抑制剂SP600125的用途

抑制剂sp600125的用途
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及抑制剂sp600125的用途，通过降低衰老内皮细胞中fto的表达从而可作为靶向fto的抗衰老制剂使用。


背景技术：

2.衰老是指机体对环境的生理和心理适应能力进行性降低、逐渐趋向死亡的现象，是许多病理、生理和心理过程的综合作用的必然结果。与衰老相关的疾病主要是心脑血管疾病，包括动脉粥样硬化、心梗、脑梗等。现如今，人们寿命延长，新生儿出生率不断下降，社会年龄结构改变，与年龄增长相关的心血管(cv)和脑血管(cbv)疾病的患病率不断攀升。内皮细胞衰老是血管老化的一个标志，容易导致血管系统疾病，因此，发展针对内皮细胞衰老的抗衰老药物，与预防和治疗内皮细胞衰老相关的心脑血管疾病有重要的研究和应用价值。
3.已经报道的抗衰老药物包括达沙替尼和槲皮素、非瑟酮、哌柏隆胺等，大多数抗衰老药物是否有效还取决于细胞谱系、细胞类型，或者在体内表现出的细胞毒性，从而限制了它们在临床的潜在用途。寻找副作用更小、靶向清除能力更强的抗衰老药物是全球衰老研究领域共同追寻的目标。
4.sp600125是一种广谱jnk抑制剂，作用于jnk1、jnk2和jnk3，广泛用于jnk信号通路相关研究。fto是一种与肥胖相关基因，在调节体重和脂肪含量方面有重要作用。再者，fto蛋白还通过识别rna上m6a甲基化位点并去除甲基化修饰。有研究表明，fto敲低会加速人卵巢颗粒细胞衰老相关表型，fto活性丧失也导致培养的皮肤成纤维细胞受损和衰老。种种研究揭示了fto与衰老有着密切的关系。
5.目前关于sp600125抑制剂是否可以影响fto表达、fto是否可以调控内皮细胞衰老以及sp600125靶向fto相关抗衰老药物，均尚未见报道。介于皮细胞衰老相关心脑血管疾病的患病率不断上升，而针对内皮细胞衰老的药物鲜有报道，因此，研发副作用小、特异性高的内皮细胞抗衰老药物任重而道远。本发明为预防和治疗血管内皮细胞衰老相关疾病提供新的靶点，同时也提出抑制剂sp600125降低fto表达，从而可作为靶向fto的抗衰老制剂使用，实现了理论研究与实际应用的有效结合。


