一种自噬抑制协同光热治疗靶向杀死肿瘤细胞的金纳米药物合成方法

1.本发明涉及药物合成技术领域，特别是指一种自噬抑制协同光热治疗靶向杀死肿瘤细胞的金纳米药物合成方法。


背景技术：

2.癌症也被称为恶性肿瘤，已经成为2l世纪威胁人类生命健康的主要疾病之一。目前比较常见的癌症治疗手段有手术治疗、化学药物治疗、放射线治疗。手术治疗主要是指用手术方法切除癌症肿瘤块和被癌瘤浸润累及的组织器官。手术治疗对大多数恶性肿瘤来说，是一种有效的，也是运用最普遍的治疗手段，但对于晚期肿瘤及一些比较敏感部位的肿瘤，手术的风险极高，对病人的创伤很大，并且会引起一系列的手术并发症。化学药物治疗是使用一些能够损害癌细胞生长的化学药物来阻止癌细胞的生长。但是正常细胞的生长也会受到伤害，机体的某些正常的组织和器官会产生明显的毒性反应。放射线治疗是利用放射性同位素产生的放射线来进行治疗。放射线能够直接或间接杀死癌症组织细胞，但是放射线不可避免的会对人体正常组织造成影响和损伤，如恶心恶吐、白细胞减少以及食欲不振等。
3.光热治疗是指在近红外有吸收的光热试剂吸收近红外的光，并转化为热能从而杀死恶性肿瘤细胞。恶性肿瘤组织的生长速度比正常组织的生长速度要快，肿瘤组织的血管生长杂乱，并且是畸形的。因此，肿瘤里的毛细血管很容易受压，血流量也没有正常组织的血流量大，且肿瘤组织的血管大多是对热敏感度很低的新生血管，耐热性没有正常组织血管好，血液的流速也缓慢，这导致散热很慢，因此在光热治疗过程中肿瘤组织部位的温度上升很快，比周围正常组织的温度要高很多，温差可高达10℃。当周围正常组织在治疗的过程中达到约40℃时，肿瘤组织的温度可达50℃左右，这一温差可以确保当肿瘤组织的温度达到治疗临界温度时，正常组织不会受到损伤。并且高温环境会使细胞处于供氧不足、ph值低的环境中，这更加促使肿瘤组织的耐高温性降低，进一步加快肿瘤组织细胞的死亡。因此，光热治疗已经成为一种有效的恶性肿瘤治疗方法。
4.光热治疗的关键是找到合适的光热试剂。良好的光热试剂需要具有高的热转换效率及生物相容性好等特点。纳米金材料一直是研究的热点，金纳米粒子的表面等离子体共振峰(spr峰)与纳米粒子的形状以及尺寸等因素有关，因此可以通过控制纳米金的形貌尺寸等来调控spr峰的位置，并且金纳米材料还具有光吸收截面面积大、光热转换效率高及生物相容性好等优点。类海胆金因其本身的特殊结构被广泛地用于生物检测、细胞标记及疾病诊断等方面。但是传统类海胆金的合成通常利用模板法来合成，合成的尺寸不可控，合成效率偏低，不能很好的满足科研需求，因此能够找到简单、绿色、高效率的合成方法是研发抗癌药物的关键。
5.例如，专利cn107308462a公开了一种海胆状纳米金的绿色制备方法及其在肿瘤成像及治疗中的应用，该发明主要是以氯金酸为金源，依次加入稳定剂、还原剂、生长抑制剂，
采用一步合成法制备而成。该方法简单温和、绿色环保。合成的海胆状纳米金可作为造影剂应用于光声成像、正电子发射计算机断层成像和红外热成像等多种医学影像模式，患者只需要承受一种造影剂给药，即可达到多种诊断效果，且可以降低造影剂用量，进一步减轻毒副作用。此外，该材料在近红外光照射下，可实现光与热的转换，并可吸收大量射线，具有较高的光热转换效率，可以用于制备肿瘤细胞的光热治疗、放射治疗、或联合疗法的治疗剂。但是，金纳米粒子合成步骤复杂，没有利用金纳米粒子的特性进行有效的修饰合成多功能纳米材料，也并未对治疗效果，体外细胞治疗效果进行验证，从而无法验证材料真正的光热效果。
6.细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。调控自噬，可以抑制肿瘤的生长，增强化疗药物、纳米抗癌试剂对癌细胞的杀伤效果。
7.例如，专利cn104353074a公开了一种金介导的近红外光热效应与自噬抑制剂联合杀伤肿瘤细胞的方法，与现有技术相比，该发明中自噬抑制剂的引入，可以降低金纳米颗粒的用量，使用较低剂量的激光即可获得良好的肿瘤细胞杀伤效果，从而降低激光和金纳米颗粒对正常细胞组织造成危害的风险。但是，所有的金纳米粒子为金纳米笼，光热转换效率低，比表面积小，修饰物少；且没有靶向性，对肿瘤没有靶向治疗效果。


