一种可释放NO的干凝胶及其制备方法和应用

chemother 2016,60(4):2185-94)。
4.尽管no对白色念珠菌具有较好的抑制效果且不易产生耐药等特性，但是将no负载于载体材料直接用于抗菌应用研究，尚存在负载量低、no缓释难调控(难持续抑菌)、材料结构与性能的关系尚不明确、载体材料的安全性存疑等问题。此外，目前尚无关于负载no的材料用于治疗外阴阴道念珠菌感染的研究报道。基于此，我们将羧甲基化壳聚糖与高代数树枝状聚酰胺-胺偶联后再负载no，从而得到一种具有较高no负载量且性能稳定的干凝胶，并对该可释放no的干凝胶的体外、体内抗菌实验进行研究，为外阴阴道念珠菌感染甚至其他真菌感染提供治疗新策略。


技术实现要素：

5.鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种可释放no的干凝胶及其制备方法和应用。
6.本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：
7.本发明的目的之一在于提供一种可释放no的干凝胶的制备方法，包括以下步骤：
8.步骤1)干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam的合成：
9.室温条件下，将羧甲基化壳聚糖(cmcs)溶解于去离子水中，然后依次加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)进行活化，活化时间为4h-8h；
10.活化结束后，加入3代树枝状聚合物pamam进行反应，室温下反应时间为12h-24h；
11.反应结束后，反应液经过透析、冷冻干燥，得到干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam；
12.步骤2)可释放no的干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam-no的合成：
13.在高压反应釜中，将步骤(1)合成的干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam用无水甲醇溶解，加入干燥的甲醇钠继续溶解；
14.用氮气排除反应釜内的空气，然后通入no气体，在5-6个大气压下，搅拌反应24h-72h；
15.反应完成后，用氮气排出未反应的no气体，取出反应产物，用无水乙醚沉降洗涤，然后室温真空干燥，得到所述一种可释放no的干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam-no。
16.进一步的，步骤1)和2)中所述室温为15℃-37℃。
17.进一步的，步骤1)中，所述羧甲基化壳聚糖的分子量为5万-10万，羧化度为60％-90％；所述羧甲基化壳聚糖的用量按每毫升去离子水配比0.02g羧甲基化壳聚糖计算；所述羧甲基化壳聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和3代树枝状聚合物pamam的摩尔比为1:1-4:1-4:1-4。
18.进一步的，步骤1)中反应液用透析袋透析48h，所述透析袋截留分子量为3000da-5000da。
19.进一步的，步骤2)所述无水甲醇按照以下操作步骤制备：将氢化钙加入到甲醇中，搅拌6h-24h，然后常压蒸馏，得到无水甲醇，所述氢化钙的加入量以每500ml甲醇中加入1g-2g计；所述干燥的甲醇钠按照以下操作步骤制备：将甲醇钠和无水氯化钙分别放置于真空干燥箱中，然后升高温度至60℃-100℃真空干燥1天-3天，最终得到干燥好的甲醇钠，所述无水氯化钙的用量以每10g干燥1g-2g甲醇钠计；所述无水乙醚按照以下操作步骤制备：：将
氢化钙加入到乙醚中，搅拌6h-24h，然后常压蒸馏，得到无水乙醚，所述氢化钙的加入量以每500ml乙醚中加入1g-2g计。
20.进一步的，步骤2)所述的干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam和甲醇钠的质量比为1:10-100；所述无水甲醇以每10ml溶解0.1g-0.5gcmcs-pamam计；
21.进一步的，步骤2)所述用氮气排除反应釜内的空气时间以及用氮气排除反应釜内的no气体时间为20min-120min；
22.进一步的，步骤2)所述产物可释放no干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam-no用无水乙醚洗涤两次后过滤，然后室温真空干燥，-10℃至-20℃低温保存。