技术实现要素：

6.为解决防治内皮细胞衰老的难题，本发明提供了一种抑制剂sp600125的用途，即sp600125通过降低fto的表达从而可作为抗衰老制剂使用。
7.本发明为了达到上述目的，采取如下方案：
8.本发明首先公开了抑制剂sp600125的用途，通过降低fto的表达从而可作为抗衰老制剂使用。
9.抑制剂sp600125具有降低fto表达的作用，其实现机理是：在衰老的内皮细胞中fto表达增加，在衰老内皮细胞中加入20umol/l抑制剂sp600125处理24小时或48小时后衰
老内皮细胞fto表达下降。
10.抑制剂sp600125作为抗衰老制剂使用，其实现机理是：在衰老的内皮细胞中fto表达增加，fto敲低后内皮细胞衰老表型减弱，表明fto具有促进内皮细胞衰老作用，加入抑制剂sp600125可降低fto的表达，同时检测衰老相关指标，表明sp600125处理后内皮细胞衰老表型减弱，即sp600125具有靶向fto的抗衰老作用，可以作为抗衰老制剂使用。
11.本发明的有益效果体现在：
12.1、发明人通过研究发现，抑制剂sp600125通过降低衰老内皮细胞中fto的表达，起到抗衰老作用。在衰老的内皮细胞中fto表达增加，fto敲低后内皮细胞中衰老相关指标差异表达，确定fto具有促进内皮细胞衰老作用；20umol/l抑制剂sp600125处理24小时或48小时后衰老内皮细胞fto表达下降，即抑制剂sp600125可通过降低衰老内皮细胞中fto表达起到抗内皮细胞衰老作用，因此可作为靶向fto的抗衰老制剂使用，实现了理论研究与实际应用的有效结合。
13.2、本发明所使用的抑制剂sp600125降低fto表达，具有靶向fto，达到抗衰老效果，相较于一些天然产物类抗衰老药物而言具有更高的特异性，且对细胞增殖没有明显影响，具有实际应用的潜力。
附图说明
14.图1为本发明实施例中的fto在内皮细胞衰老模型中的表达结果图。其中图1a为fto的mrna基因表达结果分析图，通过qrt-pcr定量分析，比较对照组和实验组的差异，证实了fto基因在衰老的内皮细胞中表达明显上调(p《0.01，具有统计学意义)；图1b为fto的western blotting结果图，通过western blotting检测了fto蛋白在fto基因在衰老的内皮细胞中的表达水平，通过蛋白条带灰度分析得出fto蛋白表达在实验组中的表达显著提高(p《0.001，具有统计学意义)。
15.图2为本发明实施例中的fto促进内皮细胞衰老的结果图。其中图2a是衰老蛋白的western blotting结果图，图2b、2c、2d分别为p16、p21、γh2ax的蛋白结果统计图。通过比较对照组和实验组的差异，发现在干扰fto表达之后，衰老的内皮细胞中的衰老相关蛋白p21、p16表达与未敲低组相比，显著下降(p《0.001，具有统计学意义)。
16.图3为本发明实施例中的抑制剂sp600125降低衰老内皮细胞中fto表达的结果图。图3a为fto的western blotting结果图，采用il-17a单独或联合20umol/l sp600125处理24h或48h。提取蛋白，western blotting检测fto蛋白的表达情况。图3b为图3a中fto的western blotting结果统计图。结果显示sp600125抑制剂处理后fto蛋白表达水平明显下降(p《0.01，具有统计学意义)。图3c为fto免疫荧光图，采用免疫荧光进一步表征sp600125处理后细胞内fto的表达情况，fto表达明显降低。
17.图4为本发明抑制剂sp600125抗衰老效果图。其中，图4a为衰老相关蛋白p21、p16、γh2ax的western blotting结果图，采用il-17a单独或联合20umol/l sp600125处理24h或48h。提取蛋白，利用western blotting检测衰老细胞中衰老相关蛋白p21、p16、γh2ax的表达情况，结果显示sp600125抑制剂处理后衰老相关蛋白p21、p16表达水平显著下降(p《0.01，具有统计学意义)。图4b为p21免疫荧光染色图，采用免疫荧光进一步表征sp600125处理后细胞内p21的表达情况，p21表达明显降低。图4c为衰老相关β-半乳糖苷酶染色结果图，
衰老相关β-半乳糖苷酶染色结果表明sp600125处理后细胞衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞比例明显降低，即衰老相关β-半乳糖苷酶活性降低。
具体实施方式
18.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
19.实施例1：
20.分析fto在衰老的内皮细胞中的表达情况，在构建的内皮细胞衰老模型中，利用western blotting及qrt-pcr检测fto在转录水平和蛋白质翻译水平上的表达。
