千金藤素用于制备治疗类风湿关节炎药物的用途

1.本发明涉及中药材千金藤的活性成分千金藤素的新用途，尤其是用于制备治疗类风湿关节炎的药物的用途，属中药领域。


背景技术：

2.类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, ra)是临床上常见的一种以滑膜炎为主要特征的慢性、自身免疫性疾病。who统计数据表明全球约1%的人口罹患ra。其主要病理改变包括滑膜炎和关节部位骨与软骨的破坏，后者是造成关节进行性强直、畸形、功能障碍乃至残疾的直接原因。ra严重危害了人类健康，降低人民生活质量。目前，ra的治疗以减轻疼痛，控制炎症，改善关节功能和保护器官为主，主要措施包括药物治疗、免疫净化和外科手术治疗，其中药物治疗是最重要且应用最广泛的方法。临床上常用药物包括非甾体类抗炎药（如洛索洛芬）、糖皮质激素类药物（如强的松）、免疫抑制剂（如甲氨蝶呤）和生物制剂（如益赛普、阿达木单抗）。但是，这些药物的使用不可避免产生一些副作用，非甾体类抗炎药会导致胃肠道不适、溃疡，激素使用不当会导致骨质疏松、机会性感染等，免疫抑制剂和生物制剂全面抑制免疫而易致患者感染。所以有必要寻求一种安全有效的药物，在控制炎症同时保护关节骨与软骨。
3.千金藤为防己科植物千金藤（stephania cepharantha）的根或茎叶，是我国传统中药材之一。其性寒，味苦，具有抗肿瘤、抗病毒、升白细胞之功，多用于肿瘤、病毒感染、毒蛇咬伤、脱发和放化疗导致的白细胞减少症等，且鲜有副作用报道。此外，千金藤亦用作民间治疗风湿痹症的重要药材。千金藤的茎和根中含有多种生物碱类，其中重要活性成分之一为千金藤素（cepharanthine，cep）。由千金藤提取出的千金藤素是双苄基异喹啉类化合物，分子式为c
37h38
o9，分子量为606.71，其结构如下：近代药理研究表明，cep具有较强的抗炎作用。在小鼠脂多糖诱导的急性肺损伤模型中，cep可减轻小鼠的病理变化，减少多种炎症细胞因子如肿瘤坏死因子（tnf）-α、白细胞介素（il）-1β和il-6的表达。cep可抑制小胶质细胞的激活和nlrp3炎症小体诱导的炎症，抑
制氧化应激，在脑缺血再灌注损伤模型中表现出一定的治疗效果。同时，cep的抗炎作用也可保护组织和细胞，减缓疾病进程。在干燥综合征中，cep可抑制tnf-α诱导的基质金属蛋白酶（mmp）-9形成，保护腺细胞及腺体的功能。此外，cep可抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移能力，抑制巨噬细胞的活化和表达诱导型一氧化氮合酶（inos）和环氧合酶（cox）-2，具有一定的抗动脉粥样硬化的作用。cep可通过调控nf-κb和nfat细胞信号通路而抑制破骨细胞的形成，从而有用于破骨性疾病的潜能。上述信息提示cep可能具有抗炎和免疫调节作用，具备治疗类风湿关节炎的潜在疗效。然而未见有cep作为抗风湿药在关节炎动物疾病模型上或临床应用方面的研究。


