β-谷甾醇在缓解奶牛乳腺炎症中的应用

1.本发明属于医学技术领域，尤其涉及β-谷甾醇在缓解奶牛乳腺炎症中的应用。


背景技术：

2.牛乳腺炎是影响全世界奶牛健康的一种主要疾病，其发病原因主要是由于病原菌的侵入，以及造成感染的各种诱因，如外伤、挤奶技术不佳。常见的致病菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌，涵盖革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌两大类。它们分布于空气、水体、饲料以及奶牛可接触物体表面，部分可由乳头导管入侵并进入乳腺组织，随后引发感染和炎症反应，导致奶牛罹患乳房炎，也有一部分通过饲料进入瘤胃内，当这些革兰氏阴性菌的死亡而导致细胞壁脱落产生内毒素，被机体吸收进入血液到达乳腺，也会诱发炎症。牛乳腺炎给奶牛业造成的危害包括：直接造成产奶量以及品质的降低；一些牛无法治愈而被淘汰所造成的损失；在治疗乳腺炎期间医疗费的开支；护理病牛所需额外的劳动力开支等。当今最普遍的治疗乳腺炎的方法是抗生素疗法，而这种疗法具有明显的弊端比如易产生抗药性；会影响奶牛的产奶性能和并且经过抗生素治疗的牛产出的牛奶中会有药物残留无法食用，影响养殖企业经济效益等等。因此，亟需寻求更为安全有效且成本低廉的天然活性物质以替代抗生素，进行提前预防。
3.β-谷甾醇(β-sitosterol)是植物甾醇类成分之一，广泛存在于自然界中的各种植物油、坚果等植物种子中，也存在于某些植物药中。目前，β-谷甾醇以其特有的生物学特性(抗炎、抗肿瘤)被广泛应用到医药行业中，尤其是研究显示β-谷甾醇的摄入量多少与人群许多慢性病的发生率有关系，因此β
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谷甾醇的医药应用及其发展前景受到越来越多人的关注。β-谷甾醇的多重药理作用，也使其作为一种新型绿色添加剂被广泛研究，我国农业部于2008年将植物甾醇列为“新型功能性饲料添加剂”允许其添加在家禽和生长育肥猪的养殖中。而对于β-谷甾醇是否可以缓解牛乳腺炎症或者起到保护治疗效果，还未有深入研究。


