一种用于皮肤创面修复的生物膜的制作方法

1.本发明涉及到自体血临床应用领域，尤其涉及到一种用于皮肤创面修复的生物膜。


背景技术：

2.皮肤是人体的最大器官，作为人体的第一道防线覆盖于全身表面，容易因物理性、机械性、生物性及化学性等因素而发生损伤。对于普通创伤，机体可通过自身炎症反应、组织增生、伤口收缩和组织再生进行自我修复。但对于一些慢性创伤或皮肤创面较大者，其致伤因子较多，难以通过机体自行愈合，需给予医疗手段进行治疗。一种良好的皮肤创面修复手段，可快速封闭创面，恢复皮肤的防御功能，促进细胞的再生，降低感染等并发症的发生。
3.创面的复杂化对修复手段提出了更高的要求，既往外科采用的清创、植皮及皮瓣修复已不能满足其治疗的需求。人口老龄化带来的创面治疗需求迅速增多，意味着很多患者因个体因素如基础疾病较多、麻醉风险较高等原因，不能完成外科手术修复。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供了一种用于皮肤创面修复的生物膜。
5.解决了创面的复杂化对修复手段提出了更高的要求，既往外科采用的清创、植皮及皮瓣修复已不能满足其治疗的需求的问题；同时解决了人口老龄化带来的创面治疗需求迅速增多，意味着很多患者因个体因素如基础疾病较多、麻醉风险较高等原因，不能完成外科手术修复的问题。
6.本发明是通过以下技术方案实现：
7.本发明提供了一种用于皮肤创面修复的生物膜，该用于皮肤创面修复的生物膜包括：adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料的制备与保存；
8.根据所述adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料进行adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜的制备。
9.优选的，所述adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料的制备与保存包括：制备prf膜及prf析出液；制备p2代adscs；制备p2代epcs。
10.优选的，所述制备prf膜及prf析出液包括：采集患者肘静脉血至无添加剂真空采血管内，并将所述真空采血管放入离心机内进行离心；离心后所述真空采血管中段凝胶为prf，将所述prf取出，然后将所述prf置入灭菌后的prf工具盒内盒；取出prf膜，冻存备用；同时收集所述prf工具盒内盒托盘prf析出液至无菌离心管，并离心，冻存备用。
11.优选的，制备p2代adscs包括；用吸脂针吸取患者腹部脂肪，并去除血性液体；分离提取adscs；所述adscs体外培养，得到p2代adscs并冻存备用。
12.优选的，制备p2代epcs包括；标记患者髂后上棘穿刺点，用骨穿针穿刺，吸取骨髓液；分离提取epcs；所述epcs体外培养，得到p2代epcs并冻存备用。
13.优选的，所述根据所述adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料进行adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜的制备包括；扩增所述p2代adscs或所述p2代epcs；制备p3代细胞悬液；在所述prf膜上接种干细胞，然后将prf析出液滴在所述prf膜上，得到所述adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜，并冻存备用。
14.本发明的有益效果是：adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜作为一种药物用于皮肤创面治疗，可同时发挥adscs、epcs、prf的作用，在覆盖创面的同时促进创面快速愈合，减少局部瘢痕的形成，同时能够根据患者创面情况，可分别制备接种有adscs、epcs或将adscs与epcs联合培养后的prf生物膜用于临床治疗。
附图说明
15.图1是本发明实施例提供的一种用于皮肤创面修复的生物膜的adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料的制备与保存的流程图；
16.图2是本发明实施例提供的一种用于皮肤创面修复的生物膜的根据所述adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料进行adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜的制备的流程图。
具体实施方式
17.以下结合附图对本发明的具体实施例进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
18.为了方便理解本技术实施例提供的一种用于皮肤创面修复的生物膜，首先说明一下其应用场景，本技术实施例提供的一种用于皮肤创面修复的生物膜用于提供一种对皮肤创面进行修复的生物膜；而创面的复杂化对修复手段提出了更高的要求，既往外科采用的清创、植皮及皮瓣修复已不能满足其治疗的需求，同时人口老龄化带来的创面治疗需求迅速增多，意味着很多患者因个体因素如基础疾病较多、麻醉风险较高等原因，不能完成外科手术修复。下面结合附图对本技术实施例提供的一种用于皮肤创面修复的生物膜进行说明。
19.本发明提供了一种用于皮肤创面修复的生物膜，该用于皮肤创面修复的生物膜的制作步骤包括：adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料的制备与保存；根据所述adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料进行adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜的制备。通过上述步骤能够制备出adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜，从而方便对患者的皮肤创面处进行修复。
20.其中，adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料的制备与保存在具体进行时可参考图1，图1是本发明实施例提供的一种用于皮肤创面修复的生物膜的adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料的制备与保存的流程图。根据图1可知，制备和保存adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料的步骤包括制备prf膜及prf析出液；制备p2代adscs；制备p2代epcs。并将上述prf膜及prf析出液、p2代adscs、p2代epcs分别冻存备用。