23.本发明的另一个目的是提供上述可释放no的干凝胶的制备方法制备得到的一种可释放no的干凝胶。
24.本发明的再一个目的是提供一种可释放no的干凝胶在制备治疗外阴阴道念珠菌感染的抗菌药物中的应用。
25.本发明的突出效果为：
26.(1)本发明的一种可释放no的干凝胶及其制备方法和应用，以羧甲基化壳聚糖为主链，通过酰胺化反应将多个球形3代pamam进行交联，得到一种结构与性能稳定的干凝胶，然后作为no载体，最终得到可释放no的干凝胶，该凝胶在生理条件下不需要电子转移，辅助因子和酶参与，定点缓慢释放no气体。
27.(2)本发明采用羧甲基化壳聚糖具有很好的生物学活性，其分子结构上含有大量的羟基，具有良好的水溶性和生物相容性，且易于进行化学修饰；采用天然的羧甲基化壳聚糖进行修饰，并通过以酰胺键为干凝胶交联点，不仅可以增加干凝胶稳定性，而且极大的降低了阳离子聚合物的毒副作用；
28.(3)本发明采用的树枝状聚酰胺-胺的分子结构明确可控，可通过使用不同代数的树枝状分子调控凝胶交联点的数量，改变干凝胶孔隙率，增加机械强度，使其干凝胶3维网状结构更加致密且立体，可进一步实现对no释放的可控性，延长no释放周期，为后期no持续治疗提供结构优势；
29.(4)本发明将树枝状聚酰胺-胺与羧甲基化壳聚糖通过酰胺反应进行化学键连接，反应效率高，pamam分子结构规整，分子量分布单一，极大地增强了聚合物材料的稳定性；
30.(5))本发明的树枝状大分子支链上含有大量可修饰的基团，以此作为干凝胶中no的载药位点，同时可进一步进行化学修饰以扩展其在生物材料领域的应用，或是接枝天然化合物以提高其生物相容性；
31.(6)本发明提供的一种可释放no的干凝胶的结构明确可控，具有较好的生物相容性、稳定的no负载、较高的no储存量以及优异的抗菌性能，将会在治疗外阴阴道念珠菌感染甚至其他真菌感染方面显示出重要的应用前景。
32.以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
附图说明
33.图1为3代树枝状聚合物pamam的核磁氢谱；
34.图2为3代树枝状聚合物pamam的红外光谱图；
35.图3为干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam和可释放no的干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam-no的红外光谱图；
36.图4为本发明实施例可释放no的干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam-no在不同时间下no的累积释放量图；
37.图5为壳聚糖标准对照、cmcs-pamam、cmcs-pamam-no在不同浓度下对白色念珠菌的抑菌效果图；
38.图6为对照组、cmcs-pamam、cmcs-pamam-no对外阴阴道念珠菌的杀菌效果图；
39.图7为对照组、cmcs-pamam、cmcs-pamam-no对外阴阴道念珠菌病阴道组织的病理作用效果图。
具体实施方式
40.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
41.本发明中的室温为15℃-37℃。
42.本发明所述无水甲醇按照以下操作步骤制备：将氢化钙加入到甲醇中，搅拌6h-24h，然后常压蒸馏，得到无水甲醇，所述氢化钙的加入量以每500ml甲醇中加入1g-2g计；所述干燥的甲醇钠按照以下操作步骤制备：将甲醇钠和无水氯化钙分别放置于真空干燥箱中，然后升高温度至60℃-100℃真空干燥1天-3天，最终得到干燥好的甲醇钠，所述无水氯化钙的用量以每10g干燥1g-2g甲醇钠计；所述无水乙醚按照以下操作步骤制备：：将氢化钙加入到乙醚中，搅拌6h-24h，然后常压蒸馏，得到无水乙醚，所述氢化钙的加入量以每500ml乙醚中加入1g-2g计。
43.实施例1
44.1、3代树枝状聚合物pamam的制备
45.参照文章：a polyamidoamne dendrimer functionalized graphene oxide for dox and mmp-9 shrna plasmid co-delivery(materials science and engineering c 70(2017)572
–
585)，逐步制备3代树枝状聚合物pamam。
