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f mri纳米粒子的制备及肿瘤成像应用
技术领域
1.本发明属于分子影像学技术领域，具体涉及
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f mri纳米粒子的制备及肿瘤成像应用。


背景技术：

2.癌症，即恶性肿瘤，一直是人类生命健康的头号杀手。当恶性肿瘤细胞进入到中晚期时，癌细胞会进行不断地扩散及转移，因此当癌症进入晚期时，目前还没有有效的治疗方法。但早期的癌症是可以进行有效抑制或治疗的，所以，对于癌症的早期诊断与治疗，是治疗癌症及保持人体生命健康的重要环节。目前，临床上最为有效和常用的癌症早期筛查和诊断方式是影像学检测法。常见的影像学检测主要包括计算机断层扫描(ct)、正电子发射断层显像(pet)、x射线、超声以及磁共振成像(mri)等技术。
3.磁共振成像技术(mri)是一种利用磁共振现象获得电信号的新兴影像技术，其原理为：1h、
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c、
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f、
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p等元素拥有带正电的原子核，，这些原子核会进行自旋运动，且自旋轴的排列是无规则的，当将其置于外加磁场中时，无规则的自旋轴排列会朝向磁场方向，自旋的核同时也以自旋轴和外加磁场的向量方向的夹角绕外加磁场向量旋进，使得自旋系统的磁化矢量由零逐渐增长，当系统达到平衡时，磁化强度达到稳定值。而此时采用一定频率的射频激发原子核会使原子核发生共振，致使自旋核还要在射频方向上旋进，当停止射频脉冲后，原子核又会回复到在磁场中原来的排列状态，同时释放出微弱的能量，成为射电信号。因此通过检出这些信号，并使之能进行空间分辨室，就得到运动中原子核的分布图像。其中，原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程，它所需的时间叫弛豫时间。弛豫时间有两种即t1和t2，t1为自旋-点阵或纵向驰豫时间，t2为自旋-自旋或横向弛豫时间。相比于其他影像诊断技术，mri具有较强的穿透能力、高空间分辨率、高软组织对比度以及没有电离辐射等优点，因而被广泛应用于临床诊断中，并受到科研工作者们的关注。
4.目前，临床上广泛使用的mri技术是1h mri。但在实际的临床应用过程中，由于组织中存在大量的1h会造成背景干扰，并且病变组织与正常组织的环境差异较小，所得到的图像对比度往往不够理想，以至于造成误诊或漏诊，因此1h mri往往需要借助造影剂来增强图像的对比度。但目前常用的1h mri造影剂均会对人体造成一定的损伤，如脑沉积，肾源性系统纤维化等。而
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f mri是一种具有潜力的mri，其具有以下几点优势：(1)
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f拥有100％的天然丰度；(2)
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f具有较高的磁旋比(40.06mhz/t)，因此具有较高的检测灵敏度；(3)氟原子的核外电子有7个，因此相比于单电子的1h，
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f的化学位移对组织局部环境更为敏感；(4)
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f具有较宽的化学位移；(5)生物体内含有极少量的氟元素，并且集中在牙齿与骨骼中，因此几乎没有内源性的背景干扰。
5.原则上，理想的
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f mri造影剂应具备良好的水溶性，良好的生物相容性，良好的氟原子活动性，并具有较高的氟原子密度。近年来，用于
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f mri的纳米造影剂主要是全氟化碳类造影剂。但由于氟原子是一种疏水性原子，当氟原子密度增大至一定浓度时，氟原子会发生疏水性聚集，导致氟原子的活动性降低，从而会导致
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f mri活动性降低。因此，能否制备
出一种既能够增大氟原子密度又不影响氟原子活动性的造影剂是
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f mri技术的关键。离子液体是一种在100℃以下呈液体状态的盐类，一般由有机阳离子和无机阴离子或有机阴离子组成。大多数离子液体具有良好的生物相容性，如果能够将某些特定水溶性氟源引入离子液体中，并利用聚合反应使其成为聚离子液体，便能够有效解决高密度氟原子聚集的问题。
6.有研究表明，氟原子的活动性能够影响f原子的t2弛豫时间，进而影响
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f mri的成像效果。一般而言，与一端固定在粒子表面的离子液体或聚离子液体相比，游离态离子液体或聚离子液体中氟原子的活动性更高，成像信号也更明显。同时，肿瘤组织相比于其他正常组织含有更高的谷胱甘肽(gsh)浓度，利用这一特性，可以实现gsh响应性，使
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f mri造影剂在肿瘤组织内具有更好的成像效果。然而，目前尚未有利用聚离子液体制备既能引入亲水性氟源又不影响其活动性，且具备gsh响应的
