嗜黏蛋白阿克曼氏菌微生态制剂及其在蛋鸡上的应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及嗜黏蛋白阿克曼氏菌微生态制剂及其在蛋鸡上的应用。


背景技术：

2.脂肪肝综合征是笼养蛋鸡常见和多发的一种营养代谢疾病，主要原因是蛋鸡营养障碍导致内分泌失调、体内代谢紊乱，从而导致脂肪的过度沉积。患病鸡喜卧，腹部膨大下垂，触之柔软，有大量脂肪囤积，嗜睡，精神不振。患病鸡产蛋量会受到影响，生产性能和蛋品质的下降，特别是老年蛋鸡，蛋壳质量下降，破壳蛋、软壳蛋、沙壳蛋数量增加，给蛋鸡产业造成了巨大的经济损失。
3.鸡蛋是一种高胆固醇食物，正常摄入鸡蛋不会影响人体的血清胆固醇水平，但是对于高血脂、高胆固醇人群，仍需要严格控制鸡蛋的摄入量，因此开发低胆固醇鸡蛋具有较大的应用价值。
4.目前，主要通过在饲料中添加富含不饱和脂肪酸的脂肪(如亚油酸)、胆碱、肉碱等物质来缓解脂肪肝；也有通过中药调理防治脂肪肝；此外，通过添加抗生素改变肠道菌群结构，抑制有害细菌的增殖，减少对肝脏的损伤，也可以缓解脂肪肝。但抗生素的滥用会使家禽产生耐药性，家禽产品中的兽药残留情况越来越严重，随着“禁抗”口号的提出，减抗和无抗养殖已成为家禽行业的发展趋势。目前替抗产品主要有发酵饲料、酶制剂、抗菌肽、酸化剂、中草药、微生态制剂等，其中微生态制剂以其安全、无药物残留等优点在畜牧行业中已作为无公害绿色添加剂而被广泛重视和使用。常见的用作微生态制剂的益生菌包括乳酸菌、芽孢杆菌、双歧杆菌等，虽然种类繁多，但效果参差不齐，因此，本领域迫切需要开发一种安全、无毒无害的，用于预防/缓解蛋鸡脂肪肝，提高蛋品质的微生态制剂。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何提高家禽蛋品质和/或提高家禽蛋的蛋白高度和/或如何减少家禽腹部脂肪的堆积和/或如何降低家禽的血脂水平和肝脂水平和/或如何获得嗜黏蛋白阿克曼氏菌的新功能。
6.为了解决上述技术问题，本发明首先提供了嗜黏蛋白阿克曼氏菌的下述至少一种应用：
7.a1)所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌在制备治疗或缓解家禽代谢性相关疾病产品中的应用。
8.a2)所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌在提高家禽蛋品质或制备提高家禽蛋品质产品中的应用。
9.a3)所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌在提高家禽蛋的蛋白高度和哈氏单位水平中的应用。
10.a4)所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌在减少家禽腹部脂肪的堆积和/或减少家禽腹脂重
量和/或制备减少家禽腹脂重量的产品中的应用。
11.a5)所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌在缓解家禽肝脏病变或制备缓解家禽肝脏病变产品中的应用。
12.a6)所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌在维持家禽肝脏结构和形态的完整性和/或缓解家禽肝脏脂肪变性和/或制备缓解家禽肝脏脂肪变性的产品中的应用。
13.a7)所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌在降低家禽的血脂水平或制备降低家禽血脂的产品中的应用。
14.a8)所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌在降低家禽血清中胆固醇和甘油三酯和/或降低家禽肝脂的水平和/或制备降低家禽肝脂的产品中的应用。
15.a9)所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌在降低家禽蛋黄中胆固醇含量和/或制备降低家禽蛋黄中胆固醇含量的产品中的应用。
16.上文所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌可为嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)，其在美国菌种保藏中心atcc(american type culture collection)的菌株编号为atcc baa-835。