46.取1mg制备得到的3代树枝状聚酰胺-胺(pamam)溶解于1ml氘代重水(d2o)中，溶液澄清、透明、无悬浮物或杂质，用干净的核磁共振专用样品管于核磁共振仪(nmr-bruker-300)上检测。引用氘代溶剂残留峰：(重水4.70ppm)。实验结果如图1所示，3代树枝状聚酰胺-胺pamam的核磁峰表述如下，1h-nmr(d2o):2.52(m,n-ch
2-ch
2-n-,2h)，2.65-2.58(m,-n-ch
2-ch
2-,13h)，2.35(m,-ch
2-ch
2-co-,14h)，3.32-3.10(m,-nh-ch
2-ch
2-,15h)，2.74(m,-ch
2-ch
2-nh2,14h)，2.56(m,-nh2,9h)。从1hnmr数据结果可以看出，最外层的2.56(m,-nh2,9h)与核心的2.5(m,n-ch
2-ch
2-n-,2h)的h比为9:2，比值约为4.5；而按照结构规整的3代树枝状pamam进行计算，二者的比为24:6，比值等于4。因此，可以判断合成出的pamam的结构基本符合预期结果。同时将制备得到的3代树枝状聚酰胺-胺，通过溴化钾压片法进行红外光谱表征，结果如图2所示，分析可知叔胺的n-h变形振动吸收峰是3356cm-1
；缩合反应生成的n-h伸缩振动吸收峰是3274cm-1
；n-h面外弯曲振动吸收峰是3082cm-1
；亚甲基的非对称和对称伸缩振动吸收峰分别是2944cm-1
、2865cm-1
；酰胺键的特征吸收峰是1650cm-1
、1559cm-1
；亚甲基弯曲振动吸收峰是1476cm-1
；亚甲基变形振动吸收峰是1339cm-1
；叔胺伸缩振动吸收峰
是1114cm-1
；酯基伸缩振动吸收峰1739cm-1
消失，以上结果充分说明3代树枝状聚酰胺-胺pamam被成功合成。
47.2、羧甲基化壳聚糖(cmcs)接枝树枝状聚酰胺-胺(pamam)聚合物的合成：
48.a、室温条件下，取1g cmcs(分子量5万，羧化度90％)溶解在50ml的去离子水中，然后依次加入0.92g1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)、0.55gn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，活化4h。
49.b、活化结束后将0.35g 3代树枝状pamam加入上述溶液中，室温下反应24h。
50.c、反应结束后反应液用透析袋(截留分子量＝3000da)透析48h，然后冻干得到干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam。
51.3、可释放no的干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam-no的合成：
52.a、称取0.3g干凝胶cmcs-pamam，溶于10ml无水甲醇中，溶解5min后加入干燥好的甲醇钠继续溶解，稳定30min后放置于高压反应釜密封并检测气密性。
53.b、高纯氮气维持反应釜(50psi)20min排除反应釜内的空气，然后通入no气体(80psi)室温下反应72h。
54.c、反应结束后，no被50psi的高纯氮气排出并继续维持30min后打开反应釜，取出反应产物。
55.d、用无水乙醚沉降洗涤上述反应产物2次，然后室温真空干燥，-10℃至-20℃低温保存，得到一种载no凝胶cmcs-pamam-no。
56.将步骤2所得的干凝胶cmcs-pamam和步骤3所得的可释放no的干凝胶cmcs-pamam-no通过溴化钾压片法进行红外光谱表征，结果如图3所示，对于cmcs-pamam而言，我们发现在3279cm-1
为n-h的吸收峰，2937cm-1
和2845cm-1
为-ch
2-的不对称伸缩振动和对称伸缩振动吸收峰，1649cm-1
和1555cm-1
是酰胺基的特征谱带，分别称为酰胺ⅰ和酰胺ⅱ谱带，前者为羧基伸缩振动引起的，后者是-conh-中的n-h键弯曲变形振动和c-n键的伸缩振动引起的，从而证明了干凝胶cmcs-pamam的成功制备。对于可释放no干凝胶cmcs-pamam-no而言，我们发现在3265cm-1
处n-h特征峰的减弱，以及1280cm-1
处为nonoate特征吸收峰出现，证明no已成功修饰负载到cmcs-pamam上，以上结果证明可释放no干凝胶cmcs-pamam-no成功制备。
57.实施例2
58.1、3代树枝状聚合物pamam的制备
59.参照文章：a polyamidoamne dendrimer functionalized graphene oxide for dox and mmp-9 shrna plasmid co-delivery(materials science and engineering c 70(2017)572