技术实现要素：

4.本发明实施例的目的在于提供β-谷甾醇在缓解奶牛乳腺炎症中的应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.β-谷甾醇在缓解奶牛乳腺炎症中的应用，包括以下步骤：
7.步骤1：将奶牛乳腺上皮细胞接种在含生长培养基的培养皿中，于细胞培养箱中培养；试验分为四组，分别是空白对照组、乳腺炎症模型组、β-谷甾醇组和药物缓解组；
8.步骤2：奶牛乳腺上皮细胞细胞置于生长培养液中，β-谷甾醇组加入β
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谷甾醇，乳腺炎症模型组加入lps，药物缓解组在加入β-谷甾醇预处理后，加入lps，随后提取收集rna及蛋白；
9.步骤3：检测β-谷甾醇对lps诱导的乳腺上皮细胞模型中il-1β、tnf
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α炎症因子以及caspase3、bax凋亡因子的调控作用；检测细胞内活性氧的累计或改善；
10.步骤4：通过qpcr、western blot方法初步探讨β-谷甾醇对预防缓解脂多糖所诱导的奶牛乳腺炎症的调控机理。
11.进一步的，所述步骤1中，细胞培养箱中温度为37℃。
12.进一步的，所述步骤2中，β-谷甾醇组加入1μmβ-谷甾醇。
13.进一步的，所述步骤2中，乳腺炎症模型组加入1μg/mllps。
14.进一步的，所述步骤2中，药物缓解组在加入1μmβ-谷甾醇预处理后加入1μg/mllps。
15.进一步的，所述步骤3中，通过qpcr、western blot方法检测β-谷甾醇对lps诱导的乳腺上皮细胞模型中il-1β、tnf-α炎症因子以及caspase3、 bax凋亡因子的调控作用。
16.进一步的，所述步骤3中，利用荧光显微镜检测细胞内活性氧的累计或改善。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.1)β-谷甾醇可以预防改善lps诱导的牛乳腺上皮细胞相关炎症因子的表达，具有抗乳房炎的功效；
19.2)β-谷甾醇可以改善lps诱导的牛乳腺上皮细胞氧化影响，具有抗氧化的功效；
20.3)β-谷甾醇可以预防改善lps诱导的牛乳腺上皮细胞相关凋亡因子的表达，具有抗凋亡的功效；
21.4)β-谷甾醇能显著提高因lps处理导致牛乳腺上皮细胞的hif-1α、 mtor基因的抑制效果(p《0.01)。
附图说明
22.图1为β-谷甾醇对牛乳腺上皮细胞活力影响示意图。
23.图2为β-谷甾醇对lps诱导的牛乳腺上皮细胞相关炎症因子的影响示意图。
24.图3为β-谷甾醇对lps诱导牛乳腺上皮细胞内ros累计的影响示意图。
25.图4为β-谷甾醇对lps诱导牛乳腺上皮细胞相关凋亡因子的影响示意图。
26.图5为β-谷甾醇对lps诱导牛乳腺上皮细胞中hif-1α通路的影响示意图。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
28.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
29.实施例1
30.奶牛乳腺上皮细胞的培养：
31.奶牛乳腺上皮细胞为奶牛乳腺上皮细胞系(mac-t)。将mac-t细胞置于生长培养基【dmem，10％fbs，5μg/ml胰岛素，1μg/ml氢化可的松， 1％青霉素-链霉素(100iu/ml青霉素+100ug/ml链霉素)】中进行培养，传代2-3次后，将mac-t细胞接种于含有2ml生长培养基的六孔板中进行培养，同时药物组加入1μmβ-谷甾醇，炎症模型组加入1μg/ml lps，药物缓解组加入1μmβ-sitosterol以及1μg/ml lps进行培养。
32.实施例2
33.β-谷甾醇对牛乳腺上皮细胞活力的影响：
34.步骤11：实施例1制备的生长期乳腺上皮细胞接种至96孔板，利用cck-8 试剂盒进行测定；
35.步骤12：完成步骤11后，取所述96孔板，进行如下分组处理：
36.药物组：吸弃培养液，用pbs清洗后加入含β-谷甾醇(0.01μm，0.1μ m，1μm，5μm，10μm，20μm，30μm，40μm)的生长培养液，置于 37℃细胞培养箱中培养24h；
37.对照组：吸弃培养液，用pbs清洗后加入生长培养液，置于37℃细胞培养箱中培养24h。
38.将各组培养24h后，向96孔板的每个孔加入该孔培养液的10％的cck-8 检测液，轻轻摇晃至液体混匀，放入细胞培养箱孵育2h，之后使用酶标仪检测在450nm处的吸光度。
39.β-谷甾醇对牛乳腺上皮细胞活力的影响情况如图1所示，结果表明与对照组相比，添加β-谷甾醇(0.01μm、0.1μm、1μm、5μm、10μm、20 μm)的处理组均对牛乳腺上皮细胞活力无显著影响(p《0.05)。