21.进一步的，上述制备prf膜及prf析出液的步骤包括：采集患者肘静脉血至无添加剂真空采血管内，并将所述真空采血管放入离心机内进行离心；离心后所述真空采血管中段凝胶为prf，将所述prf取出，然后将所述prf置入灭菌后的prf工具盒内盒；取出prf膜，冻
存备用；同时收集所述prf工具盒内盒托盘prf析出液至无菌离心管，并离心，冻存备用。具体操作时：用22g一次性使用静脉采血针从患者肘静脉采血10ml至无添加剂真空采血管，迅速将采血管置入离心机，在室温下以3000rpm(约400g)离心10分钟，其中，开始采血至采血完毕总时间应小于25秒，采血完毕至开始离心时间应小于1分钟；采血管中段凝胶即为prf，无菌条件下取prf，将prf置入灭菌后的prf工具盒内盒利用盒盖的重力压膜1分钟；取出prf膜，无菌条件下，-80℃保存备用，从而得到prf膜；收集prf工具盒内盒托盘prf析出液至无菌离心管，10℃，500g，离心5分钟，取上清液，用0.2um过滤器过滤，无菌条件下，-80℃保存备用，从而得到prf析出液。
22.进一步的，上述制备p2代adscs的步骤包括：用吸脂针吸取患者腹部脂肪，并去除血性液体；分离提取adscs；所述adscs体外培养，得到p2代adscs并冻存备用。具体操作时：标记患者腹部术区，常规消毒、铺巾，用2％利多卡因局部浸润麻醉术区，用吸脂针吸取腹部脂肪，去除血性液体后颗粒脂肪量约1ml；将颗粒脂肪转移至15ml离心管中，加入liberase dl research grade 100ul，liberase tl research grade 100ul，dnase
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100ul，加入pbs至总量4ml；将装有颗粒脂肪的离心管置入恒温振荡器，在37℃，130rpm条件下震荡1小时；向离心管中加入dmem完全培养基8ml，充分混匀，将液体用70um细胞滤网过滤至另一离心管中，900rpm，离心5分钟。弃上清液，加入10mlα-mem完全培养基重悬；将上述细胞悬液移入10cm培养皿中，在37℃，95％相对湿度，含5％co2的恒温细胞培养箱中培养细胞；每隔一天换液一次，细胞融合80％传代培养，p2代细胞大量冻存，从而得到p2代adscs。
23.进一步的，上述制备p2代epcs的步骤包括：标记患者髂后上棘穿刺点，用骨穿针穿刺，吸取骨髓液；分离提取epcs；所述epcs体外培养，得到p2代epcs并冻存备用。具体操作时，标记患者髂后上棘穿刺点，常规消毒、铺巾，用2％利多卡因局部浸润麻醉术区，用骨穿针穿刺，吸取骨髓液1ml；将骨髓液移入50ml离心管，用20mlpbs稀释，充分混匀；将液体用70um细胞滤网过滤至另一离心管中，900rpm，离心5分钟。弃上清液，加入10ml egm-2完全培养基重悬；将上述细胞悬液移入提前2小时用fibronectin(75ug，用1mlpbs稀释)包被后的10cm培养皿中，在37℃，95％相对湿度，含5％co2的恒温细胞培养箱中培养细胞；每隔一天换液一次，细胞融合80％传代培养，p2代细胞大量冻存，从而得到p2代epcs。
24.本技术中，根据所述adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料进行adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜的制备在具体进行时可参考图2，图2是本发明实施例提供的一种用于皮肤创面修复的生物膜的根据所述adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料进行adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜的制备的流程图。根据图2可知，本技术中根据所述adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜原材料进行adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜的制备的具体步骤包括：扩增所述p2代adscs或所述p2代epcs；制备p3代细胞悬液；在所述prf膜上接种干细胞，然后将prf析出液滴在所述prf膜上，得到所述adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜，并冻存备用。上述步骤具体操作时：取提前冻存的p2代adscs或epcs，将其在10ml培养皿中扩增至融合80％；用0.25％胰蛋白酶溶液消化p3代adscs或epcs，dmem完全培养基终止消化，850rpm离心3分钟，将细胞重悬后制成细胞悬液(adscs用α-mem完全培养基重悬，epcs用egm-2完全培养基重悬)；将prf膜置入6孔板中，静置10min，使prf膜吸附于6孔板底，取adscs或epcs细胞悬液1ml滴在prf膜上；将6孔板置入37℃，95％相对湿度，含5％co2的恒温细胞培养箱中静置8小时；每孔加入完全培养基2.5ml(adscs用
α-mem完全培养基，epcs用egm-2完全培养基)，继续培养24h；用无菌镊子取出接种有adscs或epcs的prf膜，用pbs轻轻漂洗，以洗去培养基。将prf析出液滴在接种有adscs或epcs的prf膜上即完成adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜的制备，-80℃保存备用，从而完成adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜的制备。
25.本技术发明中用到的所有部件和液体均为现有技术中常用的部件和液体。
26.在上述实施例中，本技术实施例提供的一种用于皮肤创面修复的生物膜能够制备出adscs-epcs复合外周血prf凝胶生物膜，从而能够对复杂的皮肤创面进行修复，同时能够对年龄较高的患者的皮肤创面进行修复。
27.上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定。在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入到本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。