技术实现要素：

4.本发明提供了千金藤素的新用途，即在制备治疗抗类风湿关节炎药物中的应用。
5.千金藤素是从中药材千金藤中提取得到的双苄基异喹啉类化合物。
6.本发明以胶原诱导的关节炎小鼠模型（一种世界公认的类风湿关节炎实验动物模型）和类风湿关节炎患者的成纤维样滑膜细胞为研究对象，观察千金藤素对类风湿关节炎的治疗作用。实验证明：（1）腹腔注射千金藤素（5 mg/kg），能够明显抑制胶原诱导关节炎小鼠关节发生炎症，阻止骨质破坏；（2）千金藤素对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的细胞活力、迁移能力及信号转导有一定的抑制作用。基于以上研究结果，本发明证实了千金藤素具有治疗类风湿关节炎的功效，可用于制备治疗类风湿关节炎等炎症性疾病的药物。
附图说明
7.图1是千金藤素对胶原诱导关节炎模型小鼠关节评分的影响图2是正常小鼠后爪图图3是胶原诱导关节炎小鼠后爪图图4是千金藤素治疗组胶原诱导关节炎模型小鼠后爪图图5是正常小鼠膝关节micro-ct影像图图6是胶原诱导关节炎模型小鼠膝关节micro-ct影像图图7是千金藤素治疗组胶原诱导关节炎模型小鼠膝关节micro-ct影像图图8是正常小鼠膝关节组织切片he染色光镜图（25
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）图9是胶原诱导诱导关节炎模型小鼠膝关节组织病理切片he染色光镜图（25
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）图10是千金藤素治疗胶原诱导关节炎模型小鼠膝关节组织病理切片he染色光镜图（25
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）图11是小鼠膝关节组织切片病理评分图图12是正常小鼠膝关节组织切片番红-固绿染色光镜图（25
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）图13是胶原诱导诱导关节炎模型小鼠膝关节组织病理切片番红-固绿染色光镜图（25
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）图14是千金藤素治疗胶原诱导关节炎模型小鼠膝关节组织病理切片番红-固绿染色光镜图（25
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）图15是千金藤素对类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞细胞活力的影响图16是千金藤素对类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞迁移功能的影响
图17是千金藤素对类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞信号转导通路激活的影响。
具体实施方式
8.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
9.（一）实验方法1. 关节炎造模和给药将溶解的2mg/ml牛ii型胶原与等体积完全（初次免疫）或非完全（第二次免疫）弗氏佐剂反复乳化，制成含牛ii型胶原1mg/ml的乳化液，以备造模使用。将8周龄雄性dba1/j小鼠21只，随机均分为三组：正常对照组、模型组和千金藤素治疗组。小鼠尾根靠后1-2cm处皮内注射上述乳化液0.1ml进行初次免疫，注射当天记做d 0天。初次免疫20天后，用同样方法进行第二次免疫。对照组小鼠皮内注射等量的生理盐水。胶原诱导的关节炎（collagen-induced arthritis, cia）造模后开始腹腔注射千金藤素（5mg/kg），每天连续给药至实验结束。
10.2. 关节炎的临床及病理评估每日评估小鼠关节炎发展情况，并采用双盲法对关节肿胀程度评分，标准如下：0分=无变化；1分=足部红肿或关节结节增大；2分=足部出现轻微的肿胀和红斑；3分=足部出现明显的肿胀和红斑；4分=足部出现严重的肿胀或强直变形。四足的临床积分之和作为每个小鼠关节炎评分，每只小鼠最高积分为16分。造模后第40天处死小鼠，做如下处理：1）对小鼠右膝关节进行micro-ct检查。2）取小鼠左膝关节，常规方法甲醛固定、脱钙，石蜡包埋切片（5 μm），苏木精-伊红染色（h&e）和番红-固绿染色，中性树脂封片。关节病理损伤指数如下：0分=正常；1分=轻度滑膜炎；2分=严重滑膜炎伴血管翳形成；3分=关节软骨破坏；4分=骨破坏。
11.3. 类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖实验分离培养类风湿关节炎（rheumatoid arthritis， ra）患者的成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, fls），取对数期增长的ra fls 3-8代用于实验。ra fls铺于96孔板，37℃ 5% co2孵育12h后弃上清，再分别加入二甲基亚砜（dmso）和不同浓度的千金藤素（20μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg/ml, 2.5 μg/ml, 1.25 μg/ml, 0.625 μg/ml, 0.313 μg/ml），每孔100ul，每组设3-5个复孔。孵育24或48小时后加入cck-8试剂，在酶联免疫检测仪上od450nm处测量各孔吸光度值，以了解千金藤素对ra fls细胞活力的影响。
