一种新疆软紫草抗肝癌的有效物及其制备方法

1.本发明属于生物医药领域，涉及一种新疆软紫草抗肝癌的有效物及其制备方法。


背景技术：

2.新疆软紫草(arnebiaeuchroma(royle)johnst)作为药典记载的一种传统的中草药，已经在《本草纲目》中多有使用。在中医及维医的多年实践下，已经成熟的用于临床上很多疾病的治疗，其中就包含一些与肝脏相关的症状缓解，中医与维医虽没有关于ae治疗肝癌的明确记载，但均有将ae用于治疗肝病及肝癌相关症状的临床经验。研究发现ae中的水溶性部位抗hiv-1、hbv的药效显著，
3.目前已知的紫草萃取物其有效化学成份主要分为两大类：一类是脂溶性很强的萘醌类色素主要包括紫草素及其衍生物，例如乙酰紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、二甲基丙烯酰紫草素等；另一类是水溶性成分如多糖和酚酸类。药理学研究表明新疆紫草具有杀菌抗炎、护肝、抗hiv、抗生育、抗肿瘤、延缓衰老以及免疫调节等作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种新疆软紫草抗肝癌的有效物及其制备方法，从新疆软紫草中提取得到的石油醚部位具有抗肝癌的作用，该有效部位可以作为延缓肝癌进程，辅助化学疗法的候选药物。
5.为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：
6.一种新疆软紫草抗肝癌的有效物及其制备方法，其特征在于，所述新疆软紫草的石油醚部位抗肝癌药效最好。
7.采用上述技术方案，技术原理如下：
8.新疆软紫草不同提取部位对人肝癌细胞hepg2细胞的生长增殖均具有抑制作用，并且aep及aee对hepg2均表现出较强的细胞毒性，其ic50值分别达到6.25μg
·
ml-1(fig3-1a)、100μg
·
ml-1(fig3-1b)，而aew表现出较弱的细胞毒性，其ics0值达到了1.5mg
·
ml-1(fig3-1c)；aen对hepg2未表现出明显的作用(fig3-1d)；此外aep对h22细胞的作用也很强，ic50值达到了3μg
·
ml-1。并且随着aep、aee浓度的增加，hepg2细胞凋亡发生率逐渐增高，且以中晚期凋亡为主。人肝癌细胞hepg2空白对照组的凋亡率为9.27％，经aep、aee处理后，凋亡率分别增加至63.80％、40.14％，且aep组具有剂量依赖性的增加。新疆软紫草中石油醚提取物的作用最好，该部位还可以以增加bad的蛋白表达，抑制bcl-2蛋白表达；该提取部位还可改善原位肝癌小鼠肝脾指数和胸腺指数，改善肝功能指标，减缓肝癌发展进程。
9.有益效果：
10.肝癌是一种常见的恶性肿瘤，因其在体内的增殖及侵袭速度快，发生的初期不易发现，发现时基本都处于晚期、恶化的状态，导致该病在全球的致死率位居前三。肝癌治疗的常用方法有：手术切除、局部介入治疗、化疗、放疗、生物治疗和中药治疗等，但这些已有的方法，都存在不同程度的副作用或不足。为此，开发中医药在抗肿瘤领域的应用已经成为
热点。
11.新疆软紫草作为药典记载的一种传统的中草药，已经在《本草纲目》中多有使用[110]。在中医及维医的多年实践下，已经成熟的用于临床上很多疾病的治疗，其中就包含一些与肝脏相关的症状缓解，中医与维医虽没有关于ae治疗肝癌的明确记载，但均有将ae用于治疗肝病及肝癌相关症状的临床经验。新疆软紫草的石油醚部位富集了紫草中的紫草素及其衍生物，具有良好的药理活性，现有的药理研究发现其具有良好的抗肿瘤活性，但对于肝癌的研究还不多见。发明人通过比较其中不同提取物，发现石油醚提取物是抗肝癌的有效部位。该药效可以拓宽对新疆软紫草在肝癌的应用范围。
附图说明
[0012]
图1为实验例中mtt及cck-8实验结果图。
[0013]
图2为实验例中annexinv-fitc/pi法检测结果图。
[0014]