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f mri纳米粒子探针。为此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种
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f mri纳米粒子的制备方法及肿瘤成像应用。
8.本发明的第二个目的是提供采用上述的制备方法制备得到的
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f mri纳米粒子。
9.本发明的第三个目的是提供上述的
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f mri纳米粒子的肿瘤成像应用。
10.本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：
11.一种
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f mri纳米粒子的制备方法，即首先采用溶胶凝胶法制备二氧化硅纳米粒子，所述二氧化硅纳米粒子相继经过表面氨基化修饰、引入二硫键改性、碳链末端氨基化、碳链末端引入溴原子、表面接枝含氟聚离子液体和表面聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯后制备成为
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f mri纳米粒子。
12.作为本发明的一个优选实施方式，上述
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f mri纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
13.s1、溶胶凝胶法制备二氧化硅纳米粒子：将有机溶剂、水和氨水混合后加入正硅酸乙酯，经室温搅拌、离心、洗涤后制备得到二氧化硅纳米粒子；
14.s2、表面氨基化修饰：将二氧化硅纳米粒子分散于有机溶剂中，加入氨水搅拌后再加入氨基丙基三甲氧基硅烷，经室温搅拌、离心、洗涤后制备得到氨基化二氧化硅纳米粒子；
15.s3、引入二硫键改性：将氨基化二氧化硅纳米粒子分散于有机溶剂中，加入3-(2-吡啶二硫代)丙酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺后经室温搅拌、离心、洗涤制备得到表面引入二硫键的二氧化硅粒子；
16.s4、碳链末端氨基化：将表面引入二硫键的二氧化硅粒子分散于有机溶剂中，加入半胱氨酸盐酸盐和三乙胺后经室温搅拌、离心、洗涤制备得到表面引入二硫键且末端为氨基的二氧化硅粒子；
17.s5、碳链末端引入溴原子：将表面引入二硫键且末端为氨基的二氧化硅粒子分散于有机溶剂中，然后在冰浴中及氮气保护下加入三乙胺，并缓慢滴加2-溴异丁酰溴，冰浴中搅拌后经离心、洗涤制备得到表面引入二硫键且末端为溴原子的二氧化硅纳米粒子；
18.s6、表面接枝含氟聚离子液体：将表面引入二硫键且末端为溴原子的二氧化硅纳
米粒子分散于水中，然后在冰浴、惰性气体鼓泡及搅拌条件下加入含氟聚离子液体、配体和溴化铜，经鼓泡处理后再加入溴化亚铜，经密封、换气后将温度提高至50-70℃进行搅拌处理，最后经离心、洗涤制备得到表面接枝含氟离子液体的二氧化硅纳米粒子；
19.s7、表面聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯：将表面接枝含氟离子液体的二氧化硅纳米粒子分散于水中，然后在冰浴、惰性气体鼓泡及搅拌条件下加入聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯、配体和溴化铜，经鼓泡处理后再加入溴化亚铜，经密封、换气后将温度提高至50-70℃进行搅拌处理，最后经离心、洗涤制备得到
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f mri纳米粒子。
20.为制备一种能够引入亲水性氟源同时不影响其活动性的
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f mri纳米粒子探针，本发明以二氧化硅纳米粒为核点，通过表面修饰引入-s-s-基团使其具有gsh响应断裂功能，并在碳链末端引入溴原子使其成为atrp引发剂，利用两步atrp聚合反应将含氟离子液体和聚乙二醇接枝到二氧化硅表面，从而制备得到一种具有gsh响应(实施例是用dtt来代替gsh环境以验证gsh响应)的
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f mri纳米粒子探针，该
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f mri纳米粒子可作为造影剂用于肿瘤成像。
21.优选地，步骤s1中，有机溶剂、水、氨水和正硅酸乙酯的体积比为186：86.4：4.96：7。
22.优选地，步骤s1中，室温搅拌的时间为7-15小时。具体地，室温搅拌的时间为10小时。
23.优选地，步骤s1中，所述有机溶剂包括但不限于乙醇。
24.优选地，步骤s2中，所述有机溶剂、氨水和氨基丙基三甲氧基硅烷的体积比为90-105：0.8-1.2：1。
25.优选地，步骤s2中，室温搅拌的时间为12-16小时。具体地，室温搅拌的时间为14小时。
26.优选地，步骤s2中，所述有机溶剂包括但不限于乙醇。
27.优选地，步骤s3中，所述3-(2-吡啶二硫代)丙酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为4：5-5.5：3-3.3。
