一种双酶纳米诊疗剂及其制备方法与应用

1.本发明涉及医用纳米材料领域，尤其涉及一种双酶纳米诊疗剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.由纳米酶介导的催化治疗在肿瘤等疾病中具有极大的应用前景。例如，具有类过氧化物酶活(pod)的纳米酶可催化分解肿瘤微环境中的过氧化氢(h2o2)，生成的羟基自由基(
·
oh)会破坏肿瘤细胞的氧化还原平衡，从而诱导细胞死亡，实现肿瘤的催化治疗。然而，由于肿瘤中的h2o2浓度较低(0.1μm左右)，单一的催化治疗往往效果不佳。
3.因此，现有技术仍有待于改进和发展。


技术实现要素：

4.鉴于上述情况，本发明的目的在于提供一种双酶纳米诊疗剂及其制备方法与应用，旨在解决现有单一催化治疗效果不佳的问题。
5.葡萄糖氧化酶(gox)可以将葡萄糖分解为h2o2和葡萄糖酸，该过程为耗氧(o2)过程。二维钯钼(pdmo)纳米片具备过氧化氢酶活(cat)，可高效分解h2o2产生o2，同时在酸性条件下也具备pod酶活。将gox和pdmo结合(pmnsg)，可构建一种高效的双酶催化治疗平台。该双酶体系到达具有微酸性的肿瘤部位后，gox消耗肿瘤内的葡萄糖，实现饥饿治疗，并且提供h2o2作为pdmo的cat酶和pod酶催化底物。双酶互为补充协同催化，达到肿瘤饥饿治疗和催化治疗效果的最大化。此外，二维钯钼纳米片在近红光区域(1000-1350nm)具有优异光学吸收和光热性能，可用于光声成像指导治疗，在最佳治疗时间窗口，通过引入外部激光辐照治疗部位，可增强上述级联催化反应的效率，进一步提高肿瘤治疗效果。
6.综上，本发明以表面修饰三硫醇封端的聚甲基丙烯酸(ptmp-pmaa)的二维钯钼纳米片(pmns)负载gox，构建了一个级联双酶催化治疗体系(pmnsg)，可用于三维光声成像指导下的光热增强肿瘤催化治疗。
7.具体地，本发明的技术方案如下：
8.本发明的第一方面，提供一种双酶纳米诊疗剂，其中，包括：二维钯钼纳米片、结合于所述二维钯钼纳米片表面的三硫醇封端的聚甲基丙烯酸、与所述三硫醇封端的聚甲基丙烯酸结合的葡萄糖氧化酶。
9.可选地，所述三硫醇封端的聚甲基丙烯酸通过配位作用结合于所述二维钯钼纳米片表面，所述葡萄糖氧化酶通过共价作用与所述三硫醇封端的聚甲基丙烯酸结合。
10.可选地，所述二维钯钼纳米片平均直径为40～120nm。
11.可选地，所述二维钯钼纳米片与所述三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的质量比为0.05-0.1：1，所述二维钯钼纳米片与所述葡萄糖氧化酶的质量比为1-2：1。
12.本发明的第二方面，提供一种本发明所述的双酶纳米诊疗剂的制备方法，其中，包括步骤：
13.提供表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片；
14.将所述表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺酯混合，进行搅拌，加入葡萄糖氧化酶继续搅拌，得到所述双酶纳米诊疗剂。
15.可选地，所述表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片的制备方法，包括步骤：
16.提供二维钯钼纳米片；
17.将所述二维钯钼纳米片与三硫醇封端的聚甲基丙烯酸混合，进行搅拌，得到表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片。
18.可选地，所述二维钯钼纳米片的制备方法，包括步骤：将抗坏血酸、二乙酰丙酮钯和六羰基钼溶于油胺中，超声1h后置于80℃烘箱中12h，得到所述二维钯钼纳米片。
19.可选地，所述进行搅拌具体包括：在室温下以100-150rpm磁力搅拌；所述继续搅拌的时间为12h。
20.本发明的第三方面，提供一种本发明所述的双酶纳米诊疗剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。