图3为实验例中westernblot法检测bcl-2、bad蛋白表达结果及蛋白条带的相对强度图(检测条带灰度值)。
[0015]
图4为实验例中小鼠的体重变化及脏器指数。
[0016]
图5为实验例中试剂盒检测的小鼠肝功能指标。
[0017]
图6为实验例中小鼠肝脏组织表观形态及切片的结果图。
具体实施方式
[0018]
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解
[0019]
本发明，但并不因此限制本发明。
[0020]
实施例1：新疆软紫草根不同提取物的制备过程
[0021]
称取一定量的剪断后的新疆软紫草根，按照料液比(w/v)＝3∶1～5∶1加入石油醚提前一天浸泡，第二天在恒温水浴锅中，温度控制在58摄氏度内，回流提取3次，时间分别为3h、3h、1h，所得液体合并浓缩，主要成分为萘醌类色素，石油醚提取后的药渣晾干后用70％丙酮按照相同的方法回流提取3次，提取时间分别为2h、3h、2h，温度控制在60～62摄氏度之间，所得提取液合并，浓缩至可流动的状态，再分别使用乙酸乙酯、正丁醇萃取至萃取液不变色，将萃取液浓缩，下层的水层也浓缩，并冷冻干燥成粉末备用。
[0022]
实验例2：关于各提取部位是否对肝癌细胞增殖具有抑制作用，本发明人进行了如下的实验：
[0023]
1.通过mtt法及cck-8法检测各提取物的体外抗肝癌作用。
[0024]
(1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至5
×
104个/ml，在96孔板中每孔加入100μl细胞悬液；
[0025]
(2)于37℃5％co2培养箱中过夜，待次日细胞贴壁后，吸去孔内培养液，药物孔分别加入给定浓度的各提物100μl，对照孔与调零孔每孔加入100μl无fbs培养基，每组均设4～6个复孔(平行孔)，用pbs填充其他空白孔。细胞放入培养箱(37℃5％co2)培养24h；
[0026]
(3)培养结束，每孔加入10/15μlmtt(5mg/ml)，培养3～4h；
[0027]
(4)终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μlmdso，37℃温箱孵育10min或摇床低速振荡10min；
[0028]
(5)用酶标仪在490nm波长下测od值，按下式计算细胞活性。
[0029]
细胞活性(％)＝(给药组od值-调零组od值)/(对照组od值-调零组od值)
×
100％
[0030]
2.细胞凋亡检测
[0031]
正常培养细胞，新疆软紫草根石油醚提取物及乙酸乙酯提取物处理24小时，设置对照组、石油醚提取物组、乙酸乙酯提取物组各浓度梯度。收集细胞培养液于15ml离心管，用pbs洗涤一次，加入胰酶消化细胞，至细胞可轻轻吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有细胞，并收集到15ml离心管中，1000g离心5min，倒掉上清，加入1ml冰浴预冷的pbs，轻轻重悬细胞并计数，取5-10万重悬的细胞转移到1.5mlep管中，1000g离心5min并倒掉上清，加入195μlannexinv-fitc结合液轻轻重悬细胞，加入5μlannexinv-fitc，轻轻混匀，加入10μl碘化丙啶(pi)染色液，轻轻混匀，室温(20-25℃)避光温浴10-20min，随后用滤膜过滤，置于冰上，在1h内检测完成，上流式细胞仪检测，流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测fitc绿色荧光，另一波长大于560nm的滤器检测pi红色荧光，导出数据。
[0032]
3.westernblot免疫印迹法分析石油醚提取物体外诱导肝癌细胞凋亡的机制
[0033]
一、细胞总蛋白的提取
[0034]
将细胞以1
×