28.优选地，步骤s3中，室温搅拌的时间为10-14小时。具体地，室温搅拌的时间为12小时。
29.优选地，步骤s3中，所述有机溶剂包括但不限于dmf(n,n-二甲基甲酰胺)。
30.优选地，步骤s4中，所述半胱氨酸盐酸盐和三乙胺的料液比为200mg/ml。
31.优选地，步骤s4中，室温搅拌的时间为10-14小时。具体地，室温搅拌的时间为12小时。
32.优选地，步骤s4中，所述有机溶剂包括但不限于dmf(n,n-二甲基甲酰胺)。
33.优选地，步骤s5中，所述三乙胺和2-溴异丁酰溴的体积比为1-1.2:1。
34.优选地，步骤s5中，冰浴搅拌的时间为10-14小时。具体地，冰浴搅拌的时间为12小时。
35.优选地，步骤s5中，所述有机溶剂包括但不限于甲醇。
36.优选地，步骤s6中，所述含氟聚离子液体、溴化铜、溴化亚铜和配体的料液比为2-2.1g：3-3.3mg：26.4-28.0mg：33-35μl。
37.优选地，步骤s6中，所述含氟聚离子液体具有如下所示的化学结构式：
[0038][0039]
优选地，步骤s7中，所述溴化铜、溴化亚铜、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯和配体的料液比为3-3.3mg：26.4-28.0mg：33-35μl。
[0040]
优选地，步骤s6、s7中，所述配体包括但不限于n,n,n,n,n-五甲基二亚乙基三胺。
[0041]
优选地，步骤s6、s7中，鼓泡处理的时间为20-40min。具体地，鼓泡处理的时间为30min。
[0042]
优选地，步骤s6、s7中，搅拌处理的时间为20-30min。具体地，搅拌处理的时间为24min。
[0043]
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：
[0044]
采用所述的一种
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f mri纳米粒子的制备方法制备得到的
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f mri纳米粒子。
[0045]
采用本发明方法制备得到的9f mri纳米粒子在水中具有良好的分散性，稳定性以及生物相容性，引入亲水性氟源但不会影响其原子活动性，为其肿瘤成像应用奠定了重要的基础。
[0046]
本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：
[0047]
所述
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f mri纳米粒子在制备肿瘤成像造影剂中的应用。
[0048]
采用本发明方法制备得到的9f mri纳米粒子可作为造影剂用于肿瘤成像，在高浓度gsh环境下具有响应性，且能够利用高通透性以及滞留效应靶向输送到肿瘤位置，可用于对肿瘤的早期诊断。
[0049]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0050]
本发明公开了一种
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f mri纳米粒子的制备方法，首先采用溶胶凝胶法制备二氧化硅纳米粒子，然后以二氧化硅纳米粒为核点，相继经过表面氨基化修饰、引入二硫键改性、碳链末端氨基化、碳链末端引入溴原子、表面接枝含氟聚离子液体和表面聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯后制备得到。采用本发明方法制备得到的纳米粒子在水中具有良好的分散性，稳定性以及生物相容性；利用表面修饰聚合的方法能够搭载大量的氟硼酸根离子，且该离子具有良好的水溶性，能够在引入亲水性氟源的同时又不会影响其原子活动性。同时，将该纳米粒子作为造影剂用于肿瘤成像，在高浓度gsh环境下具有响应性，即在正常环境下，纳米粒子造影剂的t2弛豫时间较低，几乎没有
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f mri信号；而当造影剂处于肿瘤组织时，肿瘤环境中的高浓度gsh能够使含氟离子液体聚合物从纳米粒子上脱落，使t2弛豫时间大幅提高，从而能够显示出较高的
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f mri信号。该纳米粒子造影剂在进入肿瘤组织后能够利用肿瘤组织中的高gsh浓度使探针的
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f mri信号打开，实现对肿瘤的早期诊断。
附图说明
[0051]
图1为二氧化硅纳米粒子的透射电镜图；
[0052]
图2为二氧化硅纳米粒子的粒径分布图；
[0053]
图3为
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f mri纳米粒子的透射电镜(tem)图；
[0054]
图4为
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f mri纳米粒子的粒径分布图；
[0055]
图5为
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f mri纳米粒子的
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f nmr图；
[0056]
图6为
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f mri纳米粒子的t2弛豫时间图；
[0057]
图7为
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f mri纳米粒子加入dtt后的t2弛豫时间图；
