一种棒状杂化纳米材料、含其的药物及制备方法

1.本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种具有肿瘤靶向性、增强的细胞膜相互作用和ph响应性的棒状杂化纳米材料、含其的药物及制备方法。


背景技术：

2.癌症发病率和死亡率在世界范围内迅速上升，使癌症成为大多数地区的主要死亡原因。化疗在癌症治疗中起着重要作用。但是单一的化疗存在耐药性、肿瘤消除不完全等局限性，严重影响了治疗效果。
3.为了提高治疗效果，许多其他治疗策略与化疗联合，形成双模式协同治疗癌症治疗。特别是光热治疗（ptt）不仅可以直接燃烧肿瘤，还可以辅助化疗的疗效。ptt与化疗联合治疗已被广泛研究，成为一种很有前途的治疗方法。但ptt-化疗的效果仍受限于载体的形态和载体的载药稳定性。但是，目前报道的光热和化疗协同治疗药物有的光热转换效率底，有的通过包覆载药稳定性差，并且大部分纳米药物为球形。然而，现有研究报道棒状纳米材料与球形纳米材料相比，可以增强细胞膜穿透，减少巨噬细胞内化，延长循环时间。因此，具有良好光热性能、稳定载药、靶向肿瘤、膜穿透性强的化疗/光热纳米治疗系统的开发仍是一个挑战。
4.基于以上问题，本技术利用靶向性环糊精准聚轮烷（fa-prs）改性aunr制备了具有良好光热性能、稳定载药、靶向肿瘤、膜穿透性强的杂化纳米材料aunr@fa-pr/peg。聚轮烷（pr）中的环糊精具有许多活性基团，如羟基、氨基或羧基，可通过共价键或配位负载药物，使负载的药物在生理环境中特别地稳定，并且环糊精可以在轴上自由移动，通过调整环糊精的位置来适应外部变化，有效地增强了pr和细胞之间的相互作用。因此，由aunr和fa-pr形成的杂化纳米材料将负载的药物稳定性增强，同时与癌细胞的相互作用增强。顺铂作为一种抗肿瘤化疗药物，通过ph响应性配位键装载在棒状杂化纳米材料中，制备棒状杂化纳米药物。同时，对棒状杂化纳米药物中的药物进行生理环境、酸性条件和体外释放实验，并对棒状杂化纳米药物的光热性能进行了研究。通过体内、体外实验研究了化疗和光热治疗的靶向协同抗肿瘤作用。


技术实现要素：

5.本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种具有肿瘤靶向性、增强的细胞膜相互作用和ph响应性的棒状杂化纳米材料、含其的药物及制备方法。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种棒状杂化纳米材料的制备方法，其包括如下步骤：1）制备fa-peg-sh：在叶酸的 dmso 溶液中，加入edc和 nhs后，于35-37
°
c避光反应1-3小时；然后加入到聚乙二醇peg的dmso溶液中，在室温下持续反应24-48小时，获得体系a；将 edc和 nhs添加到含3-巯基丙酸的dmso 溶液中并在35-37
°
c下搅拌反应1-3小时进行活化，获得活化混合液；然后将活化混合液加入到体系a中，在室温下继续搅拌36-48小
时，停止反应，经透析、离心、冷冻干燥获得固体fa-peg-sh；2）制备α-cd-cooh：将α-环糊精（α-cd）溶解在无水dmso中，然后加入氮甲基吡咯烷酮（dmap）和琥珀酸酐，在磁力搅拌下室温反应 24-36 小时，然后将其滴入4-8
°
c冷丙酮中使产物沉淀，经过滤、洗涤、干燥，得到白色固体粉末α-cd-cooh；3）制备fa-pr-sh：叶酸单端封端准聚轮烷由羧基化环糊精α-cd-cooh和fa-peg-sh自组装形成，具体为：将α-cd-cooh溶解在去离子水中，然后加入步骤1）制备所得fa-peg-sh，混匀，再在室温下避光反应36-48小时，反应液经透析、冷冻干燥获得叶酸单端封端准聚轮烷fa-pr-sh；4）制备mpeg-sh：甲氧基聚乙二醇mpeg 2000 和 n,n'-羰基二咪唑溶解在无水 dmf 二甲基甲酰胺中，在氮气保护下室温反应10-16小时，然后加入β-巯基乙胺，在氮气保护下继续反应24
ꢀ‑