–
585)，逐步制备3代树枝状聚合物pamam。
60.取1mg制备得到的3代树枝状聚酰胺-胺(pamam)溶解于1ml氘代重水(d2o)中，溶液澄清、透明、无悬浮物或杂质，用干净的核磁共振专用样品管于核磁共振仪(nmr-bruker-300)上检测。引用氘代溶剂残留峰：(重水4.70ppm)。实验结果如图1所示，3代树枝状聚酰胺-胺pamam的核磁峰表述如下，1h-nmr(d2o):2.52(m,n-ch
2-ch
2-n-,2h)，2.65-2.58(m,-n-ch
2-ch
2-,13h)，2.35(m,-ch
2-ch
2-co-,14h)，3.32-3.10(m,-nh-ch
2-ch
2-,15h)，2.74(m,-ch
2-ch
2-nh2,14h)，2.56(m,-nh2,9h)。从1hnmr数据结果可以看出，最外层的2.56(m,-nh2,9h)与核心的2.5(m,n-ch
2-ch
2-n-,2h)的h比为9:2，比值约为4.5；而按照结构规整的3代树枝状pamam进行计算，二者的比为24:6，比值等于4。因此，可以判断合成出的pamam的结构基
本符合预期结果。同时将制备得到的3代树枝状聚酰胺-胺，通过溴化钾压片法进行红外光谱表征，结果如图2所示，分析可知叔胺的n-h变形振动吸收峰是3356cm-1
；缩合反应生成的n-h伸缩振动吸收峰是3274cm-1
；n-h面外弯曲振动吸收峰是3082cm-1
；亚甲基的非对称和对称伸缩振动吸收峰分别是2944cm-1
、2865cm-1
；酰胺键的特征吸收峰是1650cm-1
、1559cm-1
；亚甲基弯曲振动吸收峰是1476cm-1
；亚甲基变形振动吸收峰是1339cm-1
；叔胺伸缩振动吸收峰是1114cm-1
；酯基伸缩振动吸收峰1739cm-1
消失，以上结果充分说明3代树枝状聚酰胺-胺pamam被成功合成。
61.2、羧甲基化壳聚糖(cmcs)接枝树枝状聚酰胺-胺(pamam)聚合物的合成：
62.a、室温条件下，取1g cmcs(分子量10万，羧化度60％)溶解在50ml的去离子水中，然后依次加入0.69g1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)、0.41g n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，活化8h。
63.b、活化结束后将0.35g3代树枝状pamam加入上述溶液中，室温下反应12h。
64.c、反应结束后反应液用透析袋(截留分子量＝4000da)透析48h，然后冻干得到干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam。
65.3、可释放no的干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam-no的合成：
66.a、称取0.1g干凝胶cmcs-pamam，溶于10ml无水甲醇中，溶解5min后加入干燥好的甲醇钠继续溶解，稳定30min后放置于高压反应釜密封并检测气密性。
67.b、高纯氮气维持反应釜(50psi)120min排除反应釜内的空气，然后通入no气体(80psi)室温下反应24h。
68.c、反应结束后，no被50psi的高纯氮气排出并继续维持30min后打开反应釜，取出反应产物。
69.d、用无水乙醚沉降洗涤上述反应产物2次，然后室温真空干燥，-10℃至-20℃低温保存，得到一种载no凝胶cmcs-pamam-no。
70.将步骤2所得的干凝胶cmcs-pamam和步骤3所得的可释放no的干凝胶cmcs-pamam-no通过溴化钾压片法进行红外光谱表征，结果如图3所示，对于cmcs-pamam而言，我们发现在3279cm-1
为n-h的吸收峰，2937cm-1
和2845cm-1
为-ch
2-的不对称伸缩振动和对称伸缩振动吸收峰，1649cm-1
和1555cm-1
是酰胺基的特征谱带，分别称为酰胺ⅰ和酰胺ⅱ谱带，前者为羧基伸缩振动引起的，后者是-conh-中的n-h键弯曲变形振动和c-n键的伸缩振动引起的，从而证明了干凝胶cmcs-pamam的成功制备。对于可释放no干凝胶cmcs-pamam-no而言，我们发现在3265cm-1
处n-h特征峰的减弱，以及1280cm-1
处为nonoate特征吸收峰出现，证明no已成功修饰负载到cmcs-pamam上，以上结果证明可释放no干凝胶cmcs-pamam-no成功制备。
71.实施例3