17.上文所述应用中，所述家禽可为蛋鸡，所述代谢性相关疾病可为蛋鸡脂肪肝综合征。
18.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种菌剂。所述菌剂含有上文所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌或/和上文所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的代谢物或/和上文所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养物。所述菌剂具有下述至少一种特性：
19.b1)治疗或缓解家禽代谢性相关疾病。
20.b2)提高家禽蛋品质。
21.b3)提高家禽蛋的蛋白高度和哈氏单位水平。
22.b4)减少家禽腹部脂肪的堆积和/或减少家禽的腹脂重量。
23.b5)缓解家禽的肝脏病变。
24.b6)维持家禽肝脏结构和形态的完整性和/或缓解家禽肝脏脂肪变性。
25.b7)降低家禽的血脂水平。
26.b8)降低家禽血清中胆固醇和甘油三酯的水平和/或降低家禽的肝脂水平。
27.b9)降低家禽蛋黄中胆固醇含量。
28.上文所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养物是将嗜黏蛋白阿克曼氏菌在微生物培养基中培养得到的物质(如含有嗜黏蛋白阿克曼氏菌和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有嗜黏蛋白阿克曼氏菌和分泌到固体培养基内的物质)。
29.上述菌剂的活性成分可为嗜黏蛋白阿克曼氏菌或/和嗜黏蛋白阿克曼氏菌的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
30.所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，嗜黏蛋白阿克曼氏菌或/和嗜黏蛋白阿克曼氏菌的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞
培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
31.根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。
32.上文中，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌的代谢物可为嗜黏蛋白阿克曼氏菌的发酵液。嗜黏蛋白阿克曼氏菌的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌，收集发酵液(含有嗜黏蛋白阿克曼氏菌和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为嗜黏蛋白阿克曼氏菌的代谢物。
33.上文所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌可为嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)，其在美国菌种保藏中心atcc(american type culture collection)的菌株编号为atcc baa-835。所述家禽可为蛋鸡，所述代谢性相关疾病可为蛋鸡脂肪肝综合征。
34.上文所述菌剂可为活菌菌剂、巴氏灭活菌菌剂或冻干粉菌剂。
35.所述活菌菌剂和/或所述巴氏灭活菌菌剂中所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌的有效菌浓度可大于等于1
×
108cfu/ml。
36.上文所述菌剂中，所述所述冻干粉的制备过程还可包括在所述培养物中加入冷冻保护剂进行真空冷冻干燥。所述冷冻保护剂可为脱脂奶粉。所述脱脂奶粉的添加量可为10％。
37.为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述菌剂的下述至少一种应用：
38.c1)所述菌剂在制备治疗或缓解家禽代谢性相关疾病产品中的应用。
39.c2)所述菌剂在提高家禽蛋品质或制备提高家禽蛋品质产品中的应用。
40.c3)所述菌剂在提高家禽蛋的蛋白高度和哈氏单位水平中的应用。