36小时，经透析、冷冻干燥，得到mpeg-sh；5）在aunr溶液中加入fa-pr-sh和mpeg-sh的混合水溶液，在室温下搅拌反应36-48 小时，停止反应，离心收集沉淀，洗涤后，获得棒状杂化纳米材料（aunr@fa-pr/peg）。aunr@fa-pr/peg 分散在去离子水中并储存在 4
ꢀ°
c 的冰箱待用。
7.本发明中，叶酸缩写fa，聚乙二醇（peg），edc指 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，nhs 指n-羟基琥珀酰亚胺。dmso指二甲基亚砜。
8.具体的，步骤1）中，在含0.75 mol 叶酸的 dmso 溶液中加入0.4-0.6 mmol edc和 0.4-0.6 mmol nhs；将 0.6-0.8 mmol edc和0.6-0.8 mmol nhs添加到含0.4 mmol 3-巯基丙酸的dmso 溶液中；透析选用的透析袋截留分子量为3.5 kda。该步骤中，edc，nhs用作催化剂。
9.具体的，步骤2）中，将10-12 mmolα-环糊精溶解在无水dmso中，然后加入6.2 mmol氮甲基吡咯烷酮和62 mmol琥珀酸酐。
10.进一步的，步骤3）中，α-cd-cooh与fa-peg-sh的摩尔比为10-12:1；透析选用的透析袋截留分子量为7000-14000 kda。
11.进一步的，步骤4）中，将4g甲氧基聚乙二醇mpeg 2000 和400-430 mg n,n'-羰基二咪唑溶解在无水 dmf 二甲基甲酰胺中，在氮气保护下室温反应12小时，然后加入200-250 mgβ-巯基乙胺。
12.进一步优选的，步骤5）中，在1 ml、1 mg ml-1
的aunr溶液中加入4-6 ml fa-pr-sh和mpeg-sh的混合水溶液；fa-pr-sh和mpeg-sh的混合水溶液中，fa-pr-sh浓度为4-6 mg ml-1
，mpeg-sh浓度为0.20-0.35 mg ml-1
。
13.本发明提供了采用上述制备方法制备所得的棒状杂化纳米材料（aunr@fa-pr/peg）。
14.本发明还提供了一种包含上述棒状杂化纳米材料的药物，其经下述步骤制备获得：将25 mg 棒状杂化纳米材料（aunr@fa-pr/peg）分散在去离子水中，然后加入2-4 mg 顺铂（cddp），混匀，置于摇床中室温避光反应36-48小时，经离心、洗涤即得产物棒状杂化纳米药物（aunr@fa-pr/peg/cddp），4
°
c保存备用。
15.本发明目的和创新性在于制备一种基于fa-pr和aunr的ph响应、肿瘤靶向和增强细胞膜相互作用的棒状纳米材料（aunr@fa-pr/peg）及含其的药物（aunr@fa-pr/peg/cddp），以实现增强地靶向化疗/光热协同治疗。聚轮烷pr中的环糊精具有许多活性基团，如
羟基、氨基或羧基，可通过共价或配位键负载药物，使负载的药物在生理环境中特别地稳定，降低了其对有机体的毒副作用；而且环糊精可以在轴上自由移动，通过调整环糊精的位置来适应外部变化，有效地增强了pr和细胞之间的相互作用；叶酸靶向使得纳米药物能有效地在肿瘤区域富集；杂化纳米药物具有较高的光热转换效率。通过体内、体外实验研究棒状杂化纳米药物靶向化疗和光热治疗的协同抗肿瘤效果。
16.和现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1）棒状纳米材料（aunr@fa-pr/peg）制备所用原料廉价、生物相容性好，制备方法简单易操作，制备载药体系成本低且生物相容性好；2）棒状纳米药物（aunr@fa-pr/peg/cddp）具有极优的光热性能，具有肿瘤靶向性，能够使纳米药物在肿瘤部位聚集，配位载药使得负载的药物稳定性高，减少药物对有机体的毒副作用，棒状结构及pr上环糊精能自由移动使得纳米药物的膜穿透能力和细胞摄取能力增强，具有较高的化学和光热协同抗肿瘤活性。
附图说明
17.图1中，a为aunrs的tem图；b为aunr@fa-pr/peg的tem图；c为aunr@fa-pr/peg/cddp 中 au、s 和 pt 的元素映射图；图2中，a为蒸馏水和aunr@fa-pr/peg/cddp(1.5 w cm-2
