一种装载化疗药物且TIGIT过表达的工程化载药细胞膜囊泡以及制备方法和应用

一种装载化疗药物且tigit过表达的工程化载药细胞膜囊泡以及制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药材料技术领域，更具体地，涉及一种装载化疗药物且tigit过表达的工程化载药细胞膜囊泡以及制备方法和应用。


背景技术：

2.随着免疫疗法的日渐成熟，人类仿佛看到战胜癌症的曙光。然而，尽管针对pd-1、ctla-4等免疫检查点的相关疗法取得了前所未有的成功，但临床显示只有一部分患者得到客观缓解。同时现有的免疫检查点难以满足临床肿瘤患者的多样性与复杂性，在临床使用中也会产生与治疗相关的毒性，称为免疫相关不良事件。例如，90%接受ctla-4抗体治疗的患者和70%接受pd-1抗体治疗的患者会发生这些免疫相关不良事件。因此新免疫检查点的开发以及相关治疗方案急需被研究开发。
3.tigit全称为t细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域（也称为wucam，vstm3），是cd28家族的一员。tigit主要是在淋巴细胞中表达，特别是在效应cd8
+ t细胞、自然杀伤细胞、调节性cd4
+ t细胞和滤泡辅助性cd4
+ t细胞中高表达。在人类和小鼠中，tigit的主要配体是cd155（也称为pvr），其在各种正常人体组织中几乎不表达或弱表达，但通常在人类恶性肿瘤中过度表达。cd155的高表达促进肿瘤细胞侵袭和迁移，并与肿瘤进展和预后不良有关。
4.tigit/cd155通路具体可从多个阶段抑制抗肿瘤免疫应答。鉴于tigit/cd155检查点通路在肿瘤免疫逃逸中的重要作用，因此，针对该通路的药物开发也成为了研究热点。然而两项独立的研究表明，tigit单克隆抗体作为单一药物治疗是不足以抑制皮下肿瘤的生长，因此需要开发联合治疗策略。
5.免疫疗法之间的相互结合或免疫疗法与其他传统治疗方法相结合，可以大大提高疗效、减少毒副作用，这已经在很多研究中得到了验证。在过去的几十年里，越来越多临床前和临床研究证据表明，化疗和免疫治疗可能是相互加强的，因此它们的联合是一种有效的抗肿瘤策略。ido抑制剂与化疗药物联合应用于荷瘤小鼠的治疗结果发现肿瘤得到很好的控制。来自美国国家癌症研究所的研究人员证实，接种肿瘤疫苗的患者对后续化疗的反应优于未接种的患者。在ct26或mca205肿瘤模型中，有效剂量的阿霉素和肿瘤免疫疗法的联合成功激活抗肿瘤反应。也有实验证明，一种共装载化疗药物紫杉醇以及脂多糖的纳米颗粒，相比单独使用紫杉醇和脂多糖治疗，可以更有助于动物体内的肿瘤消退。il-7作为一种细胞因子，可以调控t细胞的增殖、发育，有研究表明il-7联合oxa的体内给药能显著抑制肿瘤的生长，而il-7单独给药收效甚微。
6.这些研究良好效果的主要原因是一部分化疗药物通过诱导肿瘤细胞发生了免疫原性细胞死亡（icd），从而增强了抗肿瘤免疫应答。肿瘤发生icd能够有效地刺激宿主的免疫系统主要源于3种icd成分，它们分别是:（1）crt，一种常驻内质网腔内的分子伴侣蛋白可以作为dc的“吃我”信号；（2）hmgb1，是一种dna结合蛋白和tlr-4介导的dc激活因子；（3）
atp，能够激活dc上的p2x7嘌呤能受体。这三种icd成分可促进dc吞噬肿瘤细胞，从而促进dc处理肿瘤来源的抗原，并随后启动t淋巴细胞介导的适应性免疫应答。一些化疗药物已经被证明可以诱导icd，尤其是oxa（oxaliplatin，奥沙利铂）。
7.目前化疗和免疫治疗等都展现出巨大治疗潜力，但是仅仅直接注入这些药物，例如小分子药物、单克隆抗体等还存在一定的不足，包括性质不稳定、易被降解清除、体内循环时间短、靶向能力差等。随着科技的发展和进步，纳米递送系统日渐完善，极大促进了各种肿瘤疗法的发展。有效的纳米递送系统具有可以避免药物不被快速降解、可以延长药物在体内滞留的时间、可以实现免疫逃逸、可以有针对性的释放药物以及携带药物突破机体特定生理屏障的能力。