21.有益效果：本发明所述双酶纳米诊疗剂，实现肿瘤的三维光声成像，同时具有光热增强的肿瘤催化治疗作用，该双酶纳米诊疗剂在肿瘤部位选择性催化和高效蓄积，可以大大降低葡萄糖氧化酶全身毒副作用并实现肿瘤饥饿治疗和催化治疗的协同放大作用。因此，该双酶纳米诊疗剂在肿瘤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。
附图说明
22.图1为实施例1中合成的二维钯钼纳米片的透射电镜照片、元素分布和近红外光学性能；
23.图2为实施例2中pmns和pmnsg的红外图谱和zeta电位；
24.图3为实施例3中808nm和1064nm激光照射下pmns光热性能；
25.图4为实施例4中评价体外类cat和类pod酶活及其光热增强；
26.图5为实施例5中评价体外pmnsg的类pod酶活和级联催化过程中ph的变化；
27.图6为实施例6中评价pmnsg对肿瘤细胞的杀伤效果；
28.图7为实施例7中评价尾静脉注射后肿瘤部位pmnsg和pmns含量变化；
29.图8为实施例8中评价pmnsg对肿瘤乏氧环境的改善效果；
30.图9为实施例9中评价pmnsg对肿瘤生长的抑制效果；
31.图10为实施例10中评价pmnsg的生物可降解性。
具体实施方式
32.本发明提供一种双酶纳米诊疗剂及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
33.本发明实施例提供一种双酶纳米诊疗剂，其中，包括：二维钯钼纳米片(pmns)、结合于所述二维钯钼纳米片表面的三硫醇封端的聚甲基丙烯酸(ptmp-pmaa)、与所述三硫醇
封端的聚甲基丙烯酸结合的葡萄糖氧化酶(gox)。
34.本实施例以表面修饰三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的pmns作为载体，应用该载体材料负载天然的葡萄糖氧化酶(gox)，形成所述双酶纳米诊疗剂(记为pmnsg)。pmns极高的比表面积和丰富的表面活性位点，通过酰胺化反应(ptmp-pmaa的羧基和gox表面的氨基反应)的共价作用可以高效装载葡萄糖氧化酶。葡萄糖氧化酶作为一种天然酶，可以高效地将葡萄糖分解成过氧化氢和葡萄糖酸。另外，pmns在近红外区域具有强吸收性能，可用于光热增强催化治疗和光声成像。pmns结合葡萄糖氧化酶后有效克服了单一催化或饥饿治疗的缺陷，并且降低了葡萄糖氧化酶的毒副作用，双酶协同催化治疗实现了对肿瘤的有效抑制。因此，pmnsg可以用于光声成像指导下的肿瘤的光热增强协同催化治疗。
35.本实施例利用pmns装载go
x
用于光热增强的肿瘤催化治疗，从而实现光声成像指导下的肿瘤双酶协同催化化疗。本实施例pmnsg具有以下几个优点：1.pmnsg双酶催化治疗有效克服了单一催化治疗的不足；2.显著降低了gox和pmnsg非特异性催化所带来的副作用；3.实现了三维光声成像监测的肿瘤催化治疗；4.pmnsg在较低激光功率(0.4w/cm2)下具有优异的光热性能，增强了体系级联催化的效率，实现了对肿瘤的完全抑制。
36.本实施例中，所述三硫醇封端的聚甲基丙烯酸通过配位作用结合于所述二维钯钼纳米片表面，所述葡萄糖氧化酶通过共价作用与所述三硫醇封端的聚甲基丙烯酸结合。
37.具体地，所述三硫醇封端的聚甲基丙烯酸通过其封端的巯基和贵金属钯的钯-硫键配位作用结合于所述二维钯钼纳米片表面，所述葡萄糖氧化酶通过其表面的氨基与所述三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的羧基经过酰胺化反应结合。
38.本实施例中，所述化葡萄糖氧化酶分子量约为150kda。
39.在一种实施方式中，所述pmns的平均直径约为40-120nm。在该粒径下具有良好的生物安全性以及在不同介质中优异的稳定性。
40.在一种实施方式中，所述pmns与所述葡萄糖氧化酶质量比为1-2：1，在该质量比下具有较高的装载效率。
41.在一种实施方式中，所述二维钯钼纳米片与所述三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的质量比为0.05-0.1：1，所述二维钯钼纳米片与所述葡萄糖氧化酶的质量比为1-2：1。
42.本发明实施例还提供一种所述双酶纳米诊疗剂的制备方法，其中，包括步骤：