, 50
ꢀµ
g ml-1
)的光热曲线；b为aunr@fa-pr/peg/cddp与功率相关光热曲线；c为不同功率激光照射aunr@fa-pr/peg/cddp溶液的温度变化(δt)；d为aunr@fa-pr/peg/cddp的浓度依赖性光热曲线；e为不同浓度(1 w cm-2
, 0, 25, 50, 100, 200 μg/ml)的aunr@fa-pr/peg/cddp溶液经激光照射后的温度变化(δt)；f为aunr@fa-pr/peg/cddp (100 μg/ml) 在激光(808 nm, 1.0 w cm-2
)照射的四个开关周期的温度变化；图3为aunr@fa-pr/peg/cddp被hepg2 细胞摄取成像；图4中，a为aunr和aunr@fa-pr/peg对hepg2细胞的毒性；b为aunr 和 aunr@fa-pr/peg 在 808 nm 激光 (1 w cm-2
) 照射下对 hepg2 细胞的毒性；c为cddp和aunr@fa-pr/peg/cddp对hepg2细胞的毒性；d为cddp 和 aunr@fa-pr/peg/cddp 对 hepg2 细胞的光热毒性；图5为aunr@fa-pr/peg/cddp经不同功率(50
ꢀµ
g ml-1
，0.75、1.5、2.25、3 w cm-2
) 激光照射（a）和相同功率激光照射不同浓度(1 wcm-2
，0、25、50、100、200
ꢀµ
g ml-1
) aunr@fa-pr/peg/cddp的光热成像图（b）；图6为不同处理组荷瘤小鼠的热成像图和肿瘤区域的温度；图7中，a为样品处理后第 14 天不同处理组荷瘤小鼠的照片；b为实验结束时不同处理组小鼠肿瘤的照片；c为治疗期间各组小鼠的重量变化；d为实验结束时不同处理组小鼠肿瘤的重量；e为治疗期间各组小鼠的肿瘤体积变化。
具体实施方式
18.以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
19.本发明中，室温指的是25
±5°
c。实施例中所用原料均为本领域可直接购买到的普
通市售产品。
20.实施例1一种棒状杂化纳米材料的制备方法，其包括如下步骤：1）制备fa-peg-sh：将叶酸fa (0.75 mol, 331.05 mg) 溶解在 10 ml干燥的dmso中，快速加入 edc (0.48 mmol, 92.02 mg) 和 nhs (0.48 mmol, 55.25 mg)后，体系在37
°
c避光反应2小时。然后将上述溶液缓慢滴加到含peg (0.2 mmol，800mg)的20 ml dmso溶液中，在室温下持续反应24小时，获得体系a。同时，将 edc (0.8 mmol, 153.36 mg) 和 nhs (0.8 mmol, 92.08 mg) 添加到含有 3-巯基丙酸 (0.4 mmol, 42.46 mg) 的 5 ml dmso 溶液中，在37
°
c下搅拌反应2小时进行活化，获得活化混合液，然后将活化混合液加到上述体系a中，在室温下继续搅拌48 小时，停止反应。将溶液装入透析袋（3.5 kda）中，然后将透析袋放入蒸馏水中透析 48 小时，以除去溶剂和未反应的物质。离心除去透析液中的游离 fa，得到淡黄色溶液。将淡黄色溶液冷冻干燥（-84
°
c放置36 h，下同），得到淡黄色蓬松固体fa-peg-sh。
21.2）制备α-cd-cooh：将α-环糊精（10 g，0.0103 mol）溶解在30 ml无水dmso中，然后加入氮甲基吡咯烷酮（dmap）（757.45 mg，6.2 mmol）和琥珀酸酐（6.2 g，0.0620 mol），在磁力搅拌下室温反应 24小时。然后将上述溶液缓慢滴入4-8
°
c冷丙酮中使产物沉淀，过滤收集沉淀物，用丙酮洗涤三次，然后将沉淀物置于真空干燥箱中室温干燥三天，得到白色固体粉末α-cd-cooh。