8.近些年来，生物膜纳米递送系统成功获得越来越多研究者的青睐。来源于细胞的生物膜是磷脂双分子层结构，主要成分以脂质和蛋白质为主，具有重要的生理功能。生物膜通过各种方法制备成纳米尺寸的生物膜囊泡，膜的复杂性包括脂质、蛋白质和碳水化合物都可以被保存下来，进一步合成的生物膜纳米递送体系保留了细胞来源的许多属性。因为生物膜来自细胞自身，基于此构建的生物膜纳米递送系统具有以下特点：（1）保留了源细胞膜表面特性；（2）生物相容性好、免疫原性低；（3）躲避机体清除，实现长效循环；（4）可对膜表面进行多种修饰，便于获得各种额外的功能和特性；（5）制备成本低，耗时短，有利于工程化制备。在过去的十年中，以生物膜纳米递送系统为基础的治疗方式已经成为很有前景的肿瘤治疗策略。多种类型的细胞生物膜被制备成纳米递送系统用于肿瘤治疗，包括红细胞、肿瘤细胞、白细胞、血小板和干细胞，这极大的推进了肿瘤治疗的发展。


技术实现要素：

9.为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种装载化疗药物且tigit过表达的工程化载药细胞膜囊泡的制备方法。
10.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种装载化疗药物且tigit过表达的工程化载药细胞膜囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.包装慢病毒，于37℃细胞培养箱中培养hek-293t细胞，按照体积比例1:1.2~1.5:2~4加入混合好的目的质粒、包装质粒以及lipo2000，目的质粒为编码tigit基因的质粒，5-9小时后换液，继续使用正常的完全培养基培养，收集培养上清，离心去除细胞，继续收集上清，过滤除去上清中的细胞碎片，而后将滤液与病毒纯化试剂按照1:4的体积比混合，孵育之后3000g~4000g离心20~30min，去除上清，用bs重悬沉淀即得所需慢病毒溶液；其中编码tigit的基因序列号为： nm_001146325.1。。。
11.s2. 于细胞培养箱中培养目的细胞，目的细胞为nih/3t3细胞，然后用所得的慢病毒溶液感染nih/3t3细胞，感染后用嘌呤霉素筛选细胞，1~2周后进行检测，选出tigit过表达的细胞，构建tigit过表达的稳定细胞系即tigit过表达的 nih/3t3细胞系。
12.s3.培养所得的稳定细胞系，收集清洗后，破碎形成匀浆液，将匀浆液离心提取其细胞膜，并将其制成膜囊泡，离心纯化，得工程化细胞膜囊泡；s4.通过共孵育或超声方法将所得细胞膜囊泡装载小分子化疗药物，离心纯化之后，即得工程化载药细胞膜囊泡。
13.进一步的，所述嘌呤霉素的浓度为2~6μg/ml。当慢病毒溶液感染nih 3t3细胞之
后，加入2~6μg/ml的嘌呤霉素，共聚焦显微镜检测结果显示，细胞有明显目的蛋白tigit表达。
14.进一步的，所述s3.的具体步骤：收集tigit过表达的稳定细胞系，pbs清洗之后，用匀浆器破碎形成匀浆液，然后将匀浆液于4 ℃、离心力为1000g~1500g的条件下离心6~10 min，以去除未破碎的细胞和大的细胞碎片，收集上清，于4 ℃、离心力为3000g~4000g离心6~10 min，去除线粒体以及其它细胞器，收集上清，4℃、80000g~120000g离心60~90min，去除上清，使用pbs洗涤沉淀2次，而后依次经若干次通过不同孔径的挤出器挤出得到膜囊泡，该挤出器的孔径范围为0.1~1μm，若干次所用的挤出器孔径大小为依次减小，将得到的膜囊泡于4℃、100000g~120000g条件下超速离心90~120min，收集沉淀，用pbs洗涤2次，继续收集沉淀，用pbs重悬，即得工程化细胞膜囊泡。匀浆液经三次离心，离心力逐渐增大，逐步去除为破碎的细胞和大的细胞碎片、去除线粒体及其他细胞器等，收集得到细胞膜，而后通过多次挤出器挤出膜囊泡，且每次挤出器的孔径逐渐缩小，使得得到的膜囊泡粒径均一，且提高膜囊泡的收集率，减少流失。