40.实施例3
41.β-谷甾醇对lps诱导的牛乳腺上皮细胞相关炎症因子的影响：
42.通过实施例2的结果展示，在后续的方案中选取1μmβ-谷甾醇药物组与对照组以及炎症模型组进行比对(细胞培养以及实验分组如实施例1)。
43.1、lps诱导的牛乳腺上皮细胞相关炎症因子的qpcr及western blot检测
44.将细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、1μmβ-谷甾醇药物组， 1μg/ml lps乳腺炎症模型组和药物缓解组(β-sitosterol+lps)。qpcr及 western blot检测4个不同组别中nf-κb p65、基因及蛋白表达的影响，结果为附图2a、2b所示，1μmβ-谷甾醇能极显著改善lps诱导的牛乳腺上皮细胞炎症因子的基因表达(p《0.001)；qpcr检测4个不同组别中il-1β、tnf
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α基因表达的影响，结果为附图2c、2d所示，与nf-κb p65基因表达变化相一致，1μmβ-谷甾醇能极显著改善lps诱导的牛乳腺上皮细胞炎症因子 il-1β、tnf-α的基因表达(p《0.001)。
45.这些发现表明，β-谷甾醇可以预防改善lps诱导的牛乳腺上皮细胞相关炎症因子的表达，具有抗乳房炎的功效。
46.实施例4
47.β-谷甾醇对lps诱导牛乳腺上皮细胞内ros累计的影响：
48.1、lps诱导牛乳腺上皮细胞内ros累计的荧光显微镜检测
49.细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、1μmβ-谷甾醇药物组， 1μg/ml lps乳腺炎症模型组、药物缓解组(β-sitosterol+lps)。利用活性氧检测试剂盒进行检测。首先利用pbs稀释dcfh-da，使其终浓度10μmol/l。
50.2、去除六孔板中细胞培养液，用pbs冲洗3次，每孔加入配制好的 dcfh-da，置于细胞培养箱孵育30分钟。之后再次用pbs清洗3次，充分去除dcfh-da。使用荧光显微镜进行拍照，使用image软件进行荧光强度分析。
51.β-谷甾醇对lps诱导牛乳腺上皮细胞内ros累计结果为附图3a、3b所示，β-谷甾醇极显著改善lps诱导牛乳腺上皮细胞内ros累计(p《0.001)。
52.这些发现表明，β-谷甾醇可以改善lps诱导的牛乳腺上皮细胞氧化影响，具有抗氧
化的功效。
53.实施例5
54.β-谷甾醇对lps诱导牛乳腺上皮细胞相关凋亡因子的影响：
55.细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、1μmβ-谷甾醇药物组， 1μg/ml lps乳腺炎症模型组和药物缓解组(β-sitosterol+lps)。qpcr及 western blot检测4个不同组别中caspase3、bax等相关基因表达的影响。结果如附图4所示，1μmβ-谷甾醇能显著降低caspase3、bax基因及蛋白的表达 (p《0.01)。
56.这些发现表明，β-谷甾醇可以预防改善lps诱导的牛乳腺上皮细胞相关凋亡因子的表达，具有抗凋亡的功效。
57.实施例6
58.β-谷甾醇对lps诱导牛乳腺上皮细胞中hif-1α通路的影响：
59.细胞接种于六孔板，分为4组，分别为对照组、1μmβ-谷甾醇药物组， 1μg/ml lps乳腺炎症模型组和药物缓解组(β-sitosterol+lps)。qpcr检测 4个不同组别中hif-1α、mtor等相关基因表达的影响。结果为附图5所示， lps处理组hif-1α、mtor基因表达显著低于空白对照组(p《0.01)，而当添加1μmβ-谷甾醇时能显著恢复lps诱导牛乳腺上皮细胞的hif-1α、 mtor基因表达变化(p《0.01)。
60.这些发现表明，β-谷甾醇可能通过调控hif-1α和mtor通路改善lps 诱导的牛乳腺上皮细胞炎症反应。
61.本发明的工作原理是：
62.该β-谷甾醇在缓解奶牛乳腺炎症中的应用，利用实时荧光定量检测炎症相关基因的表达水平以及利用蛋白质印迹检测相关蛋白，发现β-谷甾醇降低 il-1β、tnf-α炎症因子的表达、降低caspase3、bax凋亡因子的表达；利用荧光显微镜，发现β-谷甾醇改善lps引起的细胞内活性氧累计，具有抵抗奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的功能。本发明中β-谷甾醇通过调控hif-1α降低相关炎症因子表达，预防lps诱导的奶牛乳腺炎症发生，符合绿色健康养殖并提高经济效益。本发明也是首次为β-谷甾醇预防lps导致的奶牛乳腺炎症的抗炎功效提供了新的方向。
63.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。