72.1、3代树枝状聚合物pamam的制备
73.参照文章：a polyamidoamne dendrimer functionalized graphene oxide for dox and mmp-9 shrna plasmid co-delivery(materials science and engineering c 70(2017)572
–
585)，逐步制备3代树枝状聚合物pamam。
74.取1mg制备得到的3代树枝状聚酰胺-胺(pamam)溶解于1ml氘代重水(d2o)中，溶液澄清、透明、无悬浮物或杂质，用干净的核磁共振专用样品管于核磁共振仪(nmr-bruker-300)上检测。引用氘代溶剂残留峰：(重水4.70ppm)。实验结果如图1所示，3代树枝状聚酰
胺-胺pamam的核磁峰表述如下，1h-nmr(d2o):2.52(m,n-ch
2-ch
2-n-,2h)，2.65-2.58(m,-n-ch
2-ch
2-,13h)，2.35(m,-ch
2-ch
2-co-,14h)，3.32-3.10(m,-nh-ch
2-ch
2-,15h)，2.74(m,-ch
2-ch
2-nh2,14h)，2.56(m,-nh2,9h)。从1hnmr数据结果可以看出，最外层的2.56(m,-nh2,9h)与核心的2.5(m,n-ch
2-ch
2-n-,2h)的h比为9:2，比值约为4.5；而按照结构规整的3代树枝状pamam进行计算，二者的比为24:6，比值等于4。因此，可以判断合成出的pamam的结构基本符合预期结果。同时将制备得到的3代树枝状聚酰胺-胺，通过溴化钾压片法进行红外光谱表征，结果如图2所示，分析可知叔胺的n-h变形振动吸收峰是3356cm-1
；缩合反应生成的n-h伸缩振动吸收峰是3274cm-1
；n-h面外弯曲振动吸收峰是3082cm-1
；亚甲基的非对称和对称伸缩振动吸收峰分别是2944cm-1
、2865cm-1
；酰胺键的特征吸收峰是1650cm-1
、1559cm-1
；亚甲基弯曲振动吸收峰是1476cm-1
；亚甲基变形振动吸收峰是1339cm-1
；叔胺伸缩振动吸收峰是1114cm-1
；酯基伸缩振动吸收峰1739cm-1
消失，以上结果充分说明3代树枝状聚酰胺-胺pamam被成功合成。
75.2、羧甲基化壳聚糖(cmcs)接枝树枝状聚酰胺-胺(pamam)聚合物的合成：
76.a、室温条件下，取1g cmcs(分子量8万，羧化度70％)溶解在50ml的去离子水中，然后依次加入1.38g1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)、0.83gn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，活化5h。
77.b、活化结束后将0.35g3代树枝状pamam加入上述溶液中，室温下反应20h。
78.c、反应结束后反应液用透析袋(截留分子量＝5000da)透析48h，然后冻干得到干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam。
79.3、可释放no的干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam-no的合成：
80.a、称取0.5g干凝胶cmcs-pamam，溶于10ml无水甲醇中，溶解5min后加入干燥好的甲醇钠继续溶解，稳定30min后放置于高压反应釜密封并检测气密性。
81.b、高纯氮气维持反应釜(50psi)80min排除反应釜内的空气，然后通入no气体(80psi)室温下反应56h。
82.c、反应结束后，no被50psi的高纯氮气排出并继续维持30min后打开反应釜，取出反应产物。
83.d、用无水乙醚沉降洗涤上述反应产物2次，然后室温真空干燥，-10℃至-20℃低温保存，得到一种载no凝胶cmcs-pamam-no。
84.将步骤2所得的干凝胶cmcs-pamam和步骤3所得的可释放no的干凝胶cmcs-pamam-no通过溴化钾压片法进行红外光谱表征，结果如图3所示，对于cmcs-pamam而言，我们发现在3279cm-1
为n-h的吸收峰，2937cm-1
和2845cm-1
为-ch
2-的不对称伸缩振动和对称伸缩振动吸收峰，1649cm-1
和1555cm-1
是酰胺基的特征谱带，分别称为酰胺ⅰ和酰胺ⅱ谱带，前者为羧基伸缩振动引起的，后者是-conh-中的n-h键弯曲变形振动和c-n键的伸缩振动引起的，从而证明了干凝胶cmcs-pamam的成功制备。对于可释放no干凝胶cmcs-pamam-no而言，我们发现在3265cm-1