15.进一步的，所述工程化细胞膜囊泡的粒径为20~200nm，平均粒径大致为100nm。上述结构中，上述匀浆液经三次离心、以及经孔径为1μm~0.1μm孔径的挤出器多次挤出后所得到的工程化化细胞膜囊泡粒径较均匀，适合载药。
16.进一步的，所述s3.中的匀浆液经第三次离心，去除上清，使用pbs洗涤沉淀2次，而后依次经孔径为1μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm的挤出器挤出得到膜囊泡。
17.再进一步的，所述工程化细胞膜囊泡的粒径为20~200nm，平均粒径为100nm左右。
18.进一步的，所述s4.中，通过共孵育或超声方法实现奥沙利铂的装载，其中工程化细胞膜囊泡和奥沙利铂溶液混合后的最终浓度分别为1mg/ml和1~1.5mg/ml，混合物在37℃共孵育或在冰上超声得到对应的混合体系，然后将混合体系使用超速离心机或超滤管进行离心，得到工程化载药细胞膜囊泡。
19.另一发明目的：本发明还提供了一种装载化疗药物且tigit过表达的工程化载药细胞膜囊泡，其特征在于，采用上述制备方法制得。
20.再一发明目的：本发明还提供了一种装载化疗药物且tigit过表达的工程化载药细胞膜囊泡，其在制备肿瘤免疫治疗药物上的应用。
21.再一发明目的：一种药物递送系统，其特征在于：包括如上述的装载化疗药物且tigit过表达的工程化载药细胞膜囊泡。
22.采用上述方案，本发明通过慢病毒感染目的细胞制备稳定细胞系，而后提取其细胞膜，通过挤出等方法得到膜纳米囊泡，而后装载小分子化疗药物，离心纯化，得到工程化载药细胞膜囊泡。
23.由上述方法制备得到的工程化载药细胞膜囊泡里面装载有奥沙利铂且表面具有较高的tigit蛋白的表达，生物相容性好，可应用于制备肿瘤免疫治疗药物，其具有较好的实用价值和临床前景。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明提供了tigit过表达的工程化载药细胞膜囊泡的制备方法，率先制备递送tigit蛋白的生物膜体系。通过应用基因编辑的技术手段，将tigit蛋白表达在细胞膜上，相比于tigit单克隆抗体而言，大大提高了药物在体内的稳定性和利用度。
25.（2）本发明的工程化载药细胞膜囊泡或药物递送系统，其实施有效的联合给药，同时递送奥沙利铂和tigit蛋白。可以实现药物的有效富集、提高药物的生物利用度。通过奥沙利铂杀伤肿瘤细胞发生icd并引起机体免疫应答，再联合tigit解除免疫细胞的抑制效应，实现“1+1》2”的疗效。
26.（3）本发明将工程化的细胞膜用于药物递送系统，生物安全性高，且具有较好的靶向性，能够更有效的靶向肿瘤，有效药物提高生物利用度，具有安全、增效、减毒的特点。
27.下面结合附图对本发明作进一步描述。
附图说明
28.附图1为本发明实施例1步骤一中工程细胞hek-293t细胞包装生产特定慢病毒的荧光图；100μm；附图2为本发明实施例1步骤一中稳定细胞系tigit蛋白膜表达的共聚焦显微镜检测图；50μm；附图3为本发明实施例1步骤一中不同代数的稳定细胞系tigit蛋白表达的共聚焦显微镜检测图；10μm；附图4为本发明实施例1步骤一中工程化细胞膜囊泡的透射电镜检测图；100nm；附图5为本发明实施例1步骤一中工程化细胞膜囊泡的粒径分布（a）和zeta电位检测（b）图；附图6为本发明实施例1步骤一中工程化细胞膜囊泡的共聚焦显微镜检测图；整体图，5μm；右