107的细胞密度接种于6孔板，孵育过夜。第二天弃去培养基，空白组加入2ml培养基，溶剂对照组加入含1％odmso的培养基，给药组分别加入含石油醚萃取物浓度为6.25，3.125、1.5625、0.7845μg
·
ml-1的培养基，作用24h，24h后弃去细胞6孔板中的培养基，用冷的pbs洗涤2遍，每孔加入200μl蛋白裂解液，冰上裂解30min。将细胞刮下，并转移至管中，以4℃、12000r/min高速离心10min。离心后取上清，使用bca蛋白浓度试剂盒检测蛋白浓度。
[0035]
二、细胞总蛋白含量的测定(bca法)
[0036]
(1)需96孔板，测蛋白浓度的a液，b液，标准蛋白，要测的样品蛋白。
[0037]
(2)按要测的样品蛋白的数量来配ab液，每孔需ab混合液200μl(a∶b＝50∶1)。有6个样品，加上6个标准蛋白和空白对照，3个复孔。共有36个孔。则a液取10ml，b液取200μl两液混匀，加入96孔板，每孔200μl。然后加入标准蛋白25μl及样品蛋白(蛋白样品5μl+20μl去离子水，即稀释5倍)。(标准蛋白先配好浓度0，0.125，0.25，0.5，1.0，2.0mg/ml)。
[0038]
(3)将孔板放入37℃温箱孵育30min。
[0039]
(4)用酶标仪562nm处测od值，用标准曲线法计算蛋白浓度。
[0040]
(5)调整蛋白浓度后(用裂解液和4
×
上样缓冲液调整蛋白浓度)，98℃5min加热变性，插入冰中冷却后，于-20℃保存。
[0041]
三、制备sds-page凝胶
[0042]
(1)准备sds-page凝胶用玻璃槽：清洗玻璃板，将两块玻璃板(一个长板一个短板，其中一块为凹形)组合并放置于制胶架夹紧，于玻璃槽中加入去离子水验漏，确定灌制分离胶液面标志线(距样品梳子底部约0.5-1.0cm处)；
[0043]
(2)配制5％浓缩胶(制2块)：去离子水4.05ml；30％丙烯酰胺1.005ml；1.0mtris-clph6.80.75ml；10％aps0.06ml；10％sds0.06ml；temde(临灌胶前再加)0.006ml；
[0044]
(3)配制10％sds-page分离胶：去离子水7.08ml；30％丙烯酰胺6.0ml；1.5mtris-clph8.84.56ml；10％aps0.18ml；10％sds0.18ml；振动仪震动数秒；
[0045]
(4)灌制分离胶：在通风橱加temed0.012ml，立即灌胶，灌至分离胶液面标志线，立即加入无水乙醇与顶部平齐，分离胶凝固后倒掉无水乙醇；
[0046]
(5)灌制浓缩胶与插样品梳：用吸水纸尽可能吸干玻璃槽中的无水乙醇，轻轻加入5％浓缩胶液(注意避免产生气泡)，插入样品梳，使液面至样品梳上标志线位置，室温凝胶约40min；
[0047]
(6)取下有sds-page凝胶的玻璃板，置于密封袋中，并加入去离子水适量保持凝胶湿润，封口，于4℃冰箱中保存，备用。
[0048]
四、样品变性及电泳(恒压，浓缩胶80v10-30min，分离胶110v60-90min)
[0049]
(1)由-20℃冰箱取出调整浓度后的组织蛋白样品，37℃水浴融化，立即插入冰中(减少蛋白降解)。
[0050]
(2)吸取组织蛋白样品80μl加入1.5mlep管中，每样品管中分别加入20μl4
×
蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，旋涡数秒，短暂离心，98℃变性5min，立即插入冰中，快速冷却至室温，旋涡数秒，短暂离心。
[0051]
(3)移液枪吸取变性蛋白液20μl，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加至凝胶孔中，样品蛋白两端分别加入5μlmarker。
[0052]