12.4. 类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞迁移实验采用“划痕实验”评价千金藤素对ra fls迁移能力的影响。首先将处于对数生长期的ra fls接种于12孔板（1
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5 /孔），使细胞结合度达到90-100%。在划痕前2h用不同浓度的千金藤素处理细胞，对照组用同样体积的dmso。使用200μl枪尖对铺满ra fls的板底进行划痕，然后用pbs小心清洗3遍。然后向对应孔中分别加入低血清培养基（含2% 胎牛血清fbs的dmem），低血清培养基补充刺激剂——肿瘤坏死因子（tnf）-α（10ng/ml）、tnf-α（10ng/ml）+cep（5 μg/ml, 2.5 μg/ml, 1.25 μg/ml）或cep（5 μg/ml, 2.5 μg/ml, 1.25 μg/ml）。在5%co2 37℃条件下孵育，分别在0h、6h、12h和24h于倒置显微镜下观察并采集图片，观察cep对ra fls迁移能力的影响。
13.5. 类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞信号分子检测通过检测细胞信号转导通路了解cep对ra fls激活的影响。ra fls接种6孔板，每孔2
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105 cells，使细胞结合度达到80-90%。在刺激前用含0.1% fbs的培养基饥饿2h，药物处理组加入合适浓度的cep预处理。然后加入tnf-α（10ng/ml）刺激细胞15-20分钟，然后立即吸取培养基，用pbs洗2遍，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的ripa裂解液裂解细胞，提取蛋白。用bca法检测蛋白浓度，然后用western blot检测细胞信号转导分子如erk1/2和jnk的磷酸化水平。
14.（二）实验结果1. 千金藤素对胶原诱导的关节炎模型小鼠临床评分的影响由图1至图4可见，与对照组相比，模型组小鼠关节的后爪显著红肿，关节评分明显增加，差异有统计学意义（p《0.05）。而千金藤素治疗组小鼠较模型组小鼠的后爪仅有轻微发红和肿胀，在关节评分上显著降低（p《0.05）。结果表明，千金藤素能明显减轻胶原诱导关节炎模型小鼠关节的炎症程度，降低关节的临床评分。
15.关节影像学检测由图5至图7可见，模型组小鼠的膝关节较对照组小鼠有明显的骨质破坏，表面呈凹凸不同；而千金藤素治疗组小鼠膝关节较模型组骨质破坏显著降低，十分接近对照组。结果提示千金藤素治疗组能有效保护关节骨的完整性，减少骨质流失和破坏。
16.关节病理学检测如图8至图11所示，正常组小鼠膝关节软骨两侧覆有1-3层正常滑膜细胞，关节软骨和骨质无破坏。模型组小鼠关节滑膜显著增厚，且滑膜内有多处炎细胞浸润和小血管形成。而千金藤素治疗组小鼠关节滑膜增生明显下降，炎症细胞浸润面积较模型组小鼠显著减少。由图11可见，模型组小鼠关节炎病理评分较正常对照组显著升高，差异有统计学意义（p《0.01）。较模型组小鼠而言，千金藤素治疗组小鼠关节炎病理评分明显降低，且具有统计学差异（p《0.05）。由图12-14可见，正常组小鼠膝关节表面软骨完整且均匀，模型组小鼠膝关节炎软骨层被侵蚀变薄，表面凹凸不平。千金藤素治疗组小鼠膝关节软骨层未见明显侵蚀现象，与正常组接近。结果表明千金藤素可有效抑制关节滑膜增生，炎症细胞浸润以及关节软骨和骨质破坏，起到保护关节的作用。
17.成纤维样滑膜细胞细胞活力检测如图15所示，千金藤素对ra fls的细胞活力有一定的抑制作用，且呈浓度依赖性。48小时时，千金藤素的浓度在0.625 μg/ml及以上时，ra fls细胞活力显著受抑（p《0.05）。而24小时时，千金藤素的浓度在2.5 μg/ml及以上时，ra fls细胞活力显著受抑（p《0.05）。结果表明，千金藤素对ra fls细胞活力有一定的抑制作用。
18.成纤维样滑膜细胞迁移能力检测如图16所示，24小时后，千金藤素在三种浓度下均抑制了tnf-α诱导下ra fls的迁移距离，差异有统计学意义（p《0.05）。且随着千金藤素浓度的升高，ra fls迁移能力逐渐减弱。结果表明，千金藤素对ra fls细胞迁移能力有一定的抑制作用。
19.成纤维样滑膜细胞细胞信号转导通路检测如图17所示，tnf-α刺激的ra fls中jnk、erk1/2显著磷酸化，表明两条信号转导通路被激活。而两种浓度的千金藤素均显著抑制了tnf-α刺激下ra fls中jnk、erk1/2的磷酸
化水平，提示千金藤素可通过拮抗jnk、erk1/2通路来抑制ra fls的激活。