上角图，1μm；附图7为本发明实施例1步骤一中小分子药物奥沙利铂（oxa）包封率的统计图；附图8为本发明实施例1步骤二中工程化细胞膜囊泡与肿瘤细胞靶向结合能力的研究；10μm；附图9为本发明实施例1步骤二中不同浓度的工程化载药细胞膜囊泡体外抑制肿瘤细胞生长能力的研究；附图10为本发明实施例1步骤二中工程化载药细胞膜囊泡体外引起肿瘤细胞免疫原性死亡能力的研究；20μm；附图11为本发明实施例1步骤三中不同处理之后各组小鼠肿瘤的体积大小随时间变化的统计图；附图12为本发明实施例1步骤三中不同处理后各组小鼠肿瘤额图片；附图13为本发明实施例1步骤三中不同处理后各组小鼠肿瘤重量的统计图；附图14为本发明实施例1步骤三中不同处理后各组小鼠的生存曲线；附图15为本发明实施例1步骤三中不同处理后各组小鼠体重随时间变化的统计图；附图16为本发明实施例1步骤三中对照组（pbs组）和实验组（oxa@tigit mvs）小鼠主要器官的he染色切片；200μm。
具体实施方式
29.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但本发明不局限于下列
具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
30.实施例1一、工程化载药细胞膜囊泡的制备1、包装慢病毒。于37℃细胞培养箱中培养hek-293t细胞（外购），按照比例1:1.2~1.5:2~4加入混合好的目的质粒（编码tigit基因的质粒）、包装质粒以及lipo2000（脂质体2000）。5-9小时后换液，继续使用正常的完全培养基培养，并分别于不同的时间使用荧光显微镜下观察转染后的hek-293t细胞。其结果如图1所示，显示hek-293t细胞正在有效的包装产生慢病毒。
31.收集培养上清，离心去除细胞。继续收集上清，使用0.45μm的滤器过滤，以除去上清中的细胞碎片。而后将滤液与病毒纯化试剂（lenti concentrator）按照1:4的体积比混合，孵育之后3000g~4000g离心20-30min，去除上清，用适量pbs重悬沉淀即得所需慢病毒溶液。
32.2、构建tigit过表达的稳定细胞系。将nih/3t3细胞（外购）培养于细胞培养箱中，而后加入适量上述所得慢病毒溶液以感染nih 3t3细胞。感染之后，加入2~6μg/ml的嘌呤霉素筛选细胞，1~2周后进行检测。共聚焦显微镜观测结果如图2所示，表明nih/3t3细胞上显著表达egfp-tigit。图3显示，基因编辑后的细胞十几代都可以表达tigit蛋白。检测结果一致表明egfp-tigit稳定细胞系构建成功。
33.3、制备工程化细胞膜囊泡。收集步骤2中tigit过表达的稳定细胞系，pbs清洗之后，于冰上使用杜恩斯组织匀浆器破碎。将匀浆液于4 ℃、1000g~1500g的条件下离心6-10 min，以去除未破碎的细胞和大的细胞碎片。收集上清，4 ℃、3000g~4000g离心6-10 min，去除线粒体以及其它细胞器。收集上清，4℃、80000g~120000g离心60~90min，去除上清，使用pbs洗涤沉淀2次。而后依次通过1μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm的挤出器挤出，得到较为均一的膜囊泡。之后于4℃、100000g~120000g条件下超速离心90~120min，收集沉淀，用pbs洗涤2次。继续收集沉淀，用适量pbs重悬，即得工程化细胞膜囊泡。首先使用透射电镜观察其形态。其结果如图4所示，具有典型的膜结构，与天然外泌体外貌上高度相似。布鲁克林粒度仪检测其粒径分布。其结果如图5所示，其粒径分布主要为20~200nm，平均粒径大致为100nm，zeta电位大致为-15mv~-25mv。用激光共聚焦显微镜观测其蛋白表达情况，其结果如图6所示，观测到明显的egfp荧光颗粒。这些结果表明稳定表达特定蛋白tigit的工程化细胞膜囊泡（egfp-tigit mvs）成功制备。
