地顶孢霉培养物的应用

1.本公开属于微生物领域，具体涉及地顶孢霉培养物用于提高动物胃肠道中普拉梭菌的应用；地顶孢霉培养物用于改善动物胃肠道中炎症的应用。


背景技术：

2.普拉梭菌与炎症性肠病患者病变存在相关联系，普拉梭菌的减少与炎症性肠病患者病变程度呈正相关，普拉梭菌可上调tj蛋白表达降低肠道黏膜的通透性，可以构建上皮厌氧屏障保护肠黏膜，并可产丁酸减轻肠道炎症。


技术实现要素：

3.有鉴于此，第一方面本技术提供了地顶孢霉培养物用于提高动物胃肠道中的普拉梭菌的应用，所述应用用于非治疗作为目的，进行改良动物胃肠道中炎症。
4.有鉴于此，第二方面本技术提供了地顶孢霉培养物在饲料添加剂或药物的应用，所述应用用于非治疗作为目的，所述饲料添加剂用于提高提高动物胃肠道中的普拉梭菌。
5.有鉴于此，第三方面本技术提供了地顶孢霉培养物用于改善动物胃肠道中炎症的应用，所述应用用于非治疗作为目的，所述地顶孢霉培养物用于提高动物胃肠道中的普拉梭菌，进行改良动物胃肠道中炎症。
6.可选的，根据第一方面、第二方面和第三方面的应用，所述动物为鸡或者猪。
7.可选的，根据第一方面、第二方面和第三方面的应用，所述地顶孢霉培养物中含有以下有效物质，所述有效物质的含量为：0.001～5％的腺苷，0.002％～4％的麦角甾醇，0.002％～4％的鸟苷，0.002％～4％的尿苷，0.002～10％的虫草多糖。
8.可选的，根据第一方面、第二方面和第三方面的应用，所述地顶孢霉培养物通过液体发酵或者固体发酵得来。
9.可选的，根据第一方面、第二方面和第三方面的应用，所述地顶孢霉培养物通过液体发酵包括以下步骤：
10.地顶孢霉菌接种至试管培养基内进行培养，所述试管菌种培养基培养后的地顶孢霉菌种接种至摇瓶培养基进行培养，所述摇瓶培养基培养后的地顶孢霉菌种接种至发酵罐培养基进行培养，所述发酵罐菌种培养结束后将发酵液泵出，离心后干燥粉碎，形成地顶孢霉培养物。
11.可选的，根据第一方面、第二方面和第三方面的应用，所述地顶孢霉培养物通过固体发酵包括以下步骤：
12.地顶孢霉菌进行接种至试管菌种培养基内进行培养，所述试管菌种培养基培养后的地顶孢霉菌种进行接种至摇瓶菌种培养基进行培养，所述摇瓶菌种培养基培养后的地顶孢霉菌种进行接种至发酵罐菌种培养基进行培养，发酵罐菌种接种至固体培养基中进行培养，培养结束后培养物进行干燥粉碎，形成地顶孢霉培养物。
13.可选的，所述试管培养基、所述摇瓶培养基和所述发酵罐培养基中的碳源为：牛肉
膏、蛋白胨、花生饼粉、氨基酸、明胶、葡萄糖、蔗糖、淀粉、糖蜜、乳清中的一种或几种。
14.可选的，所述试管培养基、所述摇瓶培养基和所述发酵罐培养基中的氮源为：牛肉膏、酵母膏、黄豆粉、饼粕粉、蚕蛹粉、尿素、蛋白胨、明胶中的一种或几种。
15.可选的，所述固体培养基的碳源或者氮源为：玉米粉、米粉、豆粕、蚕蛹粉、麸皮、豆壳、秸秆、稻壳粉、稻谷、鱼粉中的一种或几种。
16.本技术具有下面一个或者多个有益效果：
17.本技术地顶孢霉培养物或者地顶孢霉培养物用于提高动物胃肠道中普拉梭菌的应用；地顶孢霉培养物在饲料添加剂或药物的应用；地顶孢霉培养物用于改善动物胃肠道中炎症的应用。
具体实施方式
18.下面将对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本公开保护的范围。
19.本技术公开了地顶孢霉培养物在提高普拉梭菌含量的应用。本技术还公开了上述地顶孢霉培养物在制备药物、饲料、饲料添加剂或保健品中的用途。地顶孢霉培养物能够有效地提高普拉梭菌的含量。
20.本技术公开了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂是通过添加有地顶孢霉培养物的干粉或者液体形态，需要说明的是，本技术的饲料添加剂，是广义上的以任何形态存在的饲料添加剂，但是是以非治疗作为目的，为了提高改善或者保健作用；强化的方法：在原料或必要的食物中添加，如0.001～3％的比例的地顶孢霉培养物的干粉添加到全价饲料中进行使用；在饲料加工过程中添加；在成品中加入；用生物学方法添加；用物理化学方法添加；添加形式：(1)干式混合：比如称取地顶孢霉培养物1kg，添加到1吨的全价饲料中(0.1％比例添加)，逐级混合均匀，直接饲喂；(2)制成溶液:按照0.1％的比例称取所需的地顶孢霉培养物溶解于水中，搅拌均匀后，供动物饮用，地顶孢霉培养物以液体形态添加，如：按照0.1％的比例称取所需的地顶孢霉培养物溶解于水中；或者其他添加方式。
21.通过含有地顶孢霉培养物的饲料添加剂能够提高动物的胃肠道中普拉梭菌含量，从而减轻肠道炎症。
22.关于地顶孢霉培养物的获得，具体是以地顶孢霉培养物的形式进行采购得来或者地顶孢霉菌通过固体发酵或者液体发酵形式而得，针对于地顶孢霉菌在市场上采购得来，为了便于阐述以及验证，本技术的所阐述的地顶孢霉菌，采购于中国科学院微生物研究所，具体在2018年8月4日保藏于中国科学院微生物研究所，这个只是地顶孢霉菌一个采购渠道，当然也可以从其他渠道进行采购；关于地顶孢霉培养物的采购，也可从以下厂家采购，如：广东容大生物股份有限公司等。