(4)将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80v使样品通过浓缩胶(电压约8v/cm)。当染料进入分离胶后，将电压调高到110v(约11v/cm)，继续电泳约60min，使染料至分离胶底部位置，结束电泳。
[0053]
五、转膜
[0054]
(1)pvdf膜的预处理：剪裁与胶大小一致(8.3
×
6.0cm)的pvdf膜，将其浸入甲醇平衡5min以上，备用。(注意：必须保证pvdf膜完全浸于甲醇中)；
[0055]
(2)转移缓冲液制备：取一瓶配制转移缓冲液的固体粉末，溶于800ml去离子水+200ml甲醇，置于4℃冰箱，备用；
[0056]
(3)取与胶同样大小的滤纸与海绵，用转移缓冲液浸泡后待用；
[0057]
(4)取下电泳板，将其平置(使
″
凹
″
面玻璃板在下)，小心去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用1
×
转膜液漂洗一次。
[0058]
(5)转膜：将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为黑色海绵
→
1层白色海绵垫片
→
样品胶
→
pvdf膜
→
1层滤纸
→
1层白色海绵垫片(注意：排除气泡)
→
黑色海绵，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中(黑对黑)，并放入冰盒，周围用冰或冰袋冰盒包裹(使转移缓冲液保持在4℃左右)；正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动(膜侧对红色侧)。接通电源，恒流275-300ma60-90min，中间换一次转移电泳槽中的冰盒；小心取出转移膜，膜剪角或标记膜，在1
×
tbst液中漂洗两次后放入封闭液中封闭。
[0059]
六、封闭、抗体孵育及曝光
[0060]
(1)封闭：将转移后的膜放入封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭90min(或4℃过夜)；
[0061]
(2)一抗反应
[0062]
①
将一抗用抗体稀释液稀释1000倍，配制为一抗工作液；
[0063]
②
封闭结束后，回收封闭液，将膜用1
×
tbst漂洗2-3次至干净，剪膜，放入一抗工
作液中，4℃反应过夜；
[0064]
(3)洗膜
[0065]
回收一抗工作液，将膜用1
×
tbst洗涤三次(室温下缓慢摇动洗涤)，每次5min，洗净未结合的一抗；
[0066]
(4)二抗反应
[0067]
①
将对应的二抗用1
×
tbst稀释16000倍，配制为二抗工作液；
[0068]
②
将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中(室温、避光缓慢摇动)作用50min(不超过60min)；
[0069]
(5)洗膜：用1
×
tbst洗膜，方法同
″3″
，洗去游离二抗；
[0070]
(6)曝光及洗片：
[0071]
①
按1∶1(v/v)混合ecl试剂盒中两种液体；
[0072]
②
将上述混合液均匀铺在pvdf膜表面，室温作用2min。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住pvdf膜(避免在膜的上面出现气泡)；
[0073]
③
使用全能型成像系统曝光显影，并使用imagelab4.1.0软件分析。
[0074]
4.小鼠h22肝癌细胞原位模型的建立
[0075]
取对数生长期的h22细胞，用生理盐水调整细胞密度(每毫升2
×
106个
·
ml-1)，注射到km小鼠腹腔，作为瘤源小鼠，提供具有良好小鼠亲和力的h22细胞。一周后，抽取瘤源小鼠的腹水，离心(1000r/min、10min)收集h22细胞，生理盐水调整细胞密度(2
×
107个
·