34.4、制备工程化载药细胞膜囊泡。通过共孵育和超声的方法实现奥沙利铂的装载。首先，将工程化细胞膜囊泡和奥沙利铂溶液混合，使得混合后两组分的最终浓度分别为1mg/ml（蛋白质量）和1~1.5mg/ml。而后混合物在37℃共孵育或者在冰上超声。按照上述两种方法得到的对应的混合体系都使用超速离心机或者超滤管进行离心，以充分除去游离的奥沙利铂。使用紫外-可见分光光度计检测246nm的特征吸收，从而计算得到奥沙利铂的包封率。结果如图所示7，超声法的包封率可达25%左右，共孵育的包封率为7%左右，实现了奥沙利铂的有效装载。
35.二、工程化载药细胞膜囊泡的生物学功能研究1、体外靶向肿瘤细胞能力的研究。首先将ofp（橙色荧光蛋白）-pvr（脊髓灰质炎病毒受体）质粒转染进b16f10细胞（小鼠黑色素瘤细胞）内，并将ofp-pvr b16f10细胞分为2组，编号
①
、
②
。第
②
组提前用apvr抗体处理4~6小时，之后分别在两组中加入等量的tigit mvs，共孵育2-4小时。使用共聚焦显微镜进行观察，其结果如图8所示（图中上排为
①
组，下排为
②
组），显示所制工程化外泌体可通过tigit/pvr之间的结合力靶向至肿瘤细胞。这表明工程化外泌体在体外具有良好的生物活性，具有特异性靶向结合的能力。
36.2、考察其体外抑制肿瘤细胞生长的能力。用cck-8法检测了不同浓度的工程化载药细胞膜囊泡对肿瘤细胞（b16f10细胞、hela细胞）存活率的影响。其结果如图9所示，对于b16f10细胞来说，当浓度大于0，就具有明显的杀伤力，而对于hela细胞来说，当浓度大于0.5μg/ml时，具有明显的杀伤力。尤其当浓度4μg/ml时，b16f10细胞存活率48%左右、hela细胞存活率70%左右，当浓度为8μg/ml时，b16f10细胞存活率41%左右，hela细胞存活率52%左右，表明了工程化载药细胞膜囊泡在体外可有效抑制肿瘤细胞的生长。
37.3、体外引起肿瘤细胞icd（免疫原性细胞死亡）能力的研究。将工程化载药细胞膜囊泡与肿瘤细胞（b16f10细胞）共培养，而后使用共聚焦显微镜分别检测肿瘤细胞crt蛋白的外翻以及核内hmgb1蛋白的释放情况。结果如图10所示，可以观测到给药组肿瘤细胞有较为明显的crt外翻（图10-a）和hmgb1释放（图10-b）。这显示工程化载药细胞膜囊泡在体外可以有效引起肿瘤细胞的免疫原性死亡，这是奥沙利铂与免疫疗法联合治疗的有效基础。
38.三、工程化载药细胞膜囊泡体内抑瘤作用效果的研究经中山大学动物伦理委员会审核批准（批准编号为sysu-iacuc-2020-000430），在相关实验中使用实验动物。我们在c57bl/6小鼠上构建了黑色素瘤的荷瘤模型，而后将荷瘤小鼠随机分为4组，并分别接受以下药物治疗：pbs、oxa（奥沙利铂）、tigit mvs（工程化细胞膜囊泡）、oxa@tigit mvs（工程化载药细胞膜囊泡）。而后观察并记录了各组小鼠肿瘤的生长情况，如图所示11。之后，我们将各组小鼠肿瘤解剖，其肿瘤大小如图所示12。并对瘤重进行称量和统计，结果如图所示13。同时还对其生存曲线进行了记录，结果如图14所示。这些实验结果都显示了实验组（oxa@tigit mvs）具有很好的体内抑瘤效果。
39.同时，为了验证药物的体内生物安全性，我们对各组小鼠的体重进行了记录，其结果如图所示15，各组小鼠没有明显的体重损失。之后，我们还对脏器进行了组织学检测。将各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾进行he染色，观察其是否有组织损伤。结果如图所示16，没有明显的组织学损伤，进一步说明了药物的生物安全性。