41.c4)所述菌剂在减少家禽腹部脂肪的堆积和/或减少家禽腹脂重量和/或制备减少家禽腹脂重量的产品中的应用。
42.c5)所述菌剂在缓解家禽肝脏病变或制备缓解家禽肝脏病变产品中的应用。
43.c6)所述菌剂在维持家禽肝脏结构和形态的完整性和/或缓解家禽肝脏脂肪变性和/或制备缓解家禽肝脏脂肪变性的产品中的应用。
44.c7)所述菌剂在降低家禽的血脂水平或制备降低家禽血脂的产品中的应用。
45.c8)所述菌剂在降低家禽血清中胆固醇和甘油三酯和/或降低家禽肝脂的水平和/或制备降低家禽肝脂的产品中的应用。
46.c9)所述菌剂在降低家禽蛋黄中胆固醇含量和/或制备降低家禽蛋黄中胆固醇含量的产品中的应用。
47.上文所述的应用中，所述家禽可为蛋鸡，所述代谢性相关疾病可为蛋鸡脂肪肝综合征。
48.上文所述的菌剂或应用中，所述蛋鸡可为28周龄的蛋鸡和/或64周龄的老年蛋鸡。
49.上文所述应用中，所述蛋鸡可为海兰褐蛋鸡。
50.上文所述的产品可为饲料、饲料添加剂和/或药物。
51.本发明通过对海兰褐蛋鸡灌服、饲料添加嗜黏蛋白阿克曼氏菌三种微生态制剂，包括活菌菌剂、巴氏灭活菌菌剂和冻干粉菌剂，结果表明，嗜黏蛋白阿克曼氏菌的菌剂可以降低海兰褐蛋鸡高脂饮食引起的血脂、肝脂水平的增加，减少体内脂肪沉积，提高鸡蛋品
质。本发明所提供的嗜黏蛋白阿克曼氏菌微生态制剂(菌剂)功能全面、无毒无害，且巴氏灭活菌菌剂及冻干粉菌剂与活菌菌剂在预防/缓解蛋鸡脂肪肝，提高蛋品质方面具有相同的作用效果，在贮存和添加方式方面具有更大的优势。本发明为嗜黏蛋白阿克曼氏菌作为蛋鸡养殖业新型微生态制剂提供了依据。
52.与现有技术相比，本发明优点如下：
53.(1)本发明首次报道嗜黏蛋白阿克曼氏菌能够预防/缓解蛋鸡脂肪肝，提高蛋品质，确定了一种新型的益生菌微生态制剂，可作为饲料添加剂使用，具有安全、无毒、无害的特性，具有广阔市场应用前景。
54.(2)本发明提供了嗜黏蛋白阿克曼氏菌微生态制剂的三种制备方法。
55.(3)嗜黏蛋白阿克曼氏菌巴氏灭活菌菌剂及冻干粉菌剂与活菌菌剂在预防/缓解蛋鸡脂肪肝，提高蛋品质方面具有相同的作用效果，在贮存和添加方式方面具有更大的优势。
附图说明
56.图1为肝脏解剖图。
57.图2为肝脏重和肝脏指数。
58.图3为肝脏病理切片图。标尺长度为200μm。
59.图4为嗜黏蛋白阿克曼氏菌活菌菌剂、灭活菌剂对蛋黄胆固醇含量的影响。
60.图5为肝脏、腹脂解剖图。
61.图6为嗜黏蛋白阿克曼氏菌冻干粉对老年蛋鸡蛋黄胆固醇含量的影响。
具体实施方式
62.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
63.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
64.下述实施例中的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)baa-835来源于美国菌种保藏中心atcc(american type culture collection，简称atcc)，菌株编号为atcc baa-835，下文简称baa-835。
65.本发明实例中的实验数据使用spss 22.0软件进行统计分析,采用单因素方差分析，p《0.05为差异有统计学意义。
66.实施例1、嗜黏蛋白阿克曼氏菌微生态制剂的制备
67.1.嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835活菌菌剂的制备
68.在无菌条件下，用无菌水对嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)菌株baa-835冻干粉进行重悬，吸取菌悬液，全部打入1-2个哥伦比亚血平板，200μl/个，涂布均匀后将平板置于厌氧培养箱(whitley dg250 anaerobic workstation，百徕普惠(北京)科技有限公司)，37℃培养5-7d，厌氧的气体成分为n2:co2:h2＝80:10:10，之后挑单菌落于
改良gam液体培养基(月示胨15g/l；胰酪蛋白胨10g/l；大豆胨3g/l；酵母浸粉5g/l；牛肉粉2g/l；消化血清粉13.5g/l；牛肝浸粉1.2g/l；葡萄糖3g/l；磷酸二氢钾2.5g/l；氯化钠3g/l；可溶性淀粉0.3g/l；l-半胱氨酸0.3g/l；硫乙醇酸钠0.15g/l，ph＝7.2)中活化两代。将活化好的baa-835按5％的接种量接种于厌氧的改良gam液体培养基中，置于37℃生化培养箱(lrh-250f，上海一恒科学仪器有限公司)中培养48h得到baa-835菌体培养液，可明显观察到液体培养基变浑浊，底部出现沉淀。培养结束后将菌体培养液8000rpm离心30min，弃上清，用无菌厌氧pbs重悬沉淀得到菌悬液，gam平板计数，调整菌悬液浓度使baa-835的含量为3.5