43.s1、提供表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片；
44.s2、将所述表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)混合，进行搅拌，加入葡萄糖氧化酶继续搅拌，得到所述双酶纳米诊疗剂。
45.步骤s1中，在一种实施方式中，所述表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片的制备方法，包括步骤：
46.s11、提供二维钯钼纳米片(pmns)；
47.s12、将所述二维钯钼纳米片与三硫醇封端的聚甲基丙烯酸混合，进行搅拌，得到表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片。
48.步骤s11中，在一种实施方式中，所述pmns的制备方法包括步骤：将抗坏血酸、二乙酰丙酮钯和六羰基钼溶于油胺中，超声1h后置于80℃烘箱中12h，得到所述pmns。本实施例利用还原法制备得到所述pmns。
49.在一种实施方式中，步骤s12具体包括：将所述二维钯钼纳米片与三硫醇封端的聚甲基丙烯酸混合并超声30min，在室温下以100-150rpm磁力搅拌12h，得到表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片。
50.步骤s2中，将所述表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片利用nhs和edc活化后与葡萄糖氧化酶混合均匀并搅拌得到所述双酶纳米诊疗剂。
51.在一种实施方式中，步骤s2具体包括：将所述表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺酯混合，在室温下以100-150rpm磁力搅拌，加入葡萄糖氧化酶继续搅拌12h，得到所述双酶纳米诊疗剂。
52.在一种实施方式中，所述二维钯钼纳米片与所述三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的质量比为0.05-0.1：1，所述二维钯钼纳米片与所述葡萄糖氧化酶的质量比为1-2：1。
53.作为其中的一个具体实施方式，所述pmnsg的制备方法包括步骤：
54.a)制备二维钯钼纳米片：将抗坏血酸、二乙酰丙酮钯和六羰基钼溶于油胺中，超声1h后置于80℃烘箱中12h，得到所述二维钯钼纳米片；
55.b)纯化二维钯钼纳米片：将上述步骤a)制备的二维钯钼纳米片利用环己烷和乙醇的混合液体(环己烷和乙醇的体积比为5:1)多次离心洗涤，获得纯化的二维钯钼纳米片；
56.c)表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片：将上述步骤b)制备的二维钯钼纳米片与三硫醇封端的聚甲基丙烯酸以质量比为0.05-0.1：1混合，超声5-15min，放置在室温下以100-150rpm搅拌12h，获得表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片。
57.d)pmnsg的合成：将所述表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺酯混合，在室温下以100-150rpm磁力搅拌，加入葡萄糖氧化酶继续搅拌12h，得到所述双酶纳米诊疗剂。
58.本实施例双酶纳米诊疗剂的合成方法简单、操作方便，易于实现工业化生产，同时二维钯钼纳米片和葡萄糖氧化酶具有极好的生物相容性和生物可降解性，因此在肿瘤的诊断与治疗领域具有良好的应用前景。
59.本发明实施例还提供一种所述的双酶纳米诊疗剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。本实施例的双酶纳米诊疗剂可实现肿瘤的光声成像和光热成像，同时具有光热增强的肿瘤催化治疗，该双酶纳米诊疗剂在肿瘤部位的高效蓄积和特异性催化，大大降低了葡萄糖氧化酶的全身毒副作用。因此在肿瘤的诊断与治疗领域将具有良好的应用前景。本实施例所述双酶纳米诊疗剂在治疗肿瘤的同时还作为多模态造影剂来进行光声成像和核磁共振成像。