22.3）制备fa-pr-sh：叶酸单端封端准聚轮烷由羧基化环糊精α-cd-cooh和fa-peg-sh自组装形成，具体为：将制备好的α-cd-cooh (60.8 mg, 0.044 mmol)溶解在尽可能少的去离子水中，然后将步骤1）制备所得fa-peg-sh (20 mg, 0.0044 mmol)加入到上述溶液中，再超声处理10分钟使混匀。 最后在室温下避光反应36小时，反应液进行透析处理48小时（透析袋截留分子量7000-14000 kda），透析液冷冻干燥，收集获得的产物叶酸单端封端准聚轮烷（fa-pr-sh）。
23.4）制备mpeg-sh：甲氧基聚乙二醇mpeg 2000 (4 g) 和 n,n'-羰基二咪唑cdi (421 mg) 通过超声溶解在 20 ml 无水dmf中，在氮气保护下室温反应 12小时，然后向反应体系中加入β-巯基乙胺（2.61 mmol，201 mg），在氮气保护下继续反应24小时，然后用1 kda透析袋在去离子水中透析24小时，除去溶剂和未反应物质，透析液冷冻干燥，得到白色蓬松固体mpeg-sh。
24.5）制备棒状杂化纳米材料（aunr@fa-pr/peg）：在1 ml、1 mg ml-1
的aunr（根据已报道文献制备：ye, x., zheng, c., chen, j., gao, y., murray, c. b., using binary surfactant mixtures to simultaneously improve the dimensional tunability and monodispersity in the seeded growth of gold nanorods. nano lett. 2013, 13(2), 765
–
771）溶液中，加入5 ml 含fa-pr-sh（5 mg ml-1
）和peg-sh（0.3 mg ml-1
）的混合水溶液，反应体系在室温下搅拌反应48 h。停止反应，离心收集沉淀，沉淀用去离子水洗涤两次，得到杂化纳米材料（aunr@fa-pr/peg）。 aunr@fa-pr/peg分散在去离子水中并储存在 4
ꢀ°
c冰箱待用。
25.本发明还提供了一种包含上述棒状杂化纳米材料的药物，其经下述步骤制备获
得：将25 mg 棒状杂化纳米材料（aunr@fa-pr/peg）分散在5 ml去离子水中，然后加入3 mg 顺铂（cddp），超声使其混匀，然后置于摇床中室温避光反应48小时，之后，将反应溶液离心，收集沉淀并用蒸馏水洗涤两次以除去未反应的cddp，得到产物棒状杂化纳米药物（aunr@fa-pr/peg/cddp），4
°
c保存备用。未反应的 cddp 采用文献报道的邻苯二胺比色法测定，计算出载药量约为 7.4%。
26.杂化纳米材料aunr@fa-pr/peg的形态主要通过透射电子显微镜 (tem) 进行测定，表征结果如图1所示。具体而言，将样品溶解在蒸馏水中，超声分散均匀，用移液管取出6
ꢀµ
l溶液，将溶液滴在普通碳膜上，室温自然干燥，最后用透射电子显微镜观察其形貌为，从图1中a可以看出：其为形貌和长径比均一的纳米棒，其长径比约为3.5。从图1中b可以发现：aunrs表面有明显的修饰层，说明aunr@fa-pr/peg成功制备，制备的杂化纳米材料仍保持棒状形态。aunr@fa-pr/peg/cddp中的au，pt和s通过元素映射图来表征，见图1中c，从图中可以看出au、s和pt元素在纳米棒上均匀分布，这证明了aunr@fa-pr/peg/cddp的成功制备。
27.为了研究棒状杂化纳米药物aunr@fa-pr/peg/cddp的光热转化能力，进行体外光热转化实验。将aunr@fa-pr/peg/cddp配制成50
ꢀµg·
ml-1
水溶液。 取 1 ml 溶液置于石英比色皿中，然后用808 nm激光（1.5 w cm-2
）照射该溶液10 min，照射过程中每15 s记录一次温度变化，蒸馏水作为空白对照组，结果如图2中a所示，从图中可以看出：蒸馏水组在激光照射10 min后温度达到33℃，温度与照射前相比仅上升了7℃，而aunr@fa-pr/peg/cddp处理组温度可达63℃，温度变化高达 35
