冠状病毒疫苗组合物、方法及其使用与流程

本公开内容在一些方面涉及用于治疗和/或预防冠状病毒感染的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括重组肽和蛋白质，所述重组肽和蛋白质包括冠状病毒抗原和免疫原，例如冠状病毒s蛋白肽，包括基于sars-cov-2贝塔(b.1.351)毒株的s蛋白肽由三聚体化tm标签多肽间二硫键连接形成的亚单位疫苗。

背景技术：

1、冠状病毒感染广泛范围的鸟类和哺乳动物，包括人类。冠状病毒可能每年在人体内传播，通常会引起轻微的呼吸系统疾病，尽管在婴幼儿、老年人和免疫功能低下的人群中严重程度更高。但是，某些冠状病毒，包括中东呼吸综合征冠状病毒(mers- cov)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov-1)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (sars-cov-2)，具有高致病性。冠状病毒的高致病性、空气传播性、高病死率和模糊确定的流行病学使得迫切需要有效的疫苗和相关的治疗药剂。特别是，迫切需要能够迅速诱导针对sars-cov-2的有效免疫应答的疫苗。本发明提供了满足上述和其它需要的方法、用途和制品(article ofmanufacture)。

技术实现思路

1、在一些实施方案中，本文公开了包含多种重组多肽的蛋白质，每种重组多肽包括连接到胶原的c-末端前肽的冠状病毒表面抗原，其中重组多肽的c-末端前肽形成多肽间二硫键。

2、在一些实施方案中，本文公开了重组亚单位疫苗，其包括来自冠状病毒(例如sars-cov-2贝塔(b.1.351)的s蛋白或其片段的胞外域(例如，没有跨膜和细胞质结构域)，其在框内与能够形成二硫键连接的同源三聚体的胶原的c-前肽融合。由此产生的重组亚单位疫苗(例如s-三聚体)可以从转染的细胞中表达和纯化，并且预期为三聚体形式的天然构象。这解决了当病毒抗原以可溶性形式表达为重组肽或蛋白质而没有跨膜和/或细胞质结构域时经常遇到的病毒抗原错误折叠问题。这种错误折叠的病毒抗原不能忠实地保持天然的病毒抗原构象，并且常常不能产生中和抗体。

3、在一些实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征(sars)冠状病毒(sars-cov-1)、sars冠状病毒2(sars-cov-2)、sars样冠状病毒、中东呼吸综合征(mers) 冠状病毒(mers-cov)、mers样冠状病毒、nl63-cov、229e-cov、oc43-cov、 hku1-cov、wiv1-cov、mhv、hku9-cov、pedv-cov或sdcv。

4、在前述任一实施方案中，表面抗原可以包括冠状病毒刺突(s)蛋白或其片段或表位，其中表位可选地是线性表位或构象表位，并且其中蛋白质包括三种重组多肽。

5、在前述任一实施方案中，表面抗原可以包括信号肽、s1亚单位肽、s2亚单位肽或其任意组合。

6、在前述任一实施方案中，表面抗原可以包括信号肽、受体结合结构域(rbd) 肽、受体结合基序(rbm)肽、融合肽(fp)、七肽重复序列1(hr1)或七肽重复序列2(hr2) 或其任意组合。

7、在前述任一实施方案中，表面抗原可以包括s蛋白的受体结合结构域(rbd)。

8、在前述任一实施方案中，表面抗原可以包括s蛋白的s1亚单位和s2亚单位。

9、在前述任一实施方案中，表面抗原可以不含跨膜(tm)结构域肽和/或细胞质 (cp)结构域肽。

10、在前述任一实施方案中，表面抗原可以包括蛋白酶裂解位点，其中蛋白酶可选地为弗林蛋白酶(furin)、胰蛋白酶、因子xa、凝血酶或组织蛋白酶l。

11、在前述任一实施方案中，表面抗原可以不含蛋白酶裂解位点，其中蛋白酶可选地为弗林蛋白酶(furin)、胰蛋白酶、因子xa、凝血酶或组织蛋白酶l，或者可以包含不可被蛋白酶裂解的突变的蛋白酶裂解位点。