60.下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述。
61.实施例1：pmns的制备。
62.分别称取30mg乙酰丙酮钯、12mg六羰基钼和90mg抗环血酸共同溶解于15ml油胺中，在室温下水浴超声1h直至形成均匀混合液，将该均匀混合液置于80℃烘箱中反应12h，反应结束冷却至室温，得到二维钯钼纳米片。
63.制备的二维钯钼纳米片对应的tem图和元素分布图分别如图1中a和b所示。将制备的二维钯纳米片配制成不同浓度的水溶液，然后通过紫外-可见-近红外光谱仪表征其光学
性能，其光学性能如图1中c和d所示，从结果可知制备的二维钯钼纳米片具有优异的近红外光学性能。
64.实施例2：pmnsg的制备。
65.将20mg二维钯钼纳米片分散于15ml乙醇中，然后加入200mg的三硫醇封端的聚甲基丙烯酸，超声30min，并在室温下以120rpm磁力搅拌12h，得到表面结合三硫醇封端的聚甲基丙烯酸的二维钯钼纳米片，离心水洗分离后溶于水中，利用edc和nhs活化后加入40mg gox，在室温下搅拌12h，得到pmnsg，离心水洗，分离。分别测量pmns和pmnsg的傅立叶变换红外光谱及zeta电位，结果如图2所示。
66.图2中a为pmns和pmnsg的红外光谱，图2中b为pmns和pmnsg的zeta电位的变化。该结果表明了gox的成功修饰。
67.实施例3：评价1064nm和808nm激光照射下pmns的光热性能。
68.1064nm激光照射下pmns的光热性能：将制备好的250μl不同浓度(0，5，10，20，40和80μg/ml)的pmns水溶液分别加入到离心管中，置于0.4w/cm2的1064nm激光照射下5min。固定pmns水溶液浓度为20μg/ml，体积为250μl，置于不同功率(0.2，0.4，0.5，0.6，0.8w/cm2)1064nm激光照射下5min。利用红外热成像仪监测并记录上述pmns水溶液的温度。
69.808nm激光照射下pmns的光热性能：将制备好的250μl不同浓度(0，5，10，20，40和80μg/ml)的pmns水溶液分别加入到离心管中，置于0.6w/cm2的808nm激光照射下5min。固定pmns水溶液浓度为20μg/ml，体积为250μl，置于不同功率(0.2，0.4，0.5，0.6，0.8w/cm2)808nm激光照射下5min。利用红外热成像仪监测并记录上述pmns水溶液的温度。
70.图3中a为不同浓度的pmns水溶液在1064nm激光(0.4w/cm2)照射下，5min内的升温曲线，可以看到，在较低的浓度下(20μg/ml)，溶液温度即可达到52℃左右，表明在1064nm激光照射下pmns具有良好的光热性能。同时图3中b为20μg/ml的pmns水溶液在不同功率的1064nm激光照射下的升温曲线，可以看到在较低功率(0.2w/cm2)激光照射下，pmns水溶液的温度也能够升到40℃以上。同样地，图3中c和d表明pmns在808nm激光照射下也具备优异的光热性能。
71.实施例4：评价pmns的类cat和类pod酶活及其光热增强。
72.pmns的cat酶活通过室温下测量h2o2溶液中的溶氧量和其在240nm处的紫外吸收来表征。将200μl的pmns水溶液(20μg/ml)加到3ml pbs(ph＝7.4)中，同时加入200μl 30％的h2o2溶液。用1064nm(0.4w/cm2)激光连续照射混合液以实现光热增强的cat酶活。利用多参数分析仪的特殊氧电极每15s测量一次混合液中的o2的浓度，并在不同时间间隔利用紫外-可见-红外光谱仪测定溶液的吸收值，实验结果见图4中a和b。利用tmb作为底物来评估pmns的pod酶活，将1μl tmb(溶于dmso，10mg/ml)和10μl pmns水溶液(16μg/ml)加入到2ml醋酸缓冲液(0.1m，ph＝4.5)中，然后加入10μl 30％的h2o2溶液，在37℃下测定底物tmb在652nm处的吸收变化。通过引入1064nm(0.4w/cm2，3min)激光连续照射混合液以研究pmns光热增强的pod酶活。作为对照组，在pbs(0.1m，ph＝7.4)中评估pmns的类pod酶活，如图4中c和d所示。