技术实现要素：

8.为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种自噬抑制协同光热治疗靶向杀死肿瘤细胞的金纳米药物合成方法；本发明利用自合成的类海胆状金纳米粒子(sul-au)为平台，通过在其表面修饰peg、beclin1、as1411，合成了一种新型纳米药物sul-au@peg@beclin1@as1411，既可以靶向肿瘤细胞，实现定向杀死肿瘤细胞的目的，又联合细胞自噬与光热治疗，大大的提高了金纳米材料在肿瘤光热治疗应用的效率。
9.为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
10.本发明提供一种自噬抑制协同光热治疗靶向杀死肿瘤细胞的金纳米药物合成方法，包括：
11.步骤1：合成sul-au
12.在圆底烧瓶中加入30ml水，加入一定量浓度为300mm的haucl4水溶液，进行搅拌加热，当溶液沸腾时，加入柠檬酸钠水溶液，柠檬酸钠和haucl4按照质量比1:3混合，在保持沸腾的情况下，搅拌加热10min，直至溶液变成酒红色，停止加热，冷却至室温，金种子au合成完成。
13.在反应瓶中，加入适量水，加入一定量的haucl4水溶液，进行搅拌，之后按照体积比1:100的量加入金种子溶液，并加入适量30mm的对苯二酚溶液，在室温下，搅拌40min，待溶液变成蓝紫色，停止搅拌，海胆金纳米粒子合成，类海胆金的尺寸为100nm左右，表面存在明显的凸起状。
14.步骤2：合成sul-au@peg
15.取1ml100ug/mlau溶液，加入1.5ml sh-m peg 1000(20ug/ml)，在室温下，反应12h；
16.产物经8500r/min转速下离心10min，去掉上清液，加入1ml去离子水，制成sul-au@peg。
17.步骤3：合成sul-au@peg@beclin1
18.在1ml sul-au@peg溶液中(100ug/ml)加入0.01ml的beclin 1(250ug/ml)，室温下反应24h；
19.产物经8500r/min转速下离心10min，去掉上清液，加入1ml的去离子水。
20.步骤4：合成sul-au@peg@beclin1@as1411
21.在1ml sul-au@peg@beclin1溶液中(100ug/ml)加入0.01ml的sh-as1411(10um/ml)，室温下反应12h；
22.产物经8500r/min转速下离心10min，去掉上清液，加入1ml的去离子水。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.本发明的sul-au@peg@beclin1@as1411纳米颗粒的合成步骤简单、绿色、易操作，能够完成环境友好型社会发展需求，合成的纳米颗粒尺寸均匀，分散效果好，纳米粒子形貌类似海胆，具有较高的光热转化效率和可修饰性。在808nm的红外激光照射下，sul-au@peg@beclin1@as1411能够显著提高类海胆金类纳米颗粒在肿瘤光热治疗方面的靶向性和高效性，在临床上肿瘤治疗方面具有非常广阔的应用前景。
附图说明
25.图1为本发明实施例1合成的sul-au的tem表征图；
26.图2为sul-au@peg@beclin1@as1411的紫外吸收光谱图；
27.图3为sul-au@peg@beclin1@as1411的光热效率图片；
28.图4为sul-au@peg@beclin1@as1411的细胞毒性测试图。
具体实施方式
29.为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体附图和实施例进行详细描述。
30.本发明中，所使用的材料及试剂未有特殊说明的，均可从商业途径得到。peg购买自上海芃硕生物科技公司，beclin1购买自吉尔生化(上海)公司，as1411购买自生工生物工程(上海)公司。
31.本发明提供一种自噬抑制协同光热治疗靶向杀死肿瘤细胞的金纳米药物合成方法，具体实施例如下。
32.实施例1
33.一种自噬抑制协同光热治疗靶向杀死肿瘤细胞的金纳米药物合成方法，包括：
34.步骤1：合成sul-au
35.在圆底烧瓶中加入30ml水，加入25ul浓度为300mm的haucl4水溶液，进行搅拌加热，当溶液沸腾时，加入900ul 1w/v％柠檬酸钠水溶液，柠檬酸钠和haucl4质量比为1:3，在保持沸腾的情况下，搅拌加热10min，直至溶液变成酒红色，停止加热，冷却至室温，金种子au合成完成。
36.在反应瓶中，加入10ml去离子水，加入10ul浓度为300mm的haucl4水溶液，进行搅
拌，之后按照体积比1:100的量加入金种子溶液，并加入1ml 30mm的对苯二酚溶液，在室温下，搅拌40min，待溶液变成蓝紫色，停止搅拌，海胆金纳米粒子合成，加水调整其浓度为100ug/ml；利用透射电镜进行表征测量，类海胆金的尺寸为100nm左右，表面存在明显的凸起状，如图1所示。
37.步骤2：合成sul-au@peg