12、在前述任一实施方案中，表面抗原可以是可溶解的或不直接结合到脂质双层，例如膜或病毒包膜。

13、在前述任一实施方案中，在蛋白质的重组多肽中表面抗原可以相同或不同。

14、在前述任一实施方案中，表面抗原可以直接融合到c-末端前肽，或可以通过接头(例如包含甘氨酸-x-y重复序列的接头，其中x和y独立地是任何氨基酸并且可选地是脯氨酸或羟脯氨酸)连接到c-末端前肽。

15、在前述任一实施方案中，蛋白质可以是可溶解的或不直接结合到脂质双层，例如膜或病毒包膜。

16、在前述任一实施方案中，蛋白质可以结合到受试者的细胞表面受体，可选地其中受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。

17、在前述任一实施方案中，细胞表面受体可以是血管紧张素转换酶2(ace2)、二肽基肽酶4(dpp4)、树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3-抓取非整合素(dc-sign)或肝脏/淋巴结-sign(l-sign)。

18、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以是人胶原。

19、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括proα1(i)、proα1(ii)、proα1(iii)、proα1(v)、proα1(xi)、proα2(i)、proα2(v)、proα2(xi)或proα3(xi)的c-末端前肽或其片段。

20、在前述任一实施方案中，在重组多肽中c-末端前肽可以相同或不同。

21、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:67-80中任一个，或与seq id no:67-80中任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同源性的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

22、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:67或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

23、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:68或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

24、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:69或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

25、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:70或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

26、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:71或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

27、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:72或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

28、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:73或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

29、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:74或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

30、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:75或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

31、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:76或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

32、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:77或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

33、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:78或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

34、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:79或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

35、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括seq id no:80或与其至少95％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

36、在前述任一实施方案中，c-末端前肽可以包括包含甘氨酸-x-y重复序列连接到seq id no:67-80中任一个的n-末端的序列，其中x和y独立地是任何氨基酸并且可选地是脯氨酸或羟脯氨酸，或与其至少90％相同的氨基酸序列，能够形成多肽间二硫键并使重组多肽三聚化。

37、在前述任一实施方案中，每种重组多肽中的表面抗原可以为融合前构象。

38、在前述任一实施方案中，每种重组多肽中的表面抗原可以为融合后构象。

39、在前述任一实施方案中，每种重组多肽中的表面抗原可以包括seq id no: 27-66和81-85中任一个或与其至少80％相同的氨基酸序列。

40、在前述任一实施方案中，重组多肽可以包括seq id no:1-26和86-95中任一个或与其至少80％相同的氨基酸序列。

41、本文还提供了包含本文提供的蛋白质的免疫原。本文提供了包含直接或间接连接到纳米颗粒的本文提供的蛋白质的蛋白质纳米颗粒。本文提供了包含本文提供的蛋白质的类病毒颗粒(vlp)。

42、本文还提供了编码本文提供的蛋白质的一种、两种、三种或更多种重组多肽的分离核酸。在一些实施方案中，编码s蛋白肽的多肽在框内与编码胶原的c-末端前肽的多肽融合。在一些实施方案中，本文提供的分离核酸可操作地连接到启动子。

43、在一些实施方案中，本文提供的分离核酸是dna分子。在一些实施方案中，本文提供的分离核酸是rna分子，可选地是mrna分子，例如核苷修饰的mrna、非扩增mrna、自扩增mrna或反式扩增mrna。

44、本文还提供了包含本文提供的分离核酸的载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。

45、在一些方面，本文提供了包含本文提供的载体的病毒、假病毒或细胞，可选地，其中病毒或细胞具有重组基因组。在一些方面，本文提供了免疫原性组合物，其包含本文提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、vlp、分离核酸、载体、病毒、假病毒或细胞以及药学上可接受的载体。

46、本文还提供了包含本文提供的免疫原性组合物和可选佐剂的疫苗，其中疫苗可选地是亚单位疫苗。在一些实施方案中，疫苗是预防性和/或治疗性疫苗。可选佐剂可在初始剂和/或加强剂中使用。独立地，初始剂和/或任意一剂或多剂加强剂的佐剂可包括：含铝佐剂，例如含明矾和/或氢氧化铝的佐剂；含寡核苷酸的佐剂，例如含cpg寡脱氧核苷酸(cpg-odn)的佐剂；含tlr9激动剂的佐剂；含可代谢油、α-生育酚、和/或聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(吐温-80)的佐剂，例如水包油乳液形式的含角鲨烯、α-生育酚、和吐温-80的佐剂；或任意一种佐剂组合。