ml-1)制成细胞悬液；选取健康雄性昆明种小鼠、麻醉后进行腹部手术，将肝脏暴露，向肝内注入10μlh22细胞悬液，棉签压迫止血，肝回纳腹腔，缝合伤口，小鼠肝癌细胞原位移植瘤模型建立完毕。另外，肝接种生理盐水代替h22细胞实施假移植。
[0076]
5.动物分组及处理
[0077]
将肝癌原位移植瘤模型建立成功的小鼠随机分为：模型组(model)、低剂量组(aep-l)、中剂量组(aep-m)、高剂量组(aep-h)、和阳性药组(环磷酰胺，ctx)，每组6只，假移植小鼠作为对照组(control)。手术24h后开始给药，低、中、高剂量组分别腹腔注射2.5、5、10mg
·
kg-1的aep溶液，对照组、模型组腹腔注射生理盐水，阳性药组按20mg
·
kg-1腹腔注射环磷酰胺，各组均连续处理14d。末次给药后，禁食24h，摘眼球取血于1.5mlep管中，全血标本于室温静置1h，4℃，1000rpm离心15min，取出上清，分装放于-80℃保存。取小鼠肝脏、脾脏、肿瘤组织，用生理盐水洗净后，滤纸拭干，分别称重、拍照。剪部分肝小叶用10％福尔马林固定用于制作病理切片，剩余部分放于-80℃保存备用。
[0078]
6.脏器指数测定
[0079]
末次给药12h后，小鼠称重，摘眼球取血后脱颈处死小鼠，剖取肝、脾、胸腺，各部分称重后计算各器官指数。
[0080]
7.血清肝功能指标检测
[0081]
测定血清中丙氨酸氨转移酶(alt)、胆红素(tbil)、碱性磷酸酶(akp)、谷氨酰胺转肽酶(γ-gt)和白蛋白(albumin，alb)水平，实验的具体操作流程按照试剂盒说明书进行。
[0082]
8.肝组织学检测
[0083]
用10％福尔马林固定肝组织，常规石蜡包埋、切片、he染色，光学显微镜400倍视野下观察肝组织形态学变化。
[0084]
9.数据分析
[0085]
每组实验独立重复3次，westernblot实验结果采用imagej软件对图片进行灰度值处理，实验中计量数据以平均值
±
标准差(x
±
sd)表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，并用单向anova分析，使用graphpadprism6.0软件对实验数据进行绘图及分析，
[0086]
关于新疆软紫草根各部位对肝癌细增殖的抑制作用，由图1可知石油醚、乙酸乙酯部位对hepg2均表现出较强的增殖抑制作用细胞存活率的下降呈一定的浓度依赖性，而水层表现出较弱的抑制作用；正丁醇提取物对hepg2未表现出明显的作用；此外石油醚部位对h22细胞的作用也很明显。
[0087]
关于新疆软紫草根提取物诱导肝癌细胞凋亡，如附图2所示随着石油醚及乙酸乙酯提取物浓度的增加，hepg2细胞凋亡发生率逐渐增高，且以中晚期凋亡为主。此结果表明这两个部位能够促进hepg2细胞凋亡。由图2可见，人肝癌细胞hepg2对照组的凋亡率为9.27％，经石油醚及乙酸乙酯处理后，凋亡率分别增加至63.80％、40.14％且aep组具有剂量依赖性的增加。结果表明，石油醚提取物能够诱导hepg2细胞凋亡的作用较强，而乙酸乙酯也具有诱导hepg2细胞凋亡的作用，但相较于石油醚提取物，其诱导凋亡作用稍弱，且不具有剂量依赖性。
[0088]
关于石油醚提取物对肝癌细胞凋亡相关蛋白的调控作用，从图3的westernblot结果表明，石油醚提取物处理hepg2肝癌细胞的结果如图所示，当给予0.78μg
·
l-1、1.56μg
·
l-1、3.125μg
·
l-1和6.25μg
·
l-1的aep孵育肝癌细胞hepg2，24h后，与空白组相比，给药组bad蛋白表达水平逐渐升高，aep从1.56μg
·
l-1开始可以增加bad的蛋白表达，大量研究显示bad为促凋亡蛋白，能够促进肝癌细胞的凋亡，而bcl-2蛋白是抗凋亡的蛋白。因此，我们又检测了aep对bcl-2蛋白表达的影响，结果表明当给予上述浓度的aep孵育肝癌细胞24h后，bcl-2蛋白表达明显受到抑制，并且bcl-2的变化呈剂量依赖性的递减，同时可以看出，溶剂dmso对细胞蛋白的表达没有显著影响。