×
108cfu/ml，-80℃冰箱保存，作为嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835活菌菌剂，用于以下实施例。
69.其中：
70.(1)无菌厌氧pbs是直接用pbs(1.54g na2hpo4·
12h2o、0.24g kh2po4、8g nacl和0.2g kcl溶解并定容至1000ml)将甘油稀释至浓度为20％，装入厌氧瓶中，用自动抽换气装置(北京艾思普仪器有限公司)向厌氧瓶中通入氮气进行空气置换，待氧气耗尽后于高压灭菌锅中以121℃，15min灭菌，待冷却后分装到5ml离心管中，每管2ml,得到无菌厌氧pbs，冻存于-80℃的冰箱中待后续使用。
71.(2)gam平板是在改良gam液体培养基的基础上，按15g/l添加琼脂粉。
72.2.嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835巴氏灭活菌菌剂的制备
73.将步骤1中的嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835活菌菌剂(该菌剂的baa-835的含量为3.5
×
108cfu/ml)70℃水浴30min灭活，作为嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835的巴氏灭活菌菌剂，用于以下实施例。
74.3.嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉菌剂的制备
75.按照步骤1的培养方法得到baa-835菌体培养液，将baa-835菌体培养液8000rpm离心30min，弃上清，获得baa-835菌体沉淀，在baa-835菌体沉淀中加入10％的脱脂奶粉混匀，然后用冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)进行真空冷冻干燥(24h)，获得的冻干粉在-20℃保存。作为嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉菌剂，baa-835冻干粉真空冷冻干燥前发酵液的浓度为1
×
108cfu/ml(因为嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835活菌和巴氏灭活菌均可发挥作用，所以不考虑冻干过程中的损失率)，用于以下实施例。
76.实施例2、嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835活菌、灭活菌菌剂在缓解蛋鸡脂肪肝中的应用
77.1.实验方法：
78.本实施例所选取的蛋鸡模型为：高能低蛋白饲粮(hfd)诱导的脂肪肝模型。将80只体重相近(2.010
±
0.10kg)的28周龄海兰褐蛋鸡(涿州市博农禽业有限公司)，随机分为4组：对照组(nd)、高脂模型组(hfd)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌活菌缓解组(hfd_la)和嗜黏蛋白阿克曼氏菌巴氏灭活菌缓解组(hfd_pa)，每组20只。本实施例的实施地点在中国农业大学家禽试验基地(涿州，河北)，包括1周预饲期，18周正饲期。所有组在预饲期均饲喂基础日粮。
79.对照组(nd)：正饲期饲喂基础日粮，每只鸡每天灌胃5ml无菌pbs。
80.高脂模型组(hfd)：正饲期饲喂高能低蛋白日粮，每只鸡每天灌胃5ml无菌pbs。基础日粮和高能低蛋白日粮的配方和营养水平见表1。
81.表1日粮配方及营养水平
[0082][0083]
注：每千克日粮提供provided per kilogram of complete feed：mn,60mg；fe,80mg；cu,8mg；i,1.2mg；se,0.3mg.va,12,500iu；vd3,32,500iu；ve,18.75mg；vk3,2.65mg；vb1,2mg；vb2,6mg；vb12,0.025mg；泛酸pantothenic acid,12mg；烟酸niacin,50mg；叶酸folic acid,1.25mg；生物素biotin,0.325mg。