73.如图4中a，pmns可以高效的催化分解h2o2并产生大量o2，并且当用0.4w/cm2的低功率1064nm激光照射时，可以显著提高其催化效率(提升1.6倍)。相反，对照组的变化几乎可忽略不计，这说明pmns具有高效的且可光热增强的类cat酶活。同时图4中b也表明，pmns存
在条件下，h2o2被显著消耗，并可通过光热增加其消耗速率。图4中c的tmb的实时吸收变化曲线表明，pmns的类pod酶活可以有效产生羟基自由基氧化tmb，从而使溶液吸收显著增强，并可通过1064nm激光照射进一步增强(图4中d)。
74.实施例5：评价pmns的类pod酶活和级联催化过程中ph的变化。
75.为了表征pmns的类pod酶活及光热增强，将10μl tmb(溶于dmso，10mg/ml)和10μl pmns水溶液(16μg/ml)加入到2ml醋酸缓冲液(0.1m，ph＝4.5)中，反应体系的附加变量为：有/没有h2o2溶液(10μl，浓度为30％)、常氧/乏氧(通氮气饱和)，有/没有1064nm激光(0.4w/cm2)，测量各体系在625nm处的紫外吸收值，如图5中a所示。对于级联催化过程中的ph值的变化，分别将体积均为100μl的h2o，pmns(1mg/ml)，gox(2μg/ml)，pmnsg(1mg/ml)溶液加入2ml葡萄糖溶液中(2mg/ml水溶液,ph＝6.8)，上述反应体系的附加变量为：加/不加h2o2溶液(10μl，浓度为30％)、常氧/乏氧(溶液用氮气预饱和)和有/没有1064nm激光(0.4w/cm2)，用ph计记录各溶液不同时间的ph值，如图5中b所示。
76.常氧条件下，pmnsg可分解葡萄糖生成h2o2并进一步将h2o2转化为羟基自由基，由此tmb被氧化，吸收增强。而额外加入的h2o2又作为pmnsg的cat催化底物，促进pmnsg分解葡萄糖，推动循环过程建立，上述催化过程通过引入光热得到增强(图5中a)。而在乏氧条件下，由于pmnsg分解葡萄糖的作用被极大抑制，缺乏h2o2的持续供应，整体上tmb氧化效率显著降低，但额外添加h2o2后，该循环催化反应得到启动。由于pmnsg可在有氧条件下将葡萄糖分解为葡萄糖酸，从而降低溶液ph。在有氧条件下，pmnsg组溶液ph显著降低，而在乏氧条件下，上述过程被明显抑制。当额外加入h2o2后，pmnsg的可分解h2o2提供氧气开启葡萄糖的分解过程，而葡萄糖分解又可提供新的h2o2，从而建立起循环催化过程，使得葡萄糖不断分解，ph不断降低(图5中b)。
77.实施例6：评价pmnsg对肿瘤细胞的杀伤效果。
78.本实验采用标准的mtt法分别检测在常氧和乏氧(n2:co2:o2＝94:5:1体积比)条件下pmnsg对细胞存活率的影响。将4t1细胞以1
×
104个细胞/孔的初始密度种植在96孔板中，在37℃，5％co2湿润环境下培养24h。随后，用含有不同浓度的pmns或pmnsg的新鲜培养基替换原培养基，并在常氧或乏氧条件下(体积比n2：co2：o2＝94：5：1)继续孵育4h，用新鲜培养基替换旧培养基，然后用1064nm激光照射(0.4w/cm2)孔板5min。其他组(对照组、游离gox、pmns、pmns+激光和pmnsg)按相同的方法进行处理。最后，用标准mtt法测定细胞相对活力，结果如图6中a和b所示。
79.如图6中a，常氧条件下，用低浓度(20μg/ml)pmnsg处理后，4t1细胞的细胞相对活力出现了显著降低(约78.0％活性抑制)，相比之下，pmns组仅有约19.3％的细胞凋亡，并且加入激光可提高肿瘤细胞杀伤效果(约93.0％)。此时，游离gox(20ng/ml)对细胞活力也表现出了一定的抑制作用(约37.7％)。当处在乏氧环境中，低浓度pmnsg对肿瘤细胞仍具有显著的抑制作用(图6中c)，而此时gox对细胞活力的影响几乎可忽略不计(图6中d)综上表明，pmnsg级联催化体系可有效克服乏氧环境并杀伤肿瘤细胞。
80.实施例7：评价尾静脉注射后肿瘤部位pmnsg和pmns含量变化。