38.取1ml100ug/ml sul-au溶液，加入1.5ml sh-m peg 1000(20ug/ml)，在室温下，反应12h；
39.产物经8500r/min转速下离心10min，去掉上清液，加入去离子水，制成100ug/ml的sul-au@peg溶液；
40.步骤3：合成sul-au@peg@beclin1
41.在1ml sul-au@peg溶液中(100ug/ml)加入0.01ml的beclin 1(250ug/ml)，室温下反应24h；
42.产物经8500r/min转速下离心10min，去掉上清液，加入去离子水得到100ug/ml的sul-au@peg@beclin1溶液；
43.步骤4：合成sul-au@peg@beclin1@as1411
44.在1ml sul-au@peg@beclin1溶液中(100ug/ml)加入0.01ml的sh-as1411(10um/ml)，室温下反应12h；
45.产物经8500r/min转速下离心10min，去掉上清液，加入1ml的去离子水，得到sul-au@peg@beclin1@as1411溶液。
46.对制备的sul-au@peg@beclin1@as1411进行相关性能测试，具体如下。
47.图1为sul-au的tem透射电镜图，通过图片可以看到合成的sul-au纳米粒子尺寸均一，粒径大约为100nm，分散均匀，合成方法简单、易应用。
48.1、紫外表征sul-au@peg@beclin1@as1411
49.对步骤1制备的sul-au溶液和本发明实施例1制备的sul-au@peg@beclin1@as1411进行紫外吸收光谱检测，见图2。
50.由图2可知，sul-au溶液的吸收峰在608nm附近，当在其表面依次修饰上peg、beclin1、as1411之后，sul-au@peg@beclin1@as1411的吸收峰为660nm，吸收峰发生红移。证明sul-au@peg@beclin1@as1411可以提高近红外光吸收效果，提高光热转换效率。即本发明制备的sul-au@peg@beclin1@as1411对于808nm的红外光照射，具有更好的红外吸收，从而实现更高的光热转换效率，具体如图2所示。
51.2、sul-au@peg@beclin1@as1411的光热效率
52.用功率密度为2.0w/cm2，波长为808nm的近红外光nir分别照射空白对照组的pbs溶液、sul-au@peg@beclin1@as1411溶液(50ug/ml)(溶剂为pbs)，并记录温度随照射时间的变化曲线，如图3所示。
53.由图3可知，sul-au@peg@beclin1@as1411在nir照射10min后，温度上升到79℃左右；而pbs溶液的温度基本保持原始温度不变。表明sul-au@peg@beclin1@as1411能够快速的吸收近红外光，并高效地转化为热能。即本发明制备的sul-au@peg@beclin1@as1411光热转换效率较高，能够将吸收的近红外光转化成热量。
54.3、sul-au@peg@beclin1@as1411的细胞毒性测试
55.将mcf-7细胞(乳腺癌细胞)加入到96孔板中，每孔1
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104个细胞，放在培养箱培养18h，待细胞贴壁，单孔长满大概70％-80％时，将培养液吸出，然后向96孔板中重新加入分别含有不同终浓度的sul-au@peg、sul-au@peg@beclin1@as1411的dmem细胞培养液，浓度依次为50ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ug/ml、10ug/ml，孵育8h之后，使用2.0w/cm2的808nm红外光nir照射2分钟，再进行孵育1h，吸出培养液。向每个孔加入10ul cck8和90ul培养液，放置培养箱孵育30min，放入酶标仪检测细胞活性，结果见图4。
56.通过图4可以看出，本发明所合成的sul-au@peg和sul-au@peg@beclin1@as1411本身对细胞没有毒性，但是加入808nm的nir光照之后，相对于未修饰自噬抑制剂beclin1和as1411的sul-au@peg，sul-au@peg@beclin1@as1411对mcf-7细胞产生了显著的杀伤效果，说明合成的材料具有良好的光热治疗效果。
57.综上可知，本发明利用自合成的类海胆状金纳米粒子(sul-au)为平台，合成了一种新型纳米药物sul-au@peg@beclin1@as1411，既可以靶向肿瘤细胞，实现定向杀死肿瘤细胞的目的，又联合细胞自噬与光热治疗，大大的提高了金纳米材料在肿瘤光热治疗应用的效率。
58.以上所述是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，作出若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。