ꢀº
c，足以杀死癌细胞。结果证实，aunr@ fa-pr/peg/cddp具有优异的光热性能。。
28.为研究棒状杂化纳米药物aunr@fa-pr/peg/cddp 的浓度与温度变化的关系，配制不同浓度（0、25、50、100、200
ꢀµ
g ml
‑ꢀ1）的aunr@fa-pr/peg/cddp溶液，然后用808 nm激光（1 w cm-2
）照射10 min，照射过程中每10 s记录一次温度变化。同时，将特定浓度的aunr@fa-pr/peg/cddp （50
ꢀµ
g ml-1
）暴露于具有不同功率密度 (0.75、1.5、2.25、3 w cm-2
) 的 808 nm 激光下，记录预定时间点溶液温度的变化（结果见图2中b-e）。结果显示：aunr@fa-pr/peg/cddp溶液的温度变化随着激光功率的增加和辐照时间的延长而增加，对应不同的辐照功率（0.75、1.5、2.25、3 w cm-2
)，最终温度分别达到 47、60、68、70
º
c。47
º
c的温度不足以杀死癌细胞，因此使用0.75 w cm-2
的激光照射无法有效杀死肿瘤细胞。68
º
c和70
º
c的温度对于正常组织来说可能过高，因此使用 2.25 和 3 w cm-2 的激光照射可能会对正常组织造成损伤。样品用1.5 w cm-2 激光照射10 min，温度可升至60
º
c，可有效杀死癌细胞，且对正常组织无损伤。从图 2中d 和 e 可以看出：温度变化随着aunr@fa-pr/peg/cddp溶液浓度的增加和辐照时间的延长而增加。不同浓度（0、25、50、100、200
ꢀµ
g ml-1）的溶液用 808 nm 激光（1 w cm-2
）照射 10 min，温度分别提高了 7、21、26、34 和 42
º
c，最终温度达到 33、47、52、60 和 68
º
c。
29.为了进一步研究 aunr@fa-pr/peg/cddp 的光热稳定性，用 800 nm 激光（1 w cm
‑ꢀ2) 开关照射aunr@fa-pr/peg/cddp溶液四个循环周期(见图2中f)，每个周期包含 10 min的近红外光照射期，然后将温度自然冷却至室温。使用热电偶装置记录所有温度变化。光热转换效率计算为26.35%。
30.应用试验
通过体外和体内实验来研究棒状纳米药物的光热转化性能和生物性能。通过体外细胞实验来研究制备材料在细胞中的分布，通过细胞毒性试验来研究棒状纳米药物的生物相容性和其靶向化疗和光热治疗协同抗肿瘤效果。
31.将 人肝癌细胞hepg2接种在含有10% 胎牛血清 (fbs)、链霉素 (100 u/ml)、青霉素 (100 u/ml) 的dmem培养基的6 孔板中，并置于 5% co
2 培养箱中在 37
°
c放置 24 小时。 然后，弃去培养基，将含有 240 μg fitc 标记的 aunr@fa-pr/peg/cddp 的 2 ml dmem培养基溶液加入板中，进一步孵育 4 h。吸出培养基并用pbs将细胞洗涤3 次以去除游离的aunr@fa-pr/peg/cddp。向孔板中加入4%多聚甲醛固定10分钟，然后将细胞用pbs洗涤3次，并在黑暗中用核染料dapi染色15分钟。最后用激光共聚焦扫描显微镜（clsm）观察细胞摄取情况，结果见图3，绿色荧光是荧光素标记的纳米药物（左图），蓝色是dapi染色的细胞核（中间图）。从图3中可以看出：在细胞质中有很亮的绿色，证明纳米药物可以通过受体介导和棒状优势内吞进入细胞质（右图）。
32.通过3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)法研究aunr 和 aunr@fa-pr/peg 的细胞毒性和光热细胞毒性。选择人肝癌细胞hepg2作为细胞实验模型。以含10%胎牛血清的dmem为培养基，将hepg2细胞以每孔7000个细胞置于96孔板中，每孔加入90
ꢀµ
l培养基培养24 h，再加入10
ꢀµ