23.针对于地顶孢霉培养物的制备方法明细：
24.利用液体培养进行培养地顶孢霉培养物的制备方法，包括以下步骤：发酵菌液：地顶孢霉菌(acremonium terricola)于2018年8月4日保藏于中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc7.357的地顶孢霉菌；
25.试管菌种：试管培养基为：琼脂2％，蛋白胨10％，葡萄糖20％，121℃灭菌20min。冷却后三点式接种，放置于25℃生化培养箱进行培养5-7天。
26.如在实施例中，可选取试管菌种：试管菌种培养基为：琼脂20g/l，蛋白胨100g/l，葡萄糖200g/l，121℃灭菌20min。冷却后三点式接种，放置于25℃生化培养箱进行培养5-7天。
27.摇瓶菌种：摇瓶菌种培养基为：土豆粉10％，葡萄糖5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.5％。121℃灭菌20min。冷却后用试管菌种进行接种，放置于25℃震荡培养箱进行培养5-7天。
28.如在实施例中，可选取摇瓶菌种：摇瓶菌种培养基为：土豆粉100g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾5g/l，硫酸镁5g/l。121℃灭菌20min。冷却后用试管菌种进行接种，放置于25℃震荡培养箱进行培养5-7天。
29.发酵罐菌种：发酵罐菌种培养基为：土豆粉10％，葡萄糖5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.5％，发酵罐容积200l。121℃灭菌30min。冷却后用200ml摇瓶菌种接种，环境温度26℃，培养过程中进行通气培养48小时。
30.如在实施例中，可选取发酵罐菌种培养基为：土豆粉100g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾5g/l，硫酸镁5g/l，发酵罐容积200l。121℃灭菌30min。冷却后用200ml摇瓶菌种接种，环境温度26℃，培养过程中进行通气培养48小时。
31.液体菌丝制作：发酵罐培养结束后将发酵液泵出，离心后取下层菌丝进行烘干，烘干温度80～85℃，烘干后的菌丝体水分控制在8％以下，进行粉碎包装待用。
32.液体发酵菌丝得到的地顶孢霉培养物的有效成分含量如表1所示：
33.表1地顶孢霉培养物的有效成分含量
34.指标含量腺苷(mg/kg)812麦角甾醇(mg/kg)1008多糖(％)3.4尿苷(mg/kg)987鸟苷(mg/kg)913
35.利用固体培养进行培养地顶孢霉培养物的制备方法，包括以下步骤：
36.发酵菌液：地顶孢霉菌(acremonium terricola)于2018年8月4日保藏于中国科学院微生物研究所；
37.试管菌种：试管菌种培养基为：琼脂2％，蛋白胨10％，葡萄糖20％，121℃灭菌20min。冷却后三点式接种，放置于25℃生化培养箱进行培养5-7天。
38.如在实施例中，可选取试管菌种：试管菌种培养基为：琼脂20g/l，蛋白胨100g/l，葡萄糖200g/l，121℃灭菌20min。冷却后三点式接种，放置于25℃生化培养箱进行培养5-7天。
39.摇瓶菌种：摇瓶菌种培养基为：土豆粉10％，葡萄糖5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.5％，121℃灭菌20min。冷却后用试管菌种进行接种，放置于25℃震荡培养箱进行培养5-7天。
40.如在实施例中，可选取摇瓶菌种：摇瓶菌种培养基为：土豆粉100g/l，葡萄糖50g/
l，磷酸氢二钾5g/l，硫酸镁5g/l。121℃灭菌20min。冷却后用试管菌种进行接种，放置于25℃震荡培养箱进行培养5-7天。
41.发酵罐菌种：发酵罐菌种培养基为：土豆粉10％，葡萄糖5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.5％，发酵罐容积200l。121℃灭菌30min。冷却后用200ml摇瓶菌种接种，环境温度26℃，培养过程中进行通气培养48小时。
42.如在实施例中，可选取发酵罐菌种培养基为：土豆粉100g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾5g/l，硫酸镁5g/l，发酵罐容积200l。121℃灭菌30min。冷却后用200ml摇瓶菌种接种，环境温度26℃，培养过程中进行通气培养48小时。
43.发酵罐菌种接种到已灭菌冷却后的固体培养基中进行培养，接种量为10％,接种完的物料放置于编织袋中进行培养，房间温度维持在25℃,培养96小时后，将物料进行干燥，热风循环烘箱温度控制在85～90℃，最终物料水分控制在8％以下，60目粉碎包装待用。