[0058]
图8为不同浓度的
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f mri纳米粒子与huvec和hela细胞孵育24h后的细胞存活率(a和b用于区分huvec和hela细胞)；
[0059]
图9为不同浓度的
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f mri纳米粒子n在加入3mmol/ml二硫苏糖醇前后的
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f mri图像。
具体实施方式
[0060]
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0061]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
[0062]
第一类：基于抗体蛋白的自组装实现药物分子(单种或多种药物)的装载
[0063]
实施例1
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f mri纳米粒子的制备
[0064]
(1)二氧化硅纳米粒子的制备
[0065]
采用溶胶凝胶法制备二氧化硅纳米粒子，该步骤的具体实施方法为：
[0066]
在250ml的圆底烧瓶中加入184ml无水乙醇，86.4ml水和4.96ml氨水，500rpm搅拌30min后，然后加入7ml正硅酸乙酯，室温搅拌10小时，得到的产物以13000rpm的转速离心10min，所得沉淀用无水乙醇洗涤，重复三次，得到二氧化硅纳米粒子。
[0067]
采用200kv透射电子显微镜对该步骤得到的二氧化硅纳米粒子进行扫描，所得的tem图像如图1所示。同时，将该步骤得到的二氧化硅纳米粒子重悬在纯水中，稀释得到50μg/ml的分散液，利用malvern zetasizer nano s动态光散射仪测量其粒径分布，所得的分布图像如图2所示。
[0068]
由图1和图2可知，该方法制备得到的纳米二氧化硅纳米粒子的平均粒径为81.4nm，且分散性较好，粒径均一。
[0069]
(2)二氧化硅纳米粒子表面功能化修饰
[0070]
该步骤的具体实施方法为：
[0071]
将步骤(1)中的二氧化硅纳米粒子2g分散于100ml无水乙醇中，并加入1ml氨水，搅拌30min后加入1ml氨基丙基三甲氧基硅烷，室温搅拌14小时后以13000rpm的转速离心10min，所得沉淀用dmf洗涤，重复三次，得到氨基化二氧化硅纳米粒子。
[0072]
(3)引入二硫键改性氨基化二氧化硅纳米粒子
[0073]
该步骤的具体实施方法为：
[0074]
将步骤(2)中的氨基化二氧化硅纳米粒子1.5g分散至100mldmf中，并加入200mg 3-(2-吡啶二硫代)丙酸，250mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,150mg n-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌12h后得到的产物以13000rpm的转速离心10min，所得沉淀用dmf洗涤，重复三次，得到表面引入二硫键的二氧化硅粒子。
[0075]
(4)对表面引入二硫键的二氧化硅粒子的碳链末端进行氨基化
[0076]
该步骤的具体实施方法为：
[0077]
将步骤(3)得到的1.5g纳米粒子分散在100mldmf中，并加入200mg半胱氨酸盐酸盐，1ml三乙胺，室温搅拌12h后得到的产物以13000rpm的转速离心10min，所得沉淀用甲醇洗涤，重复三次，得到表面引入二硫键且末端为氨基的二氧化硅粒子。
[0078]
(5)在表面引入二硫键且末端为氨基的二氧化硅粒子的碳链末端引入溴原子，使其成为atrp引发剂
[0079]
该步骤的具体实施方法为：
[0080]
将步骤(4)的1.5g纳米粒子分散在100ml无水甲醇中，然后置入冰浴中，在氮气保护下加入1ml三乙胺，并缓慢滴加1ml 2-溴异丁酰溴，冰浴中搅拌12h后得到的产物以13000rpm的转速离心10min，所得沉淀用甲醇洗涤，重复三次，得到表面引入二硫键且末端为溴原子的二氧化硅纳米粒子。
[0081]
(6)二氧化硅表面的atrp聚合反应将含氟聚离子液体(聚合单体)接枝到表面引入二硫键且末端为溴原子的二氧化硅纳米粒子的表面，其中含氟离子液体的化学结构式如下所示：
[0082][0083]
该步骤的具体实施方法为：
[0084]
将步骤(5)的1g纳米粒子分散于20ml纯水中，然后置于冰浴中；向纯水中通入氮气鼓泡并保持磁子搅拌，加入2g含氟聚离子液体，33μl配体(n,n,n,n,n-五甲基二亚乙基三胺)，3mg溴化铜，鼓泡30min后再加入26.4mg溴化亚铜，密封，换气三次，将温度提高至60℃，搅拌24h后得到的产物以13000rpm的转速离心10min，所得沉淀用水洗涤，重复三次，得到表面接枝含氟离子液体的二氧化硅纳米粒子。
[0085]
(7)将聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯接枝到表面接枝含氟离子液体的二氧化硅纳米粒子表面
[0086]
该步骤的具体实施方法为：
[0087]
将步骤(6)的纳米粒子分散于20ml纯水中，然后置于冰浴中，向纯水中通入氮气鼓泡并保持磁子搅拌，加入2ml聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯，33μl配体(n,n,n,n,n-五甲基二亚乙基三胺)，3mg溴化铜，鼓泡30min后再加入26.4mg溴化亚铜，密封，换气三次，将温度提高至60℃，搅拌24h后得到的产物以13000rpm的转速离心10min，所得沉淀用水洗涤，重复三次，最终得到具有gsh响应性的