l不种浓度(10, 30, 60, 90, 120
ꢀµ
g ml-1
) 的aunr、aunr+laser、aunr@fa-pr/peg 和 aunr@fa-pr/peg+laser，每个浓度设计四个复孔。 aunr 和 aunr@fa-pr/peg 处理组的细胞继续培养 48 h。之后，将mtt的pbs溶液（50
ꢀµ
l，1 mg ml-1
）加入每孔中，继续培养4 h。然后弃去培养基，每孔加入 dmso（100
ꢀµ
l/孔），37 ℃孵育 10 min，将板在摇床上轻轻摇晃 5 min，使结晶甲脒充分溶解。用酶标仪测量 570 nm 处的吸收值。aunr+laser和aunr@fa-pr/peg+laser处理组的细胞继续培养24 h，每孔用808 nm激光（1 w cm-2
）照射3 min，再继续培养24 小时，向每孔加入50 μl mtt溶液，继续培养4 h。除去培养基，再向每孔加入 100
ꢀµ
l dmso，将培养板在37
°
c保持10min，轻轻摇动使结晶甲脒充分溶解。使用酶标仪测量其在 570 nm 波长处的吸收值。计算3次测量平均值作为存活率，结果见图4中a和b。图4中a的结果显示：随着aunr浓度的增加其对hepg2细胞的毒性增大，而aunr@fa-pr/peg的浓度高达120
ꢀµ
g/ml时对hepg2细胞仍然无毒，说明修饰后的金棒具有较好的生物相容性。图4中b的结果显示：当aunr 和aunr@fa-pr/peg处理的hepg2细胞用808 nm的激光照射时均显现出了较好的光热毒性，证明修饰后的金棒仍然有较好的光热性质。
33.将处于对数生长期的 hepg2 细胞以7000个/孔的密度接种在 96 孔板中，每孔加入 90 μl dmem培养基。孵育 24 h，之后将不同浓度（1、2、5、8、10 μg/ml cddp）的cddp、cddp+laser、aunr@fa-pr/peg/cddp 和 aunr@fa-pr/peg/cddp +laser加入板中，每个浓度设计四个重复孔。cddp和aunr@fa-pr/peg/cddp处理组的细胞继续培养48小时，之后将 50
ꢀµ
l 1 mg ml-1 mtt 的 pbs 溶液加入板中，细胞继续孵育 4 h，然后去除培养基。每孔加入 100
ꢀµ
l dmso，然后将96孔板在 37
°
c 的环境中保持 10 分钟，再轻轻摇晃使细胞内结晶甲脒充分溶解，最后使用酶标仪在 570 nm 波长处测量吸收值。cddp+laser和aunr@fa-pr/peg/cddp+laser处理组的细胞继续培养24 h，每孔用808 nm激光（1 w cm-2
）照射3 min，再继续培养24 小时，向每孔加入50 μl mtt溶液，继续培养4 h。除去培养基，再向每孔加入 100
ꢀµ
l dmso，将培养板在37
°
c保持10min，轻轻摇动使结晶甲脒充分溶解。使用酶标仪测量
其在 570 nm 波长处的吸收值。计算3次测量平均值作为存活率，结果见图4中c和d。从图4中c可以看出：负载在纳米材料中的药物在癌细胞中能够成功释放并保持原来的药效。图4中d结果显示：制备的纳米药物具有较好的化学和光热协同治疗作用。
34.将aunr@fa-pr/peg/cddp用蒸馏水配制成浓度为50
ꢀµ
g ml-1
的溶液，用不同功率（0.75、1.5、2.25、3 w cm-2
) 的激光照射10 min。同时，还制备了不同浓度（0、25、50、100、200
ꢀµ
g ml-1
）的aunr@fa-pr/peg/cddp水溶液，用808 nm激光（1 w cm-2
）照射10 min，用红外热像仪（thermo shot f30, nippon avionics co., ltd, japan）记录 aunr@fa-pr/peg/cddp 溶液的温度变化，结果见图5。图5中a显示： aunr@fa-pr/peg/cddp（50 μg ml-1