21.图1为fto在内皮细胞衰老模型中的表达结果图，其实现方式如下：
22.实验分为实验组合对照组，实验组利用30ng/ml il-17a处理人脐静脉内皮细胞(huvecs)24小时构建内皮细胞衰老模型，对照组则不做额外处理。提取两组细胞内总的rna，反转录成cdna，再以cdna为模板，进行qrt-pcr检测fto基因在衰老的内皮细胞中的表达水平。然后，利用30ng/ml il-17a和60ng/ml il-17a处理人脐静脉内皮细胞(huvecs)48小时构建内皮细胞衰老模型，对照组则不做额外处理，提取两组细胞中的蛋白，利用western blotting，检测fto蛋白的表达。
23.图1a为fto的mrna基因表达结果分析图，通过qrt-pcr定量分析，比较对照组和实验组的差异，证实了fto基因在衰老的内皮细胞中表达明显上调(p《0.01，具有统计学意义)。
24.图1b为fto的western blotting结果图，通过western blotting检测了fto蛋白在fto基因在衰老的内皮细胞中的表达水平，通过蛋白条带灰度分析得出fto蛋白表达在实验组中的表达显著提高(p《0.001，具有统计学意义)。
25.本实施例表明了fto在衰老的内皮细胞中表达增加。
26.实施例2：
27.分析fto促进内皮细胞衰老的作用，衰老的细胞表现为衰老相关蛋白p21、p16、γh2ax表达增加，衰老相关β-半乳糖苷酶活性增强，阳性染色增加等现象。首先sirna干扰了内皮细胞内fto的表达并检测huvecs衰老相关指标的表现情况，以分析fto在内皮细胞衰老中的作用。
28.图2为fto促进内皮细胞衰老的结果图，其实现方式如下：
29.将实验分为对照组和实验组，对照组设置：mock(加入与实验组等量的转染试剂)、nc(加入与实验组等量的转染试剂和si-nc)、si-fto(加入与实验组等量的转染试剂和si-fto)组，实验组设置：mock(加入适量的转染试剂)、nc(加入适量的转染试剂和50nmol/l si-nc)、si-fto(加入适量的转染试剂和50nmol/l si-fto)组，转染huvecs，6小时后，实验组加以30ng/ml il-17a处理48小时建立衰老细胞模型。提取细胞内总蛋白，利用western blotting检测衰老相关蛋白p21、p16、γh2ax的表达情况并统计。
30.通过比较对照组和实验组的差异，发现在干扰fto表达之后，衰老的内皮细胞中的衰老相关蛋白p21、p16表达与未敲低组相比，显著下降(p《0.001，具有统计学意义)，本实施例表明fto在内皮细胞衰老具有促进作用。
31.实施例3：
32.本实施例公开了sp600125抑制剂降低fto的表达，从而可作为靶向fto的抗衰老制剂的应用。
33.图3a为fto的western blotting结果图，采用il-17a单独或联合20umol/l sp600125处理24h或48h。提取蛋白，western blotting检测fto蛋白的表达情况。结果显示sp600125抑制剂处理后fto蛋白表达水平明显下降(p《0.01，具有统计学意义)。
34.图3b为图3a中fto的western blotting结果统计图。结果显示sp600125抑制剂处理后fto蛋白表达水平明显下降(p《0.01，具有统计学意义)。
35.图3c为fto免疫荧光图，采用免疫荧光进一步表征sp600125处理后细胞内fto的表达情况，fto表达明显降低。
36.图4a为衰老相关蛋白p21、p16、γh2ax的western blotting结果图，采用il-17a单独或联合20umol/l sp600125处理24h或48h。提取蛋白，利用western blotting检测衰老细胞中衰老相关蛋白p21、p16、γh2ax的表达情况，结果显示sp600125抑制剂处理后衰老相关蛋白p21、p16表达水平显著下降(p《0.01，具有统计学意义)。
37.图4b为p21免疫荧光染色图，采用免疫荧光进一步表征sp600125处理后细胞内p21的表达情况，p21表达明显降低。
38.图4c为衰老相关β-半乳糖苷酶染色结果图，衰老相关β-半乳糖苷酶染色结果表明sp600125处理后细胞衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞比例明显降低，即衰老相关β-半乳糖苷酶活性降低。
39.本实施例表明sp600125抑制剂可降低衰老细胞中fto的表达，并且sp600125抑制剂具有靶向fto，从而起到抗衰老效果。
40.如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。