处n-h特征峰的减弱，以及1280cm-1
处为nonoate特征吸收峰出现，证明no已成功修饰负载到cmcs-pamam上，以上结果证明可释放no干凝胶cmcs-pamam-no成功制备。
85.实验例
86.一、测定可释放no干凝胶阳离子聚合物cmcs-pamam-no的no释放曲线
87.取1.55mg所得的可释放no阳离子聚合物cmcs-pamam-no加入到含1.55mlpbs
(0.1mol/l，ph＝4)缓冲液的透析袋(截留分子量＝1000da)内，两端扎口放入45ml离心管内，并向离心管内注入18.45mlpbs缓冲液。在37℃恒温摇床内，每隔一段时间取100μl透析液加入到96孔板中，并向离心管内补充100μlpbs缓冲液。在酸性条件下，no与重氮盐磺胺发生重氮反应，并生成重氮化合物，后者进一步与萘基乙烯基二胺发生耦合反应，生成一种红色偶氮化合物，故本实验采用griess试剂方法来检测cmcs-pamam-no在不同时间下的no累积释放量。
88.所述pbs缓冲液的制备：取19ml磷酸二氢钾(0.2mol/l)和81ml磷酸氢二钠(0.2mol/l)相互混合；所述每隔一段时间取其透析液100μl的时间间隔为：0，1h，2h，3h，5h，7h，9h，24h，在上述时间间隔取样置于96孔板中，并依次滴加50μl的griessⅰ、ⅱ试剂后，溶液变为粉红色、玫瑰红色表示有亚硝酸盐还原，反应为阳性。在避光条件下反应15min后会观察到溶液呈紫色或紫红色，然后用酶标仪测定其540nm处的吸光度，绘制载no阳离子聚合物cmcs-pamam-no中no的累积释放量。
89.图4为cmcs-pamam-no在不同时间下的no累积释放量图，从图4中可以看出cmcs-pamam-no作为no载体材料能够实现相对较高的no负载量。
90.二、体外抗真菌实验那分类好了，小朱写在合同里面吧，燧安的合同制式
91.分别取相同质量实施例所得的cmcs-pamam、cmcs-pamam-no和市面上销售的壳聚糖凝胶，然后分别加入至1ml的纯水中并超声溶解10min，分别配制成5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml三个浓度备用。准备三个平板，每个平板倒入约8ml沙氏琼脂培养基待其冷却凝固，吸取37℃培养24小时的白色念珠菌菌悬液100μl，与10ml沙氏琼脂培养基混合均匀后倒入上述平板，待平板冷却凝固后在每个平板上分别放置三个灭菌后冷却的牛津杯，分别吸取200μl材料加入牛津杯中，37℃温箱培养2天后观察抑菌效果。
92.实验结果如图5所示，相同浓度下cmcs-pamam-no的抑菌效果最佳，且高浓度cmcs-pamam-no相较于中低浓度的cmcs-pamam-no而言，对白色念珠菌的抑制效果更明显。
93.三、体内抗真菌研究
94.构建小鼠外阴阴道白色念珠菌感染模型，将实施例制备得到的cmcs-pamam-no注入小鼠阴道，连续给药7天。相同条件下，以生理盐水处理的小鼠阴道作为空白对照组，以未负载no阳离子聚合物cmcs-pamam处理的小鼠阴道作为阴性对照组。末次给药次日对各小鼠进行阴道灌洗，将阴道灌洗液稀释后进行铺板，然后将平板置于37℃温箱培养2天后进行菌落计数，结果如图6所示。实验结果表明，cmcs-pamam-no相较于其他材料而言，可显著减少阴道真菌负荷。阴道灌洗后脱臼处死小鼠，解剖分离小鼠阴道组织，常规石蜡包埋，进行he染色和pas染色，然后显微镜下观察小鼠阴道组织病理变化，分析本发明可释放no干凝胶cmcs-pamam-no对小鼠外阴阴道白色念珠菌感染的抗菌效果，实验结果如图7所示。实验结果表明，小鼠阴道被白色念珠菌感染后产生炎症反应，空白对照组及阴性对照组的小鼠阴道组织相较于经本发明可释放no干凝胶cmcs-pamam-no处理后的小鼠阴道组织而言，阴道粘膜水肿较明显甚至炎性增生，使粘膜上皮增厚，可见中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润，还可观察到较明显的白色念珠菌侵染及菌丝附着。
95.最终实验结果证明，本发明可释放no干凝胶cmcs-pamam-no具有高效的体内外抗白色念珠菌效果，可应用治疗外阴阴道念珠菌感染的抗菌药物中。
96.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，
任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。