[0084]
嗜黏蛋白阿克曼氏菌活菌缓解组(hfd_la)：正饲期饲喂上述高能低蛋白日粮，每只鸡每天灌胃5ml嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835活菌菌剂(嗜黏蛋白阿克曼氏菌活菌制剂的有效菌浓度为3.5
×
108cfu/ml)。
[0085]
嗜黏蛋白阿克曼氏菌巴氏灭活菌缓解组(hfd_pa)：正饲期饲喂上述高能低蛋白日粮，每只鸡每天灌胃5ml实施例1的嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835巴氏灭活菌菌剂。
[0086]
在第18周末(正饲期的第126天)，对所有蛋鸡进行8h断料饥饿处理，然后称重并翅静脉采血，血液于4℃，3000rpm条件下离心10min，收集血清保存在-20℃冰箱。采血后将蛋鸡颈静脉放血致死，立即剖开腹腔摘取肝脏、腹脂。肝脏拍照称重，取肝组织保存于4％的多
聚甲醛固定液中；腹脂称重；快速收集肝脏组织样品，于液氮速冻后保存至-80℃超低温冰箱中。
[0087]
肝脏中脂质的测定方法：
[0088]
a)4℃解冻-80℃冷冻肝样,称取50mg左右于2ml离心管中并记录肝湿量；
[0089]
b)加入1ml氯仿/甲醇(2:1)，冰上匀浆，4℃过夜；
[0090]
c)加入0.3ml的蒸馏水，3 000rpm，离心10min；
[0091]
d)取0.2ml下层有机相，氮气吹干；
[0092]
e)加入0.2ml 5％triton(x-100)pbs复溶；
[0093]
f)采用胆固醇(tc)检测试剂盒(北京中生北控公司)和甘油三酯(tg)检测试剂盒(北京中生北控公司)对上述复溶液进行脂质测定。
[0094]
血清中脂质的测定方法：
[0095]
取血清送于兰博泰斯生物科技有限公司利用全自动生化检测仪器检测tc和tg的水平。
[0096]
2.实验结果：
[0097]
2.1嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835可减少蛋鸡腹部脂肪沉积
[0098]
表2中结果显示，hfd组蛋鸡的腹脂重和腹脂率显著高于nd对照组；hfd_la和hfd_pa组的腹脂重和腹脂率显著低于hfd组；表明灌胃嗜黏蛋白阿克曼氏菌活菌菌剂和巴氏灭活菌菌剂均可以抑制高脂饮食诱导的蛋鸡脂肪沉积，具有减脂作用。
[0099]
表2嗜黏蛋白阿克曼氏菌对腹脂的影响
[0100][0101]
注：sem代表均值的标准误差；p《0.05为差异显著性标准，p《0.01为差异极显著性标准。
[0102]
2.2嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835可降低蛋鸡血脂和肝脂水平
[0103]
表3中结果显示，hfd_la和hfd_pa组蛋鸡的血清中的胆固醇(tc)和甘油三酯(tg)含量、肝脏中的tg含量显著低于hfd组，hfd_la和hfd_pa组的肝脏tc含量有降低的趋势，表明灌胃嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835活菌菌剂和巴氏灭活菌菌剂均具有降脂的效果。
[0104]
表3嗜黏蛋白阿克曼氏菌对血脂和肝脂含量的影响
[0105][0106]
注：sem代表均值的标准误差；p《0.05为差异显著性标准，p《0.01为差异极显著性标准。
[0107]
2.3嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835活菌可减少蛋鸡肝脏脂质积累、缓解肝脂肪变性
[0108]
解剖结果显示，hfd组蛋鸡的肝脏较nd组体积增大(图1)，颜色明显变浅且偏黄，形成了由肥胖而造成的非酒精性脂肪肝。而hfd_la和hfd_pa组蛋鸡的肝脏表面光滑颜色体积都与nd对照组相似，没有出现明显的病理变化；与nd对照组相比，高脂饮食导致蛋鸡肝脏重量增加(图2中hfd代表)，hfd_la和hfd_pa组肝重有一定程度的下降(图2)，表明灌胃嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835可以改善蛋鸡肝脏肿大，具有预防脂肪肝的效果。
[0109]