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f mri纳米粒子造影剂n。
[0088]
实验例1性能测试
[0089]
(1)对实施例1制备的
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f mri纳米粒子造影剂n进行200kv透射电子显微镜扫描，得到的tem图像如图3所示。
[0090]
图3的tem显示，该方法制备得到的
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f mri纳米粒子探针具有明显的聚合物包裹二氧化硅纳米粒子的结构。
[0091]
(2)对实施例1制备的
19
f mri纳米粒子进行粒径分布测试
[0092]
将实施例1制备的
19
f mri纳米粒子重悬在纯水中，稀释得到50μg/ml的分散液，利
用动态光散射法测量其粒径分布，所得的分布图像如图4所示。
[0093]
图4显示，该方法得到的
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f mri纳米粒子的平均水合粒径为171.6nm，分散性良好。
[0094]
(3)对实施例1制备的
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f mri纳米粒子进行
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f nmr检测
[0095]
具体实施方法为，将10mg实施例1制备的
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f mri纳米粒子分散在1ml纯水中，然后利用bruker核磁共振仪对纳米粒子分散液进行
19
f nmr检测，检测结果如图5所示。
[0096]
图5的结果显示，该方法制得的
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f mri纳米粒子在-149.5ppm的化学位移处有明显的特征峰。
[0097]
(4)测量实施例1制得的
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f mri纳米粒子在加入dtt粉末前后的t2弛豫时间
[0098]
具体实施方法为，将
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f mri纳米粒子分散于1ml纯水中制成浓度为10mg/ml的分散液，然后利用bruker核磁共振仪测量
19
f mri纳米粒子的t2弛豫时间，再往分散液中加入5mg二硫苏糖醇(dtt)，放置24h后再次利用自旋回波法测量分散液的t2弛豫时间，结果分别如图6和图7所示。
[0099]
图6和图7的结果显示，该方法制备的
19
f mri纳米粒子具有较小的t2弛豫时间，原因在于氟原子被接枝在二氧化硅粒子表面，其活动性受到较大程度的影响。当加入dtt后，氟原子从二氧化硅纳米粒子表面脱落，其活动性大幅提高，因此t2弛豫时间大幅延长。
[0100]
(5)利用mtt法对实施例1制备的
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f mri纳米粒子进行细胞毒性检测
[0101]
具体实施方法为：用含有10％的fbs、1％双抗(100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的dmem高糖培养基培养hela/huvec细胞。然后以约10000cfu/ml的细胞密度将hela/huvec细胞接种到96孔细胞培养板中，为确保细胞贴壁，将培养板置于37℃下培养15h。随后加入不同量(5、1、0.8、0.5、0.25、0.1mg/ml)的
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f mri纳米粒子于37℃且二氧化碳浓度为5％的条件下分别培养24小时和48小时。之后向每孔中加入20μl四甲基噻唑基四唑(mtt)溶液(5mg/ml)，并将孔板置于37℃的培养箱中继续培养，大约4小时后，将培养液吸出，每孔加入120μl二甲基亚砜(dmso)。最后用酶标仪测量各培养液在492nm处的吸光度数值。实验结果如图8所示。
[0102]
图8的结果显示，该方法制备的
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f mri纳米粒子在5mg/ml浓度时对huvec细胞具有较低的细胞毒性，细胞存活率低于80％；而对hela细胞则没有明显的细胞毒性，在设置组的浓度梯度下该细胞的存活率均高于80％。
[0103]
(6)将实施例1制备的
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f mri纳米粒子制备成不同浓度(200、100、50、25、10、5mg/ml)的分散液，并在加入dtt前后对其进行体外
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f mri，检测结果如图9所示。
[0104]
图9的结果显示，在加入dtt前，无论纳米粒子的浓度有多高，即使是200mg/ml,也没有明显的
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f mri信号，原因在于其具有过小的t2弛豫时间；而在加入dtt后，由于t2弛豫时间有大幅的提高，其
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f mri信号也被放大，成像信号较为明显。
[0105]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。