PMX-53多肽在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用

pmx-53多肽在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用
技术领域：
1.本发明属于医药领域，具体涉及pmx-53多肽在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。


背景技术：

2.非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，nafld)是排除酒精及病毒引起的一类肝脏疾病，它是一种从单纯脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，nafl)发展到脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，nash)、肝纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌的临床综合征。近年，随着人们生活方式、饮食习惯等改变，我国nafld发病率呈逐年上升趋势，已成为第二大慢性肝病。nash是nafld的关键病理类型，可进展为预后较差肝硬化、肝癌。目前nash的发病机制并未完全阐明，缺乏有效治疗药物。
3.pmx-53，分子式c
47h65n11
o7，肽链片段为ac-phe-cyclo(orn-pro-d-cha-trp-arg)，具有抗炎，抗癌和保护神经元等作用，但在nash中的治疗效果未见报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供pmx-53多肽在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
5.为了探究补体c5及其受体c5ar1在nash进展中的作用及临床意义，我们制备了小鼠nash模型，并对肝功能、脂肪变性、炎症、补体激活等指标进行了检测，结果显示：实验组小鼠血清中谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)都显著升高；肝脏出现明显地脂肪变性；肝组织中甘油三酯(tg)和胆固醇(cho)明显升高；血清中白介素6(il-6)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、补体c5a水平明显上升(图1)。利用补体c5基因敲除(c5-/-)小鼠构建nash模型，我们发现：与对照组比，c5缺失小鼠肝功能指标alt和ast下降；h&e和油红o病理结果显示肝脏的脂肪变减轻，肝组织中甘油三酯(tg)降低；肝组织中脂肪合成相关基因表达降低，而脂肪β氧化相关基因表达明显上调，肝组织中的炎症因子表达下降(图2)。前期实验结果表明补体c5缺失可以抑制nash进展，具有保护作用。进一步探究发现补体c5是通过c5ar1通路促进nash的损伤，特异性抑制c5ar1可以显著降低nash的脂肪变和炎症反应(图3)。这些结果表明c5ar1特异性抑制剂pmx-53处理可以减轻小鼠非酒精性脂肪性肝炎。
6.因此，本发明提供了pmx-53多肽在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
7.优选，所述的pmx-53多肽在降低非酒精性脂肪性肝炎的脂肪变和炎症反应的药物中的应用。
8.优选，所述的pmx-53多肽通过特异性抑制c5ar1进一步下调脂肪合成相关基因srebf1、acc和fasn在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
9.优选，所述的pmx-53多肽通过特异性抑制c5ar1进一步下调炎症相关因子il-6和tnf-α表达在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
10.本发明的第二个目的是提供一种非酒精性脂肪性肝炎药物，其含有pmx-53多肽作为活性成分，所述的pmx-53多肽的肽链片段为ac-phe-cyclo(orn-pro-d-cha-trp-arg)。
11.优选，所述的非酒精性脂肪性肝炎药物是利用pmx-53多肽特异性抑制c5ar1从而降低非酒精性脂肪性肝炎的脂肪变和炎症反应的药物。
12.本发明用pmx-53抑制剂处理后，从h&e和油红o染色图可以看到，nash小鼠的肝细胞中脂滴数量减少，并且脂滴变小，肝脏脂肪变明显减轻(图3a)；定量pcr结果显示脂肪合成相关基因srebf1、acc和fasn表达显著下降(图3b)，进一步用wb确认，图3c结果表明小鼠肝组织中脂肪合成相关的蛋白acc和fasn都降低；定量pcr和elisa检测肝组织，显示炎症相关因子il-6和tnf-α表达明显下调(图3d和e)。这些结果表明c5ar1特异性抑制剂pmx-53处理可以减轻小鼠非酒精性脂肪性肝炎，因此可以将pmx-53用于制备治疗非酒精性脂肪性肝炎药物中的应用。
附图说明：
13.图1是nash小鼠的肝损伤和补体c5激活，a、h&e和油红o染色；b、血清alt和ast；c、肝组织的甘油三酯水平；d、肝组织的胆固醇水平；e、血清il-6和tnf-α水平；f、血清补体c5a水平；
14.图2是补体c5敲除减轻nash小鼠肝脏的脂肪变和炎症反应，a、h&e和油红o染色；b、肝组织中甘油三酯；c、肝重/体重比；d和e、肝组织中脂肪代谢通路相关基因检测；f、肝组织中炎症因子检测；