将固定于4％的多聚甲醛溶液中的肝脏组织块切取适宜大小，做常规石蜡包埋，苏木精-伊红(he)染色。光镜观察结果显示，hfd组与nd组相比，肝细胞排列紊乱，部分细胞核溶解，肝细胞胞浆中出现大小不等的脂肪空泡，数量显著增多，说明高脂饮食确实造成肝组织损伤，引起脂肪变性。hfd_la和hfd_pa组与hfd组相比，肝细胞中的脂肪空泡数量明显减少，空泡体积明显减小，说明灌胃嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835活菌菌剂和巴氏灭活菌菌剂均有缓解蛋鸡脂肪变性造成的肝损伤和保护肝脏正常组织形态的作用。
[0110]
2.4嗜黏蛋白阿克曼氏菌可提高蛋品质
[0111]
正饲期第18周末，收集每个处理组蛋鸡的鸡蛋，每组10枚，连续测三天的蛋品质，并在收集蛋的12h内完成蛋品质的测定。采用蛋品质测定仪(det-6000，nabelco.,ltd.日本)测定蛋重、蛋壳强度、蛋白高度、哈氏单位、蛋黄颜色；采用蛋壳厚度测定仪(ti-pvx，orka technology ltd.以色列)测定蛋壳的厚度；分蛋器分离蛋黄并称重，计算蛋黄比重，蛋黄样品-20℃冰箱保存。实验结果如表4显示，与hfd组相比，hfd_la和hfd_pa组有提高哈氏单位的趋势，表明灌胃嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835活菌菌剂和巴氏灭活菌菌剂均具有提高蛋鸡蛋品质的作用。
[0112]
表4嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835对蛋品质的影响
[0113][0114]
注：sem代表均值的标准误差；p《0.05为差异显著性标准，p《0.01为差异极显著性标准。
[0115]
2.5嗜黏蛋白阿克曼氏菌可降低蛋黄胆固醇含量
[0116]
将冻存在-20℃冰箱的蛋黄样品在4℃解冻后，用玻璃棒搅拌使之充分混匀。称取混匀的样品100mg，加入4ml异丙醇，涡旋混匀；3000rpm离心10min，取上清，测定蛋黄中的胆固醇含量。图4结果显示，hfd组蛋鸡蛋黄胆固醇含量显著高于nd组，而hfd_la和hfd_pa组蛋黄胆固醇含量均显著低于hfd组，表明嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835活菌菌剂和巴氏灭活菌菌剂均可以降低蛋黄中胆固醇的含量。
[0117]
实施例3、嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉在老年蛋鸡上的应用
[0118]
1.试验设计
[0119]
本实施例选用64周龄健康海兰褐蛋鸡200只，禁食8h后翅静脉采血，分离血清，检测血清中tc、tg的含量(北京金海科隅生物科技发展有限公司)。根据血清tc、tg的含量以及产蛋率，挑选出140只鸡，随机分为两组，每组7个重复，每个重复10只鸡，保证两个组的初始体重(对照组：2.17
±
0.12kg；试验组：2.16
±
0.12kg)、产蛋率(对照组：89.6
±
5.67％；试验组：89.6
±
5.48％)、血清tc(对照组：3.71
±
0.42mmol/l；试验组：3.71
±
0.40mmol/l)、tg(对照组：8.59
±
2.80mmol/l；试验组：8.59
±
2.74mmol/l)水平一致。本实施例的实施地点在中国农业大学家禽试验基地(涿州，河北)，预饲期2周，正饲期12周。
[0120]
对照组(control)饲喂基础日粮，基础日粮组成和营养水平见表5。
[0121]
表5基础饲粮组成及营养水平(％)
[0122][0123][0124]
注：每千克日粮提供provided per kilogram of complete feed：mn,60mg；fe,80mg；cu,8mg；i,1.2mg；se,0.3mg.va,12,500iu；vd3,32,500iu；ve,18.75mg；vk3,2.65mg；vb1,2mg；vb2,6mg；vb12,0.025mg；泛酸pantothenic acid,12mg；烟酸niacin,50mg；叶酸folic acid,1.25mg；生物素biotin,0.325mg。
[0125]
试验组(treatment)在基础日粮中按109cfu只
·
天的量添加实施例1中制备的嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉菌剂，baa-835冻干粉真空冷冻干燥前发酵液的浓度为1