44.其中，固体发酵培养基为玉米粉20％，米粉10％，豆粕15％，蚕蛹粉30％，麸皮15％，豆壳10％,脉动真空灭菌121℃下保持90min，灭菌后冷却。
45.如在实施例中，可选取固体发酵培养基为玉米粉200g/kg，米粉100g/kg，豆粕150g/kg，蚕蛹粉300g/kg，麸皮150g/kg，豆壳100g/kg，脉动真空灭菌121℃下保持90min，灭菌后冷却。
46.固体发酵得到的地顶孢霉培养物有效成分含量如表2所示：
47.表2地顶孢霉培养物有效成分含量
48.指标含量腺苷(mg/kg)1035麦角甾醇(mg/kg)1952多糖(％)4.5尿苷(mg/kg)1518鸟苷(mg/kg)1078
49.动物试验验证：
50.猪上使用的实例
51.动物模型建立：猪，40头，分为4组，每组10只，分别设置对照组和试验组。试验组和对照组每日饲料的喂食量，其中试验组地顶孢霉培养物以饲料添加剂的形式进行添加，添加比例0.001％，0.1％，3％，其他条件试验组和对照组保持一致；分栏喂养，喂养21天后，取其粪便，过16s基因组测序，16s基因测序方法如下：dna样品被接收后，对样品进行检测；检测合格的样品构建文库：回收目的amplicon片段，用t4 dna polymerase、klenow dna polymerase和t4pnk将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3'端加碱基“a”，使得dna片段能与3'端带有“t”碱基的特殊接头连接；或者设计合成含有测序接头的双index融合引物，以基因组dna为模板，进行融合引物pcr，磁珠筛选目的amplicon片段，最后，用合格的文库进行cluster制备和测序。用下机得到的数据进行相应的生物信息分析，得到如下结果：
52.地顶孢霉培养物不同添加比例对普拉梭菌菌群丰度影响，如表3所示：
53.表3地顶孢霉培养物不同添加比例对猪的胃肠道普拉梭菌菌群丰度影响
[0054][0055]
从以上试验可以看出，地顶孢霉培养物作为饲料添加剂，确实可以提高猪胃肠道中普拉梭菌的含量，且差异显著。
[0056]
在鸡上使用的实例：
[0057]
鸡试验组与对照组：鸡16栏，四栏为一组，每栏7只，分别设置对照组和试验组。试验组和对照组每日饲料的喂食量，其中试验组地顶孢霉培养物以饲料添加剂的形式进行添加，添加比例0.001％，0.1％，3％，其他条件试验组和对照组保持一致；分栏喂养，喂养21天后，取其粪便，过16s基因组测序，16s基因测序方法如下：dna样品被接收后，对样品进行检测；检测合格的样品构建文库：回收目的amplicon片段，用t4 dna polymerase、klenow dna polymerase和t4 pnk将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3'端加碱基“a”，使得dna片段能与3'端带有“t”碱基的特殊接头连接；或者设计合成含有测序接头的双index融合引物，以基因组dna为模板，进行融合引物pcr，磁珠筛选目的amplicon片段，最后，用合格的文库进行cluster制备和测序。用下机得到的数据进行相应的生物信息分析，得到如下表4所示：
[0058]
表4地顶孢霉培养物不同添加比例对鸡的胃肠道普拉梭菌菌群丰度影响
[0059][0060]
从以上试验可以看出，地顶孢霉培养物作为饲料添加剂，确实可以提高鸡胃肠道中普拉梭菌的含量，且差异显著。
[0061]
当然上述仅仅验证了地顶孢霉培养物能提高猪和鸡的胃肠道中普拉梭菌菌群丰度，由于不能穷举，不能作为限定地顶孢霉培养物仅仅作用于猪和鸡的胃肠道中普拉梭菌菌群，在实际运用中，还可以进行作用于牛或者宠物等。
[0062]
地顶孢霉菌属虫草类真菌，其地顶孢霉培养物能提高猪和鸡的胃肠道中普拉梭菌菌群丰度，其他类虫生真菌类真菌培养物(如：冬虫夏草、古尼虫草、蝙蝠蛾拟青霉、蛹虫草、蝉花虫草、广东虫草等)可能也能提高猪和鸡的胃肠道中普拉梭菌菌群丰度，同样，地顶孢霉培养物可能也可以提高其他动物胃肠道中普拉梭菌的菌群丰度。
[0063]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本公开的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0064]
以上显示和描述了本公开的基本原理、主要特征和本公开的优点。本行业的技术人员应该了解，本公开不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本公开的原理，在不脱离本公开精神和范围的前提下，本公开还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本公开范围内。