15.图3是受体c5ar1抑制剂pmx-53处理减轻小鼠肝脏脂肪变和炎症反应，a、h&e和油红o染色；b、定量pcr检测肝组织脂肪合成相关因子；c、western blot检测脂肪合成相关蛋白；d、定量pcr检测肝组织炎症因子；e、elisa检测肝组织炎症因子。
具体实施方式：
16.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
17.实施例1：
18.一、研究方法
19.(1)nash模型构建
20.野生型8周龄c57/b6雄性小鼠分组，每组6只。实验组nash小鼠给予西方饮食(wd,高糖高脂饲料加糖水)，对照组吃对照饮料。按质量分数计，高糖高脂饲料含14％蛋白质、42％脂肪、44％碳水化合物，在此基础上另加0.2％胆固醇(中国南通特洛菲饲料科技有限公司生产)，糖水含42g/l的碳水化合物(其中55％果糖和45％蔗糖，按重量比混合在饮用水中)；对照小鼠吃对照饲料(nd)，按质量分数计，对照饲料含20.6％蛋白质、12％脂肪、67.4％碳水化合物(中国南通特洛菲饲料科技有限公司生产)，饮用水为灭菌纯水。喂养12周，造模结束，异戊烷麻醉小鼠后处死，收集血清，检测肝功能指标(ast和alt)，炎症因子(il-6、tnf-α等)，甘油三酯、补体(c5a)等；取肝组织制备蜡块，用h&e检测肝组织形态；新鲜肝组织进行冰冻切片，用油红o染色检测脂肪变性；取小鼠肝组织提取rna和总蛋白，检测肝脏组织脂代谢基因(srebp，fas，acc，ppar-α等)，炎症因子(il-6，tnf-α，mcp1等)的表达水平；试剂盒检测肝组织中cho、tg水平等。
21.(2)补体c5在小鼠nash中的作用
22.实验组小鼠取8周c5基因敲除小鼠(c5-/-)，每组6只雄鼠；对照组小鼠为野生c57/
b10(wt)，每组6只雄鼠，2组都按nash模型进行西方饮食喂养12周。造模结束后，取血清和肝脏组织进行相关检测。
23.(3)pmx-53多肽对小鼠nash的治疗作用
24.野生型8周雄性c57/b6小鼠分组，每组6只，西方饮食12周造nash模型。在西方饮食第9周开始，实验组小鼠皮下注射pmx-53，2天注射一次，每次1.0mg/kg；对照组注射生理盐水(saline)，每2天一次，共注射4周。造模结束后，取血清和肝脏组织进行检测。
25.pmx-53(3d53)分子式c
47h65n11
o7，肽链片段为
26.ac-phe-cyclo(orn-pro-d-cha-trp-arg)，纯度》98％，由南京肽业生物科技有限公司合成。nash小鼠造模结束后，取血清和肝脏组织进行检测。
27.二、研究结果
28.1.nash小鼠的肝损伤和补体c5激活
29.野生型小鼠c57/b6分组，8周龄，每组6只雄鼠。实验组nash小鼠给予西方饮食(高糖高脂饲料加糖水)，对照小鼠吃对照饲料，喂养12周制备nash模型。造模结束，收集血清，检测肝功能指标(ast和alt)，炎症因子，补体水平等；取肝组织制备蜡块，用h&e等检测肝组织形态；新鲜肝组织进行冰冻切片，用油红o染色检测脂肪变性；研磨小鼠肝组织，试剂盒检测肝组织中tg水平等。实验结果显示：与对照组比较，从h&e和油红o染色图可以看到实验组小鼠的肝组织中有明显脂滴沉积(图1a)；肝功能指标alt和ast的值比对照组都显著升高，肝损伤加重(图1b)；肝脏组织甘油三酯(tg)和胆固醇(cho)检测结果表明，实验组tg和cho值显著上升(图1c和1d)，肝脏脂肪沉积明显；血清的炎症因子、补体c5a水平都明显上升(图1e、1f)，说明长期西方饮食可以使小鼠肝脏脂肪沉积，炎症因子以及补体也被明显激活。
30.2.补体c5缺失减轻nash损伤
31.为了进一步明确补体c5在nash中的功能，我们用c5基因敲除(c5-/-)小鼠制备nash模型，并进行检测相关因子。实验结果显示：与对照野生型小鼠比，c5-/-小鼠的肝组织h&e和油红o染色图显示实验组小鼠肝组织的脂滴数量变少，并且变小(图2a)，肝组织中tg水平也明显降低(图2b)，肝重体重比也下降(图2c)。定量pcr检测脂肪合成相关因子，结果显示脂质合成基因(acc，fasn和srebf1)表达下调(图2d)，脂肪氧化相关因子cpt1和pparα的表达上升(图2e)，同时炎性因子(il-6，tnf-α，mcp-1，ly6g，f4/80)也显著下降(图2f)。研究结果显示在nash模型中，c5缺失小鼠的肝脏脂肪变减轻，炎症因子降低，表明c5缺失对非酒精性脂肪肝炎具有保护作用。
32.3.pmx-53处理减轻nash小鼠的肝脏脂肪变和炎症反应
33.研究表明补体c5激活产物c5a主要通过其受体c5ar1在病理生理中发挥作用。pmx-53是受体c5ar1特异性抑制剂，但在非酒精性脂肪肝中的功能尚不明确。因此，我们进一步探讨pmx-53处理对非酒精性脂肪性肝炎的作用。通过野生型小鼠构建nash模型，然后利用pmx-53处理4周，再进行分析。实验结果显示：pmx-53抑制剂处理后，从h&e和油红o染色图可以看到，nash小鼠的肝细胞中脂滴数量减少，并且脂滴变小，肝脏脂肪变明显减轻(图3a)；定量pcr结果显示脂肪合成相关基因srebf1、acc和fasn表达显著下降(图3b)，进一步用wb确认，图3c结果表明小鼠肝组织中脂肪合成相关的蛋白acc和fasn都降低；定量pcr和elisa检测肝组织，结果显示炎症相关因子il-6和tnf-α表达明显下调(图3d和e)。这些结果表明c5ar1特异性抑制剂pmx-53处理可以减轻小鼠非酒精性脂肪性肝炎。