×
108cfu/ml。
[0126]
在正饲期第12周末(正饲期的第84天)，将所有蛋鸡饥饿处理8h后，称单只鸡重。所有试验鸡翅静脉采血，3000rpm，4℃离心10min，分离血清，测血清中tc、tg含量(北京金海科隅生物科技发展有限公司)。每个重复选取1只接近平均血脂水平的蛋鸡屠宰采样。颈静脉放血致死，立即剖开腹腔，摘取肝脏、腹脂。肝脏拍照称重；腹脂称重；快速收集肝脏组织样品，于液氮速冻后保存至-80℃超低温冰箱中。
[0127]
2.实验结果：
[0128]
2.1嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉可减少蛋鸡腹部脂肪沉积
[0129]
解剖结果显示(图5)，对照组(图5中左图)蛋鸡肝脏颜色略微发黄，质地松软易碎，嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉添加组(图5中右图)蛋鸡肝脏表面光滑，质地紧实，肝脏颜色呈现为正常的暗红色，肝脏表面无出血点，基本恢复正常；且嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉添加组蛋鸡的腹脂明显减少(表6)。由表6可知，与对照组(control)相比，嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉添加组(treatment)可显著降低腹脂重和腹脂率，与观察到的解剖结果一致。
[0130]
表6嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉对老年蛋鸡脂肪沉积的影响
[0131][0132]
注：结果以“平均值
±
标准差”表示；p《0.05为差异显著性标准，p《0.01为差异极显著性标准。
[0133]
2.2嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉可降低老年蛋鸡血清、肝脏胆固醇含量
[0134]
由表7可知，与对照组(control)相比，嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉添加组(treatment)有降低血清总胆固醇含量的趋势。
[0135]
表7嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉对老年蛋鸡血脂和肝脂含量的影响
[0136][0137]
注：结果以“平均值
±
标准差”表示；p《0.05为差异显著性标准，p《0.01为差异极显著性标准，0.05《p《0.10为有差异趋势。
[0138]
2.3嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉可提高老年蛋鸡蛋品质
[0139]
表8嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉对老年蛋鸡蛋品质的影响
[0140][0141]
注：结果以“平均值
±
标准差”表示；p《0.05为差异显著性标准，p《0.01为差异极显著性标准，0.05《p《0.10为有差异趋势。
[0142]
由表8可知，与对照组(control)相比，嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉的添加有提高哈氏单位的趋势，极显著增加蛋壳厚度，表明添加嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉有提高老年蛋鸡蛋品质的作用。
[0143]
2.4嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉可降低老年蛋鸡蛋黄胆固醇含量
[0144]
将冻存在-20℃冰箱的蛋黄样品在4℃解冻后，用玻璃棒搅拌使之充分混匀。称取混匀的样品100mg加入4ml异丙醇，涡旋混匀；3000rpm离心10min，取上清测定蛋黄中的胆固醇含量。图6结果显示，与对照组(图6中control所示)相比，嗜黏蛋白阿克曼氏菌baa-835冻干粉的添加(图6中treatment所示)可极显著降低蛋黄胆固醇含量。
[0145]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。