）经不同的辐照功率强度辐照时，实时红外热成像信号随辐照强度的增加而增强，证明温度随辐照强度的升高和照射时间延长而升高。 图5中b显示：实时红外热成像信号随着aunr@fa-pr/peg/cddp浓度的增加而升高，证明温度随着aunr@fa-pr/peg/cddp浓度的增加而升高。根据注射aunr@fa-pr/peg/cddp 在小鼠体内的荧光成像结果，在注射 aunr@fa-pr/peg/cddp 6小时后，棒状杂化纳米药物开始进入肿瘤并在其中富集。因此，在尾静脉注射aunr@fa-pr/peg/cddp 6小时后研究其光热转换能力。当肿瘤大小达到约 120 mm
3 时，将 h22 荷瘤小鼠分为三组。三组小鼠分别通过尾静脉注射生理盐水、aunr@fa-pr/peg（au：55 mg au/kg）和 aunr@fa-pr/peg/cddp 溶液（au：55 mg au/kg）。注射 24 小时后，用 808 nm 激光（1.0 w cm-2
）照射肿瘤部位 10 min，使用红外热成像相机（thermo shot f30，nippon avionics co.，ltd，japan）每2min捕获一次热成像，并测量肿瘤部位的温度，结果见图6。图6的结果显示：生理盐水治疗组肿瘤实时红外热成像信号较弱，随着照射时间的延长，肿瘤温度变化不大。而aunr@fa-pr/peg和aunr@fa-pr/peg/cddp治疗组小鼠肿瘤区域红外热成像信号随照射时间延长而变强，肿瘤温度变化较大，最高分别可达63.5
°
c 和 64.2
°
c。
35.通过体内实验进一步研究棒状纳米药物的生物相容性和靶向化疗和光热治疗协同抗肿瘤效果。将鼠肝癌细胞h22植入昆明小鼠右腋窝建立肿瘤模型。使用已建立的模型研究了aunr@fa-pr/peg/cddp 的抗肿瘤活性。当肿瘤体积达到平均 90-100 mm
3 的大小时，荷瘤小鼠被随机分成六组。两组小鼠用生理盐水和cddp（3 mg/kg）处理，两组小鼠用aunr@fa-pr/peg（50 mg/kg，7.5 mg aunr eq.）处理，最后两组小鼠通过尾静脉注射aunr@fa-pr/peg/cddp (50 mg/kg, 7.5 mg aunr eq., 1.5 mg/kg cisplatin eq.)。其中盐水和 aunr@fa-pr/peg 治疗组用作对照组。尾静脉注射后24小时，aunr@fa-pr/peg治疗组之一和aunr@fa-pr/peg/cddp治疗组之一使用 808 nm 激光 (1.0 w cm-2
) 照射 5 min。每隔一天使用游标卡尺测量肿瘤尺寸，直到第14 天。同时，监测荷瘤小鼠的体重。根据公式v = d2×
d/2（其中d为最短尺寸的肿瘤宽度，d为最长尺寸）计算肿瘤体积，结果见图7。图 7中a 显示了用六个样品处理后第 14 天荷瘤小鼠的照片。从图中可以看出：与其他组相比，aunr@fa-pr/peg/cddp+laser治疗组的肿瘤最小，证实了化学和光热协同治疗对癌症有显著的治疗效果。图7中b 和 d显示第14天各组小鼠的肿瘤照片和重量，结果也证明aunr@fa-pr/peg/cddp+laser 具有优异的抗肿瘤作用。图7中c 和 e显示了小鼠的体重和肿瘤的体积变化，表明cddp 治疗组小鼠的体重显着下降，这证明了 cddp 的生物毒性；其他所有治疗组小鼠体重均未见明显下降，证明了棒状杂化纳米材料、载药材料（棒状杂化纳米药物）和激光照
射载药材料的生物安全性。肿瘤体积结果显示：生理盐水和 aunr@fa-pr/peg 没有显示出任何抗肿瘤作用，与上述两组相比，aunr@fa-pr/peg+laser、cddp和aunr@fa-pr/peg/cddp治疗组对肿瘤出现了一定的治疗效果。aunr@fa-pr/peg/cddp+laser治疗组表现出最优异的抗肿瘤作用，证实了aunr@fa-pr/peg/cddp应是一种有前景的纳米药物用于靶向化疗和光热协同治疗癌症。
36.综上可看出：本发明棒状纳米药物的制备过程简单、成本低、生物相容性好且具有良好光热性能、稳定载药、靶向肿瘤、膜穿透性强的特性，将是一种非常有前景的化学和光热协同治疗癌症的纳米药物。