47、在一些方面，本文提供了产生蛋白质的方法，包括：在宿主细胞中表达本文提供的分离核酸或载体，以产生本文提供的蛋白质；并纯化蛋白质。本文提供了通过本文提供的方法产生的蛋白质。

48、本文提供了用于在受试者中产生对冠状病毒的s蛋白肽或其片段或表位的免疫应答的方法，包括向受试者施用有效量的如本文提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、vlp、分离核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗，以产生免疫应答。在一些实施方案中，本文提供的方法用于治疗或预防冠状病毒感染。在一些实施方案中，产生免疫应答抑制或减少了受试者中冠状病毒的复制。在一些实施方案中，免疫应答包括细胞介导的应答和/或体液应答，可选地包括产生一种或更多种中和抗体，例如多克隆抗体或单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫应答针对冠状病毒的s蛋白肽或其片段或表位，但不针对c-末端前肽。在一些实施方案中，由于先前暴露于一种或更多种冠状病毒，对受试者的施用不会导致受试者中的抗体依赖性增强(ade)。在一些实施方案中，当随后暴露于一种或更多种冠状病毒时，施用不会导致受试者中的抗体依赖性增强(ade)。在一些实施方案中，方法进一步包括初免步骤(priming step)和/或加强步骤(boosting step)。在一些实施方案中，通过局部、经皮、皮下、皮内、口服、鼻内(例如，鼻内喷雾剂)、气管内、舌下、口腔、直肠、阴道、吸入、静脉内(例如，静脉注射)、动脉内、肌肉内(例如，肌肉注射)、心内、骨内、腹腔内、跨粘膜、玻璃体内、视网膜下、关节内、关节周围、局部或应用皮肤(epicutaneous)给药来进行给药步骤。在一些实施方案中，以单剂量或具有一个间隔或更多个间隔的一系列剂量施用有效量。在一些实施方案中，在不使用佐剂的情况下施用有效量。在一些实施方案中，有效量与佐剂一起施用。

49、本文提供了方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文提供的蛋白质，以在受试者中产生针对冠状病毒的中和抗体或中和抗血清。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，可选地是人类或非人类灵长类动物。在一些实施方案中，方法进一步包括从受试者分离中和抗体或中和抗血清。在一些实施方案中，方法进一步包括通过被动免疫向人类受试者施用有效量的分离中和抗体或中和抗血清，以预防或治疗冠状病毒感染。在一些实施方案中，针对冠状病毒的中和抗体或中和抗血清包括针对冠状病毒s蛋白肽或其片段或表位的多克隆抗体，可选地，其中中和抗体或中和抗血清不含或基本不含针对胶原的c-末端前肽的抗体。在一些实施方案中，中和抗体包括针对冠状病毒s蛋白肽或其片段或表位的单克隆抗体，可选地，其中中和抗体不含或基本不含针对胶原的c-末端前肽的抗体。

50、在一些方面，本文提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、vlp、分离核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗用于诱导受试者中对冠状病毒的免疫应答，和/或用于治疗或预防冠状病毒感染。

51、在一些方面，本文提供了本文提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、 vlp、分离核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗的用途，用于诱导受试者中对冠状病毒的免疫应答，和/或用于治疗或预防冠状病毒感染。在一些方面，本文提供了本文提供的蛋白质、免疫原、蛋白质纳米颗粒、vlp、分离核酸、载体、病毒、假病毒、细胞、免疫原性组合物或疫苗的用途，用于制造用于诱导受试者中对冠状病毒的免疫应答的药物或预防剂，和/或用于治疗或预防冠状病毒感染。

52、本文还提供了用于分析样品的方法，包括：将样品与本文提供的蛋白质接触，并检测蛋白质与能够特异性结合冠状病毒的s蛋白肽或其片段或表位的分析物之间的结合。在一些实施方案中，分析物是识别s蛋白肽或其片段或表位的抗体、受体或细胞。在一些实施方案中，结合指示样品中存在分析物，和/或样品来源于的受试者中存在冠状病毒感染。

53、本文提供了试剂盒，其包括本文提供的蛋白质和含有或固定蛋白质的基质、垫或小瓶，可选地其中试剂盒是elisa或侧向流动检测试剂盒(lateral flow assay kit)。