[0089]
为了验证体外研究筛选出的结果，本发明人使用体外药效较好的aep(10mg
·
kg-1、5mg
·
kg-1、2.5mg
·
kg-1)进行小鼠抗肝癌实验，动物实验剂量依据cck-8实验结果(fig3-1d)进行换算设置。
[0090]
首先，我们成功地建立了h22小鼠原位肝癌模型。小鼠原位注射h22造模后第3天开始，每天腹腔注射生理盐水、不同剂量的aep。治疗14天后，实验期间空白组小鼠全部健康存活，体重从实验开始的21.8
±
1.96g小幅上升到实验结束时的22.57
±
2.56g；模型组小鼠在实验后期体重下降幅度大于正常小鼠，实验结束时本组平均体重17.89
±
0.76g，实验后期出现部分死亡；ctx治疗组小鼠全部存活，体重增长速度略快于正常组，快于模型组，但差异无统计学意义(p＞0.05)。实验结束时体重21.96
±
1.60g；紫草石油醚高剂量组小鼠全部存活，实验结束时平均体重23.2
±
3.21g。中剂量组和低剂量组小鼠体重变化趋势和模型组一致，组间数据无显著性差异(p＞0.05)，实验结束时体重都显著高于正常组。实验后期中剂量组小鼠1只死亡，低剂量组小鼠出现2只死亡，高剂量组全部存活。与空白组比较，aep治疗能显著延长小鼠的生存时间。此外，各组的肝、脾、胸腺指数
[0091]
如图4所示，与空白组相比，模型组的脏器指数均显著性下降(p＜0.05)，并且给药后的脏器指数呈剂量依赖性的上升，但只有aep-h组的肝脏系数与模型组有显著性差异(p
＜0.05)。与空白组比较，模型组小鼠血清中ast、tbil、akp酶及γ-gt的含量显著升高(p＜0.05)，alt水平无显著变化，肝功能出现明显异常。与模型组比较，给药组的ast、alt、akp及γ-gt水平呈剂量依赖性降低，tbil含量变化不规律，其中给药各组的akp酶和aep-h组γ-gt的变化具有显著性，其余指标不具有显著性差异(p＞0.05)。
[0092]
肝脏形态如下图所示，空白组小鼠表面光滑，颜色鲜艳，而模型组肉眼可见肿瘤结节形成，且肝脏明显变暗、变硬(fig3-6 a，fig3-6 b)，其余给药组小鼠肝脏均有肿瘤结节，与空白组小鼠肝脏相比表面粗糙，但与模型组相比，肿瘤形成不集中，体积相对较小，其中阳性药组与aep-h组肝脏表面相对光滑。为了观察aep体内抑制肿瘤生长的作用，将肝组织用he染色。从肝脏he染色结果可以看出，正常组小鼠肝小叶轮廓清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞核完成，细胞形态正常。模型组与空白组相比，肝小叶轮廓模糊，结构明显遭到破坏，中央静脉扩张明显，肝索排列紊乱，肝小叶及汇管区均有大量炎性细胞浸润。而ctx组的肝小叶轮廓较清晰，中央静脉周围肝细胞排列整齐，aep-l组的肝脏结构相对清晰，但也出现部分的细胞形态不正常，而aep-m、aep-h组的切片结果可以明显的看出大部分无正常细胞形态，许多细胞核丢失。说明aep可以改善小鼠肝癌发展进程。
[0093]
通过比较细胞存活率，可知ae各极性部位中aep、aee及aew对hepg2细胞具有较强的作用，aen无明显作用，作用强度由大到小分别为：aep＞aee＞aew。后续结果表明在无细胞毒性的剂量下，aep诱导肝癌细胞凋亡的作用强于aee，且具有剂量依赖性。当使用aep处理hepg2细胞24h后，细胞中促凋亡蛋白的表达呈剂量依赖性增加，抗凋亡蛋白呈剂量依赖性递减，说明aep具有促进肝癌细胞凋亡的作用，作用的机制可能与bc1-2凋亡蛋白家族相关。aep对肝癌小鼠具有显著的抑制作用，能够减缓肝上肿瘤的生长，能延长小鼠生存时间，减轻小鼠的不适感，改善肝功能。
[0094]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。