81.得益于二维钯钼纳米片优异的近红外光学性能，使得pmns和pmnsg具有优异的光声成像性能(图7中a和b)。然后构建小鼠的乳腺癌模型：购买雌性无胸腺裸鼠(六周，20-25g)，通过将100μl的4t1细胞pbs溶液皮下注射到小鼠的右后肢中来构建皮下瘤模型(1
×
106个细胞/只)。当肿瘤体积达到80mm3，将小鼠分为两组：(1)pmns组；(2)pmnsg组，两组老鼠通过尾静脉分别注射100μl 20mg/ml pmns溶液和pmnsg溶液，利用小动物光声成像系统(visualsonics vevo lazr system)检测肿瘤部位pmns和pmnsg的光声信号。
82.如图7中c和d相应的定量值所示，注射pmns和pmnsg组的肿瘤部位光声信号在4h后到了最大值，随后，两组的光声信号均逐渐降低，可能是由于pmnsg或pmns从肿瘤中代谢清除所致。
83.实施例8：评价pmnsg对肿瘤乏氧环境的改善效果。
84.构建小鼠的乳腺癌模型。购买雌性无胸腺裸鼠(六周，20-25g)，通过将100μl的4t1细胞pbs溶液皮下注射到小鼠的右后肢中来构建皮下瘤模型(1
×
106个细胞/只)。当肿瘤体积达到80mm3，将小鼠分为四组：(1)pbs组；(2)gox组；(3)pmns组；(4)pmnsg组。尾静脉注射药物后，利用vevo lazr-x系统的多波段成像模式，对各组小鼠肿瘤部位的血氧饱和度(so2)进行监测，结果如图8中a和b所示。
85.图8中a表明，pmns和pmnsg处理后的肿瘤部位的血氧饱和度明显提高，在4h点达到最大值，并且pmnsg组的峰值(39.7％)略低于pmns的峰值(46.8％)，这可能由于gox的耗氧作用，图8中b为各组相应的定量值。上述结果证明了pmnsg可以有效改善肿瘤的乏氧状态。
86.实施例9：评价pmnsg对肿瘤生长的抑制效果。
87.构建小鼠的乳腺癌模型。购买雌性无胸腺裸鼠(六周，20-25g)，通过将100μl的4t1细胞pbs溶液皮下注射到小鼠的右后肢中来构建皮下瘤模型(1
×
106个细胞/只)。当肿瘤体积达到60mm3，将小鼠分为七组：(1)pbs组；(2)gox组；(3)pmns组；(4)pmns+laser组；(5)pmnsg组；(6)pmnsg+laser组。通过尾静脉分别注射gox，pmn和pmnsg的pbs溶液(pmns和pmnsg的剂量均为10mg/kg，gox的剂量为0.2mg/kg)。为了比较，将pbs(100μl)注射到小鼠体内作为对照组。给药处理4h后，在全身麻醉下，将(d)，(e)和(g)组肿瘤部位用0.4w/cm2功率密度的nir-ii激光照射肿瘤部位10min，每两天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，肿瘤计算体积为v＝ab2/2，并用数码天平称量小鼠体重，结果如图9。
88.图9中a表示不同治疗组肿瘤体积随时间的变化情况，可以看到，pmnsg+laser组肿瘤被完全抑制，相比于对照组，pmnsg组也表现出了显著的抑制效果，表明pmnsg具有优秀的级联催化治疗作用，并可通过施加外部激光进一步增强其治疗效果。在治疗的两周，各组小鼠额体重均没有出现明显的变化(图9中b)，表明pmnsg具有优异的生物安全性。
89.实施例10：评价pmnsg的生物可降解性。
90.将pmnsg溶于模拟体液sbf中，每隔一天从该溶液中取样拍摄透射电镜，结果如图10。
91.由图10可以看到，随着时间的延长，pmnsg片的横向尺寸逐渐减小，分布密度降低，出现了明显的降解行为。这表明，pmnsg具备优良的生物可降解性。
92.综上所述，本发明所述的双酶纳米诊疗剂实现了光热增强的肿瘤级联催化治疗。通过本发明所述制备方法获得的双酶纳米诊疗剂可实现肿瘤的三维光声成像，同时具有光热效应和级联催化治疗作用，该双酶纳米诊疗剂在肿瘤部位高效蓄积，有效改善肿瘤的乏氧状态，大大降低了gox的毒副作用。本发明合成方法简单、操作方便，易于实现工业化生产，同时本双酶纳米诊疗剂也具备良好的生物相容性，因此在肿瘤的诊断与治疗领域具有极大的应用前景。
93.应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。