吗啡啉介导的bdnf敲低导致肾小球形态异常、足细胞数量减少以及足细胞标志物肾病蛋白和足蛋白的错误表达(endlich et al.,2018.bdnf:mrna expression in urine cells of patients with chronic kidney disease and its role in kidney function.j cell mol med.22:5265-5277)。
deg基因集相关的主要已鉴定代谢和信号转导通路进行了kegg注释。deg基因集中特异性富集的kegg细胞过程分类器与上皮细胞连接形成、组织和维持、细胞周期控制和干细胞多能性调节广泛相关：黏附连接、p53信号传导通路、紧密连接、调节干细胞多能性的信号传导通路、细胞骨架作用的调节、内吞作用、细胞周期和黏着斑。此外，与发育、细胞周期控制和再生相关的多个关键信号转导通路也在关键的kegg类别中得到丰富：ampk、mtor、wnt、hif-1、jak-stat、rap-1、tnf、tgfβ、mapk、foxo、hippo和pi3k-akt信号传导通路，以及细胞因子-细胞因子受体相互作用、ecm受体相互作用。
[0209]
图2所示的散点图是kegg富集分析结果的图形表示。在该图中，kegg富集程度通过富集系数、q值和特定通路中富集的基因数量来衡量。富集系数是指位于该通路中的差异表达基因的数量与位于该通路中的注释基因总数的比值。富集系数越大，富集程度越大。q值是多重假设检验后的校正p值。q值的取值范围为[0,1]，越接近0，富集程度越显著。与肾脏再生相关的关键kegg通路包括tgf-β信号传导通路、hippo信号传导通路、foxo信号传导通路、细胞周期、ecm-受体相互作用、嘧啶代谢。
[0210]
对上调deg集的特别关注揭示了以下kegg分类器的重要性：黏附连接、内吞作用、细胞周期、肌动蛋白细胞骨架的调节、p53信号传导通路、调节干细胞多能性的信号传导通路和黏着斑。上调deg集中的其他重要通路包括：rap1信号传导通路、hif1信号传导通路、jak-stat信号传导通路、tgf-β信号传导通路、mapk信号传导通路、tnf信号传导通路和hippo信号传导通路(图3)。上调deg基因集的topgo分析如图3所示。与再生特别相关的关键go-bp标识符包括：子宫胚胎发育中、表皮生长因子受体信号传导通路、g蛋白偶联受体信号传导通路、notch信号传导通路和上皮细胞增殖的负调节。
[0211]
对下调的deg集的具体检查显示以下kegg分类器的富集：黏着斑、凋亡、溶酶体、细胞周期、紧密连接和内吞作用以及信号传导通路：hippo、hedgehog和ampk。对下调的deg集的topgo分析显示以下bp分类器的富集：egfr信号传导通路、notch信号传导通路、gpcr信号传导通路、消化道形态发生、心脏循环、上皮细胞增殖负调控。
[0212]
结果/src和brc0群体的表观基因组分析：src和brc0之间的差异甲基化区域(dmr)比较如图4中的小提琴箱线图所示。其表明src基因组比brc0基因组具有成比例更大的高甲基化和更少的低甲基化(n＝4)。根据dmr注释结果，对基因体及上下游区域(上游-2k、基因体、下游-2k)与dmr重叠的基因进行功能富集分析。与brc0相比，src中dmr相关基因中最高度富集的go-bp分类器包括细胞黏附、信号转导和rna聚合酶转录的负/正调节。与brc0相比，src群体中高度富集的kegg通路包括：肌动蛋白细胞骨架的调节、癌症中的蛋白聚糖、黏着斑、内吞作用、camp信号传导通路、ras信号传导通路、rap1信号传导通路、pi3-akt信号传导通路、mapk信号传导通路和hippo信号传导。从广义上讲，这些分类器可诊断参与细胞外基质组织和重组的基因，以及与有机体发育和细胞增殖相关的信号传导通路。这些分类器也与先前在deg集分析中鉴定的分类器一致。
[0213]
同样，根据dmr在基因组上的分布，与基因启动子区域(转录起始位点上游1.5k和转录起始位点下游0.5k)存在重叠基因进行功能富集分析。根据该分析，与dmr相关基因相关的go分类器包括肌动蛋白细胞骨架的调节、内吞作用、camp信号传导通路、细胞黏附分子cam、rap1信号传导通路。同样值得注意的是，src相对于brc0的最大倍数变化是白细胞跨内皮迁移，这是与伤口愈合和组织再生相关的关键炎症阶段。此外，与dmr相关基因相关的
kegg分类器包括：肌动蛋白细胞骨架的调节、camp信号传导通路、调节干细胞多能性的信号传导通路、ras信号传导通路、rap1信号传导通路、pi3k-akt信号传导通路、内吞作用、细胞黏附cam、白细胞跨内皮通路。这些分类器也与先前在deg集中鉴定的分类器大致一致。
[0214]
结果/总结：总体而言，人类来源的src提供了富含与发育相关的go和kegg分类器的deg集。deg基因集中特异性富集的kegg细胞过程分类器与上皮细胞连接形成、组织和维持、细胞周期控制和干细胞多能性调节广泛相关。在dmr基因集中观察到类似的富集模式。基于本文提出的这些和其他表达数据，src可能部分地通过激活与胚胎肾发生方面平行、最终在受伤或疾病部位触发新肾样组织形成的机制途径介导肾脏的体内再生并改善肾病患者的临床结果。
[0215]
实施例5：对中期至晚期2型糖尿病相关ckd受试者施用富集的异质肾细胞群
–
评估肾发生标志物表达水平以及与临床结果的潜在关系
[0216]
引言：认识到富集的异质肾细胞群，例如本实施例中提到的src，可以通过影响介导新肾发生的信号传导级联来介导对患病肾脏的再生作用，将src施用于患有中期至晚期2型糖尿病相关ckd的临床试验受试者，评估肾发生标志物的表达水平，并与患者的临床反应进行相应比较。
[0217]
材料和方法/用于施用的src的制备：临床试验中的所有患者均接受了标准的经皮肾活检以分离肾细胞，从中制备其src用于施用。如实施例1和4中所述从肾活检制备src。
[0218]
材料和方法/src的表型标志物分析：悬浮液中的src在室温下以300xg离心5分钟。将所得src沉淀用dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs)洗涤一次，然后在bd固定/透化溶液(bd biosciences,cat.no.554714)中于4℃固定20分钟。固定的细胞在室温下以500xg离心5分钟。将细胞沉淀重悬于bd perm/wash缓冲液中。将重悬的细胞等分(20μl，含有150,000个细胞)，然后与1μg一抗在4℃下孵育1小时。孵育结束时，将细胞沉淀，用bd perm/wash缓冲液洗涤，再次沉淀，并重悬于150μl dpbs中。对于未直接与荧光团缀合的抗体，将1μg二抗与细胞一起孵育另外30分钟，然后洗涤并重悬于dpbs中。然后通过流式细胞术分析细胞。
[0219]
材料和方法/src的facs分析：为了确定src是否含有帽间质、肾发生间质和输尿管芽的标志物，对细胞进行了筛选，以寻找可鉴定这些特定成分的膜蛋白。以下免疫试剂用于筛选：山羊抗兔igg h&l,alexafluor 488(abcam inc.cat#ab150077)；nphs2兔多克隆抗体(abcam inc.cat#ab50339)；肾病蛋白兔单克隆抗体(y17r)(abcam inc.cat#ab136894)；ret alexafluor488兔单克隆抗体(epr2871)(abcam inc.ab237105)；兔igg，多克隆，同种型对照(abcam inc.ab37415)；six2抗体(h-4)pe(santa cruz,cat#sc-377193pe)；osr1抗体(santa cruz,cat#sc376545pe)；lhx1单克隆igg2a(santa cruz,cat#sc515631pe)；ret兔单克隆抗体(abcam inc.cat#ab237105)；rb igg(h&l)山羊多克隆二抗-alexa fluor 488(abcam inc.cat#ab150077)；alexa647小鼠igg2a，κ同种型对照(bd,cat#557715)；fgf8单克隆，全长(abcam,cat#ab89550)；兔igg同种型对照[pe](novus biologicals,cat#nbp2-36463pe)以及pe小鼠igg1，κ同种型对照(bd,cat#555749)。
[0220]
材料和方法/facs表型标志物分析：通过在1.5ml微量离心管中沉淀至少50,000个src，并将细胞在100μl bd固定/透化溶液中于4℃固定20分钟，进行表型标志物分析。然后将微量离心管以500xg置于微量离心机中3分钟以沉淀固定的细胞，然后用500μl bd perm/wash缓冲液洗涤一次。将洗涤沉淀重悬于20μl bd perm/wash缓冲液中，并加入1μg一抗，在
4℃下孵育1小时。将细胞用500μl bd perm/wash缓冲液洗涤一次，然后重悬于20μl bd perm/wash缓冲液中，加入1μg二抗，在4℃下孵育30分钟。最后一次洗涤使用500μl bd perm/wash缓冲液进行。将沉淀重悬于150μldpbs中并通过流式细胞术分析细胞。
[0221]
结果/src的标志物表达分析：表16提供了在临床试验中施用至受试者的src的标志物表达分析结果。
[0222]
表16：facs分析的整理数据
[0223][0224]
与早期的分析例如实施例2中呈现的分析一致，临床试验受试者的src表达肾发生标志物组的标志物，以及包括肾病蛋白、足蛋白和rack-1在内的其他标志物。临床试验受试者的src还包括表达标志物的细胞百分比，如前所述。各种标志物的相关性发现了它们共表达的证据(参见图5a-h)。
[0225]
对src标志物表达的进一步分析表明，相对于那些被鉴定为低反应者(egfr斜率改善，但egfr没有改善)的受试者，被鉴定为中度/高反应者(egfr改善)的受试者表现出各种生物标志物的更高表达趋于对six2具有显著性，并且对lhx1具有显著性(表16)。这些分析提供了进一步的证据，表明src可能介导新肾发生，因为src群体的细胞具有较高水平的肾发生标志物表达，它们可能具有增强的介导再生和恢复活性的能力，从而为患病肾脏提供治疗效果。